李 俐鄭旭仙曾雅芬余曉雯吳明霞*

（1 福建中醫(yī)藥大學附屬第二人民醫(yī)院針灸科，福建 福州 350003；2 福建中醫(yī)藥大學針灸學院，福建 福州 350122）

隨著經(jīng)濟、醫(yī)療水平的提高，人類的平均壽命不斷增加，骨質(zhì)疏松在老年群體中普遍存在。絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥 (PostmenoPausal osteoPorosis，PMOP)又稱 Ⅰ 型骨質(zhì)疏松癥，是指由于絕經(jīng)后婦女卵巢生理功能以及雌激素水平的下降，使得骨代謝過程失衡，骨吸收大于骨形成而導致的骨量低下、骨組織顯微結(jié)構(gòu)破壞、骨強度降低、骨脆性增加。臨床主要以疼痛、關(guān)節(jié)變形甚則骨折為主要表現(xiàn)的一種全身性骨疾?。?］。因其有較高的致殘率，嚴重威脅到患者的生命健康及生活質(zhì)量。中醫(yī)學認為，骨的生長、發(fā)育主要受腎精盛衰影響，而婦女絕經(jīng)后腎精虧虛故易發(fā)“骨痿”“骨痹”“骨枯”等病癥。目前臨床上主要是運用藥物療法，但藥物治療所產(chǎn)生的副作用較多，部分患者不能耐受或者不能接受。本實驗通過觀察針刺干預(yù)對絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥大鼠脛骨骨密度、腰椎 c-myc、Cyclin D1和 Runx2 mRNA表達的影響，探討針刺防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 7周齡SPF級雌性SD大鼠50只，動物許可證號（SCXK（滬）2012-0002），由福建中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供（許可證號：SYXK（閩）2009-0001）。喂養(yǎng) 1月后，按隨機數(shù)字表法分為造模組 30只，假手術(shù)組10只和空白組10只。

1.2 主要試劑、材料及儀器 試劑及材料：cDNA一鏈合成試劑盒逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Vazyme公司）、PCR Mix PCR聚合酶（Vazyme公司）、Trizol RNA提取試劑盒（Vazyme公司)、瓊脂糖-凝膠電泳用（英國OXOID公司）、水合氯醛（福建中醫(yī)藥大學附屬第二人民醫(yī)院提供）。儀器：雙能X射線骨密度儀（美國 HOLOGIC DISCOVERY CI型）、洗板機 (Wellwash 4 MK2，Thermo芬蘭)、基因擴增儀（美國 Applied Biosystems 9700 PCR System）、酶標儀（DENLEY DRAGON Wellscan MK 3，Thermo，芬蘭，分析軟件：Ascent software for Multiskan）、水浴鍋（上海精宏）、華佗牌一次性使用無菌針灸針（0.25 mm×13 mm，蘇食藥器械生產(chǎn)許2001-0020號）。

1.3 研究方法

1.3.1 模型制作 參照文獻［2］方法造模：將 30只大鼠用10%的水合氯醛 (3 mL/kg體質(zhì)量)腹腔注射麻醉。腹位固定，沿腹部腹正中線 (腹白線)劍突下2 cm處備皮，以安爾碘消毒，依次切開皮膚、肌肉、腹膜，用鑷子輕輕將乳白色組織提出腹腔，即可見被包裹的卵巢，分離后鉗夾、結(jié)扎輸卵管，摘除卵巢。腹腔給予青霉素生理鹽水 (2萬U/mL)抗炎，分層縫合皮膚，蓋軟毛巾保溫待麻醉蘇醒。術(shù)后連續(xù)做1周陰道圖片，檢測卵巢是否切除干凈。假手術(shù)組10只造模切除卵巢附近的與卵巢大小相近的脂肪組織代替雙側(cè)卵巢。大鼠術(shù)后均予腹腔注射青霉素生理鹽水 (2萬U/mL)抗炎，每日注射0.5 mL，連續(xù)3日。

術(shù)后造模組死亡2只，死亡原因考慮麻醉藥過敏或麻醉時間過長引起體溫過低死亡。術(shù)后假手術(shù)組死亡2只大鼠，死亡原因考慮同上述。將造模組同上述隨機分組方法分為模型組9只，腎俞足三里組10只，非經(jīng)非穴組9只。造模后飼養(yǎng)90 d。

