陸 英， 虞珊珊， 馬 鉆， 白寶鑫， 王光學(xué)， 徐增光

(同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心，上海 200120)

肺癌是高死亡率的惡性腫瘤，分為非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)和小細(xì)胞肺癌(small cell lung cancer, SCLC)兩大類，其中NSCLC占80%～85%[1]。目前，傳統(tǒng)的治療手段(手術(shù)及放化療)在提高NSCLC的5年生存率方面遇到了瓶頸，而隨著近年轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)的研究推進(jìn)，一些靶向藥物開始應(yīng)用于臨床[2]。如靶向表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)、Kirsten鼠肉瘤原癌基因同源體(kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog， KRAS)、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)等[3-4]能延長晚期NSCLC患者的無進(jìn)展生存期，但最終會(huì)出現(xiàn)耐藥，因此迫切需要尋找新的分子靶標(biāo)[5]。最近研究發(fā)現(xiàn)，真核翻譯起始因子4G1(eukaryotic translation initiation factor 4 gamma 1， EIF4G1)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。EIF4G1是轉(zhuǎn)錄起始因子復(fù)合物EIF4F的組成蛋白之一[6]，該復(fù)合物最重要的功能是將mRNA募集到核糖體上，從而啟動(dòng)蛋白質(zhì)合成。在蛋白質(zhì)翻譯過程中，EIF4G1作為支架蛋白,使其他與翻譯起始有關(guān)的因子與之結(jié)合并發(fā)揮各自的作用[7]。已有報(bào)道顯示，EIF4G1基因在卵巢癌、鼻咽癌、乳腺癌中表達(dá)明顯增高，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞蛋白翻譯、腫瘤血管生成、細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化和抗凋亡[8-11]。EIF4G1位于染色體3q27上，在50%的肺癌中檢測(cè)到該區(qū)域有非正常的擴(kuò)增[12]。本研究通過檢測(cè)NSCLC組織中EIF4G1 mRNA和蛋白表達(dá)水平，分析其與NSCLC疾病發(fā)生及臨床病理特征的關(guān)系，為NSCLC的診斷及靶向治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取2015年10月至2017年12月在同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院行手術(shù)切除治療的NSCLC患者81例，其中男性49例，女性32例，取其癌組織和癌旁組織進(jìn)行實(shí)驗(yàn)?；颊吣挲g43～79歲，中位年齡63歲；病理類型： 鱗癌25例，腺癌46例，其他類型10例(包括大細(xì)胞癌3例、腺鱗癌3例、肉瘤樣癌1例、類癌2例和未分類癌1例)。采用1997年國際抗癌聯(lián)盟(UICC)規(guī)定的肺腫瘤TMN分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期。分化程度： 高分化9例，中分化30例，低分化42例。納入標(biāo)準(zhǔn)： (1) NSCLC標(biāo)本來源于本院心胸外科手術(shù)后標(biāo)本并經(jīng)病理學(xué)證實(shí);(2) 術(shù)前均未接受放療或化療;(3) 各項(xiàng)臨床資料完整；(4) 項(xiàng)目獲同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者按倫理要求已簽署知情同意書。

1.2 標(biāo)本采集

每位患者取手術(shù)切除的新鮮肺癌組織及癌旁組織0.1～0.2g各2份，1份立即置于200μL RNAlater?Solution(美國Ambion公司)溶液中，4℃冰箱過夜后，置于-80℃冰箱保存，用于RNA提取。另1份置于10%的中性甲醛中，4℃保存，用于免疫組化染色。

1.3 NSCLC癌和癌旁組織總RNA提取

將組織樣本從-80℃冰箱取出，吸干RNAlater?Solution后，加入500μL TRIzol試劑，用高速乳化分散機(jī)將組織塊充分勻漿后，按照5∶1比例加入氯仿(TRIzol 500μL∶氯仿100μL)，于漩渦振蕩器劇烈震蕩，顛倒混勻，置于冰上靜置10min。4℃ 12000r/min，離心半徑5cm，離心15min，吸取上層水相溶液，加入等體積異丙醇，于冰上靜置10min，4℃ 12000r/min離心10min。棄上清液，加入1mL預(yù)冷的75%乙醇，4℃ 12000r/min，離心5min。棄上清液，室溫放置3～5min，待乙醇完全揮發(fā)后，加入20～60μL預(yù)冷的不含DNA酶/RNA酶的雙蒸水(DEPC-ddH2O)，溶解RNA。