1.3.2 治療方法 腎俞足三里組：取腎俞和足三里穴，定位參照《實驗針灸學》［3］。穴位常規(guī)消毒后，用 0.5寸毫針進行針刺，行提插捻轉(zhuǎn)補法，留針 30 min，每隔10 min行針1次，每日1次，10次1療程，療程間期5 d，共治療6個療程，持續(xù)90 d。

非經(jīng)非穴組：取非經(jīng)非穴進行針刺，定位參照《實驗針灸學》［3］。針刺操作同穴位組，余同穴位組。模型組、假手術(shù)組、空白組除套頭、抓取操作外，不給予任何處理。

操作由福建中醫(yī)藥大學兩名針灸推拿學研究生配合進行，保證各組接受2名操作者治療的大鼠只數(shù)相同，期間，各組動物均正常飲食，自由飲水。

1.3.3 標本采集 治療結(jié)束后，處死大鼠，完整摘取右脛骨，剝離骨周圍軟組織，生理鹽水紗布包裹，放入 PE密封袋，用于骨密度的測定；取第1～3腰椎，無菌紗布浸透0.9%鹽水后包裹，于液氮中保存，用于mRNA的檢測。以上標本取材時均按分組編號做好標記。

1.3.4 檢測指標 （1）骨密度：治療結(jié)束后將大鼠處死，取右側(cè)脛骨，采用美國HOLOGIC DISCOVERY CI型雙能X線骨密度儀，測定大鼠右脛骨、右脛骨上端骨密度。由福建省中醫(yī)藥研究院提供檢測服務(wù)；（2）mRNA測定：PCR法檢測過程如下：取 L1～L3椎體加 200 μL Trizol，研磨后加入800 μL的Trizol溶液，混勻后于室溫下靜置15 min，加氯仿，靜置10 min后離心。提取上層水相并加入等體積的異丙醇，混勻后置于低溫環(huán)境30 min，后離心10 min，去上清液，留取沉淀。加乙醇振蕩洗滌RNA沉淀1次，后離心5 min。再水溶解。用HiScript?II RT SuperMix for PCR進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。由福州沃森生物技術(shù)有限公司合成內(nèi)參及引物，內(nèi)參照序列：GAPDH(Rat)140bp上游：5’-ACGGCAAGTTCAACGGCACAG-3’。引物序列：Runx2(rat)385bp上游：5’-TGCCATCGTGTGTGAACATAAGA-3’，下游：5’-CGTGTGTCAGAAGGAGTCAGGATG-3’， c-myc(rat)220bp上游：5’-CCGTTCAAGCAGATGAGCAC-3’，下游：5’-GCCAAGGTTGTGAGGTTAGG-3’，cyclin D1(rat)173bp上游：5’-GCGGATGAGAACAAGCAGAT-3’，下游：5’-CGGTAGCAGGAGAGGAAGT-3’， 下 游 ： 5’-GAAGACGCCAGTAGACTCCACGAC-3’。預(yù)變性（94℃，5 min）、變性：（94℃，30 s)，退火：（58℃，30 s)、延伸（72℃，20 s)、重復變性→延伸（30個循環(huán)）、延伸（72℃，7 min)。反應(yīng)完成后取4 μL PCR擴增產(chǎn)物于 0.9%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測30 min后，凝膠成像儀檢測條帶。

1.3.5 統(tǒng)計學方法 采用 SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行分析，各指標計量數(shù)值均用均數(shù)±標準差（x±s）表示，各組數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布且方差齊性使用單因素方差分析，組間比較采用LSD檢驗；任一組數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布的，對秩轉(zhuǎn)換后產(chǎn)生的新變量進行 SNK檢驗。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠右脛骨骨密度測定結(jié)果比較 結(jié)果如圖1（SPSS 18.0統(tǒng)計學軟件制圖）所示：與假手術(shù)組比，模型組骨密度下降（P＜0.05）。與模型組相比，腎俞足三里組骨密度有顯著性差異（P＜0.05），而非經(jīng)非穴組差異無統(tǒng)計學意義。