1.4 NSCLC癌和癌旁組織RNA純度和濃度測(cè)定

使用預(yù)混了GelRed的1%瓊脂糖凝膠，加1×TAE電泳緩沖液至液面覆蓋凝膠。在超凈工作臺(tái)上，用移液器吸取總RNA樣品4μL于封口膜上，再加入5μL 1×TAE電泳緩沖液及1μL的10×載樣緩沖液，混勻后，加入點(diǎn)樣孔。將電壓調(diào)節(jié)至100V，電泳30min后，在紫外透射檢測(cè)儀上觀察RNA電泳結(jié)果。使用ADU 600紫外分光光度儀測(cè)定260、280nm吸光度值(A260、A280)，采用A260/A280>1.8的RNA純度較好的標(biāo)本。

1.5 cDNA的合成

采用日本TaKaRa公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒，總RNA 0.5μg，5×PrimeScript緩沖液2μL，反轉(zhuǎn)錄酶復(fù)合物(PrimeScript RT Enzyme Mix)0.5μL，Oligo dT Primer(50μmol/L)0.5μL, Random 6 mers(100μmol/L)0.5μL，總體積為10μL。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，37℃，15min。反轉(zhuǎn)錄酶失活反應(yīng)，85℃，5s。將得到的反轉(zhuǎn)錄(RT)反應(yīng)液加入到下一步的實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(real-time PCR)體系中。

1.6 real-time PCR反應(yīng)檢測(cè)EIF4G1 mRNA表達(dá)水平

采用日本TaKaRa公司real-time PCR試劑盒，美國ABI公司7500 real Time PCR儀。2×SYBR Primix Ex Taq 10μL，PCR Primer(10μmol/L)0.4μL，50×ROX Reference Dye Ⅱ 0.4μL，DNA模板2.0μL，總反應(yīng)體積20μL。反應(yīng)條件為： 95℃預(yù)變性30s，接著進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，95℃變性5s，60℃退火延伸34s。引物序列： 以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參照，正向引物5′-GTGTCCAGCCT-GAATTCCACT-3′，反向引物： 5′-CACCCTGTTGC-TGTAGCCAAA-3′。EIF4G1正向引物： 5′-TTGTG-GATGATGGTGGCT-3′，反向引物： 5′-TTATCTGT-GCTTTCTGTGGGT-3′。采用比較CT值的相對(duì)定量法(ΔΔCt法)來比較mRNA表達(dá)的差異： ΔCt=Ct(EIF4G1)-Ct(GAPDH)表示目的基因(EIF4G1)表達(dá)的相對(duì)拷貝數(shù)，ΔCt值越低，實(shí)際拷貝數(shù)越高。ΔΔCt=ΔCt癌組織-ΔCt癌旁組織，以N=2-ΔΔCt表示癌組織EIF4G1的表達(dá)相對(duì)于癌旁組織的變化倍數(shù)。

1.7 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)EIF4G1蛋白表達(dá)

手術(shù)切除的肺癌組織及癌旁組織經(jīng)10%的中性甲醛中固定，石蠟包埋，然后切成5μm厚切片。將切片置于抗原修復(fù)溶液中(丹麥Dako公司)，95℃加熱20min。加入小鼠抗人單克隆抗體EIF4G1(1∶200，英國Abcam公司)，4℃孵育過夜。IgG抗體作為陰性對(duì)照。辣根過氧化物酶結(jié)合的山羊抗鼠二抗(丹麥Dako公司試劑盒)在室溫下孵育30min。最后，用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)底物試劑盒顯色、中性樹膠封片后，光學(xué)顯微鏡鏡檢。

1.8 EIF4G1蛋白表達(dá)的半定量評(píng)分

組織細(xì)胞的胞質(zhì)或胞膜呈清晰棕黃色顆粒的瘤細(xì)胞定為陽性細(xì)胞，每張切片選擇3個(gè)區(qū)分別在400倍視野下連續(xù)計(jì)數(shù)200個(gè)瘤細(xì)胞，半定量分析0～4計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)： 0分=無陽性細(xì)胞，1分=陽性細(xì)胞占比≤25%，2分=陽性細(xì)胞占比25%～≤50%，3分=陽性細(xì)胞占比50%～≤75%，4分=陽性細(xì)胞占比75%～100%。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 EIF4G1 mRNA在NSCLC癌和癌旁組織中的表達(dá)特點(diǎn)

NSCLC癌組織中ΔCt值(6.91±1.87)明顯低于癌旁組織的ΔCt值(8.33±1.69)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.01，P<0.001)。鱗癌、腺癌和其他類型肺癌組織的ΔCt的值分別為7.40±1.69、6.70±1.92和6.22±2.18，均明顯低于其相應(yīng)癌旁組織的8.26±1.58、8.35±1.75和8.86±2.52(t=-2.82，-6.58、-4.19，均P<0.05)，見表1。

表1 EIF4G1 mRNA在NSCLC癌組織和癌旁 組織中的表達(dá)差異

2.2 EIF4G1 mRNA表達(dá)強(qiáng)度與NSCLC臨床病理特征的關(guān)系

EIF4G1 mRNA在低分化癌中的表達(dá)強(qiáng)度明顯高于中分化癌和高分化癌(F=14.034，P<0.001)，而其在中分化癌和高分化癌中表達(dá)的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；EIF4G1 mRNA在臨床分期Ⅳ期的表達(dá)強(qiáng)度明顯高于Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期(F=11.84，P<0.001)，而其在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ之間的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。年齡、性別及病理組織分型間EIF4G1 mRNA的表達(dá)強(qiáng)度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，見表2。

進(jìn)一步將EIF4G1 mRNA在癌組織和癌旁組織中的表達(dá)升高倍數(shù)2-ΔΔCt值≥2作為EIF4G1 mRNA在癌組織中高表達(dá)，進(jìn)行Logistic回歸分析，結(jié)果顯示： 癌組織的分化程度與EIF4G1的高表達(dá)密切相關(guān)(OR=23.74，P<0.001)。而年齡、性別、組織類型和臨床分期與EIF4G1的高表達(dá)無明顯相關(guān)性(均P>0.05)，見表3。

2.3 NSCLC組織中EIF4G1蛋白水平與NSCLC細(xì)胞分化程度的關(guān)系

免疫組化法結(jié)果顯示EIF4G1在NSCLC癌細(xì)胞胞質(zhì)中呈特異性高表達(dá)(圖1)，通過對(duì)NSCLC癌組織中EIF4G1含量進(jìn)行半定量評(píng)分發(fā)現(xiàn)： EIF4G1在低分化的鱗癌和腺癌中的表達(dá)強(qiáng)度分別為3.2±0.5和2.9±0.4，明顯高于在中分化(2.1±0.3，t=8.20;2.3±0.4,t=3.35，均P<0.05)和高分化癌中的表達(dá)(1.2±0.2,t=22.36;1.3±0.2,t=17.89，均P<0.05)。

表2 EIF4G1 mRNA在NSCLC癌組織中的表達(dá)強(qiáng)度與 患者臨床病理特征的關(guān)系

*表示高分化、中分化分別與低分化癌比較；**表示Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期分別與Ⅳ期比較；ref表示對(duì)照組

表3 影響EIF4G1 mRNA在NSCLC癌組織中高表達(dá)的Logistic回歸分析

3 討 論

肺癌是最常見的癌癥之一，也是在世界范圍內(nèi)死亡率最高的癌。NSCLC治療難、轉(zhuǎn)移快，大部分患者確診時(shí)已發(fā)生癌轉(zhuǎn)移或處于癌晚期。傳統(tǒng)的化療方案雖能夠一定程度上改善患者的生存率和死亡率，但總體效果不佳，全身毒副作用大，容易產(chǎn)生耐藥，不適合長期運(yùn)用。目前，治療NSCLC的方案有走向靶向治療的趨勢(shì)，針對(duì)一些腫瘤靶點(diǎn)的藥物，已進(jìn)入臨床使用。以EGFR突變型NSCLC為例，EGFR-TKI治療目前已主要用于NSCLC一線、二線和維持治療中，相比于傳統(tǒng)化療，使用特異性的靶向治療，患者可以獲得更長的生存期，且副作用較小[13-14]。但是這種針對(duì)EGFR突變使用酪氨酸激酶抑制劑吉非替尼、厄洛替尼等治療的方法僅對(duì)EGFR突變型的NSCLC患者有效[15-16]，因此需要尋找新的、特異性的腫瘤標(biāo)志物作為治療NSCLC的靶點(diǎn)。

圖1 EIF4G1在不同分化程度的NSCLC癌組織中的表達(dá)Fig.1 The expression of EIF4G1 at the protein level in NSCLC cancer tissues with different differentiation

腫瘤的形成和發(fā)生發(fā)展過程是一個(gè)復(fù)雜的多方聯(lián)合、多因子參與的連續(xù)過程，期間涉及一些關(guān)鍵的癌基因和抑癌因子的作用。EIF4G1除了促進(jìn)蛋白翻譯，在真核細(xì)胞翻譯起始階段發(fā)揮重要作用外，也與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。目前已經(jīng)研究證實(shí)EIF4G1作為潛在的分子靶點(diǎn)，有望成為部分腫瘤的預(yù)后指標(biāo)，對(duì)腫瘤的診斷、治療和預(yù)后監(jiān)控等具有重要意義。如在鼻咽癌中的研究發(fā)現(xiàn)，EIF4G1蛋白的表達(dá)水平與腫瘤分級(jí)、臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，并且是影響鼻咽癌患者總生存率的危險(xiǎn)因素[9]。在乳腺癌研究中發(fā)現(xiàn)，EIF4G1在晚期患者癌組織中的表達(dá)明顯高于早期，EIF4G1表達(dá)增高與增強(qiáng)癌細(xì)胞DNA損傷修復(fù)、防止細(xì)胞自噬和凋亡密切相關(guān)[10]。然而EIF4G1在NSCLC患者中的表達(dá)規(guī)律暫未見報(bào)道。因此本研究通過real-time PCR和免疫組化技術(shù)在81例NSCLC患者中發(fā)現(xiàn)，EIF4G1 mRNA和蛋白水平在癌組織中的表達(dá)明顯升高，且EIF4G1的表達(dá)強(qiáng)度與腫瘤細(xì)胞的分化程度密切相關(guān)，分化越差，EIF4G1的表達(dá)越高。晚期NSCLC患者EIF4G1的表達(dá)強(qiáng)度明顯高于早期。而EIF4G1的表達(dá)強(qiáng)度在腫瘤病理類型、年齡和性別之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。綜合上述研究，提示EIF4G1是一個(gè)與NSCLC腫瘤生長密切相關(guān)的分子。本研究結(jié)果填補(bǔ)了EIF4G1在NSCLC中的研究空白，其結(jié)果符合EIF4G1在部分其他腫瘤中的表達(dá)特征，豐富了EIF4G1與腫瘤關(guān)系的臨床病理研究。

本研究中應(yīng)用Logistic回歸模型分析EIF4G1 mRNA在NSCLC癌組織中高表達(dá)的影響因素，發(fā)現(xiàn)EIF4G1 mRNA的高表達(dá)與癌組織的分化程度密切相關(guān)，其局限性在于： (1) 本研究只收集到81例NSCLC腫瘤樣本，標(biāo)本量較小，但是EIF4G1 mRNA高表達(dá)與癌組織分化程度之間具有相關(guān)性的初步研究結(jié)果還是具有一定的臨床意義；(2) 本研究為對(duì)照研究，Logistic回歸模型分析提示EIF4G1 mRNA高表達(dá)與癌組織分化程度具有相關(guān)性，但是無法確定兩者之間的因果關(guān)系。為進(jìn)一步明確EIF4G1 mRNA高表達(dá)的影響因素，尚有待于大規(guī)模、前瞻性的研究加以證實(shí)。

有研究者通過串聯(lián)親和純化及質(zhì)譜分析(TAP-MS)發(fā)現(xiàn)EIF4G1與定位于細(xì)胞質(zhì)的去泛素化酶USP10為互作蛋白，而USP10已證實(shí)能特異的去泛素化并穩(wěn)定p53，從而調(diào)節(jié)p53依賴的下游功能。在DNA損傷應(yīng)激條件下，USP10 42位蘇氨酸及337位絲氨酸被ATM激酶磷酸化，磷酸化修飾能穩(wěn)定USP10并促使USP10入核并去泛素化p53，從而調(diào)節(jié)p53下游網(wǎng)絡(luò)功能[17]。迄今為止，p53是人類所發(fā)現(xiàn)最重要的抑癌因子之一。作為轉(zhuǎn)錄因子，p53通過調(diào)控下游靶基因調(diào)節(jié)多種細(xì)胞學(xué)反應(yīng)。例如，p53通過作用于CDK抑制因子p21調(diào)節(jié)細(xì)胞周期G1阻滯，通過作用于凋亡先導(dǎo)因子PUMA和Bax調(diào)控細(xì)胞凋亡，通過作用于糖酵解調(diào)節(jié)因子TIGAR調(diào)控能量代謝，通過作用于AMPK調(diào)控細(xì)胞自噬作用[18-20]。除了轉(zhuǎn)錄因子依賴的功能以外，p53還能通過蛋白質(zhì)相互作用的方式調(diào)控細(xì)胞凋亡。通過作用于野生型p53，USP10能行使抑癌因子的功能。而本研究組前期應(yīng)用免疫共沉淀方法發(fā)現(xiàn)，EIF4G1在肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549中可與USP10相互結(jié)合。關(guān)于靶分子EIF4G1是否能通過與USP10結(jié)合，抑制USP10穩(wěn)定P53的功能，從而抑制P53調(diào)控的抑癌作用，最終在癌細(xì)胞中發(fā)揮促癌作用，其確切的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步的深入研究。

綜上所述，EIF4G1在NSCLC癌組織中特異性高表達(dá)，并與腫瘤細(xì)胞的分化程度及臨床分期密切相關(guān)，說明EIF4G1與NSCLC腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移相關(guān)。在后續(xù)研究中將深入探討EIF4G1參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，為NSCLC疾病的診斷及治療提供新的分子靶點(diǎn)。