圖1 大鼠脛骨骨密度比較

2.2 各組大鼠脛骨上端骨密度測定結(jié)果比較 結(jié)果如圖2顯示：與假手術(shù)組相比，模型組骨密度均值降低（P＜0.05）。與模型組相比，腎俞足三里組骨密度均值有顯著性差異（P＜0.05），而非經(jīng)非穴組骨密度均值差異無統(tǒng)計學意義 （P＞0.05）。

圖2 大鼠脛骨上端骨密度比較

2.3 mRNA測定凝膠成像儀檢測條 如圖3所示。

圖3 mRNA測定凝膠成像儀檢測條

2.4 各組大鼠腰椎c-myc、Cyclin D1和Runx2 mRNA表達結(jié)果比較

2.4.1 c-myc mRNA測定比較 結(jié)果如圖 4所示：與假手術(shù)比較，空白組（P＞0.05），模型組（P＜0.05），腎俞足三里組 （P＞0.05），非經(jīng)非穴組 （P＜0.05）。

圖4 c-myc mRNA灰度值比較

2.4.2 Cyclin D1 mRNA測定比較 結(jié)果如圖5所示：Cyclin D1灰度值均值非經(jīng)非穴組＞模型組＞假手術(shù)組＞腎俞足三里組＞空白組（P＞0.05），差異均無統(tǒng)計學意義。

圖5 Cyclin D1灰度值比較

2.4.3 Runx2 mRNA測定比較 結(jié)果如圖 6所示：與空白組相比，模型組（P＜0.05）；與模型組相比，腎俞足三里組 （P＜0.05）、非經(jīng)非穴組 （P＜0.05）；與非經(jīng)非穴組相比，腎俞足三里組（P＞0.05）。

圖6 Runx2灰度值比較

3 討論

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥（PMOP）多認為是由于卵巢功能減退而導致的一種常見骨骼疾病，因其伴隨著骨強度下降、骨折易感性增加，使得致殘率與致死率較高。研究發(fā)現(xiàn)雌激素是通過受體以及細胞因子的介導，從而影響成骨細胞與破骨細胞的凋亡，并可通過促進體內(nèi)骨保護素的水平升高，降低骨保護素受體的水平，從而抑制了破骨細胞對骨的吸收［4］。絕經(jīng)后婦女因雌激素水平的降低，破骨細胞活性增強，成骨細胞受抑制，骨吸收和骨形成平衡失調(diào)，導致骨量丟失，引起骨質(zhì)疏松［5］。根據(jù)其臨床表現(xiàn)及發(fā)病的部位，應(yīng)當屬于中醫(yī)學“骨痿”“骨痹”“骨枯”的范疇。《素問·痿論》曰：“腎主身之骨髓。腎氣熱，則腰背不舉，骨枯而髓減，發(fā)為骨痿?！薄秱浼鼻Ы鹨健す菢O》指出：“骨極者，主腎也，腎應(yīng)骨，骨與腎合，……若腎病則骨極，牙齒苦痛，手足疼，不能久立，屈伸不利，身痹腦髓痠。”腎為先天之本，主骨生髓藏精，其充在骨，女子七七“天癸”絕，腎精逐漸衰少，骨髓化源不足，不能濡養(yǎng)骨骼而致骨骼脆弱無力，繼而出現(xiàn)腰背酸痛、脛膝酸軟等骨質(zhì)疏松癥的典型表現(xiàn)［6］。PMOP的發(fā)病根源皆在于腎，病機關(guān)鍵是腎虛精衰，骨髓虧虛，骨骼失養(yǎng)。又如《醫(yī)宗必讀》指出：“陽明虛則血氣少，不能潤養(yǎng)宗筋，故弛縱，宗筋弛縱則帶脈不能收引，故足痿不用?！薄鹅`樞·決氣》曰：“谷入氣滿，淖澤注于骨?！逼楹筇熘?，氣血生化之源，婦女在絕經(jīng)前，身體脾胃虛衰，運化受礙，氣血乏源，血不化精，無以充養(yǎng)先天之精，則腎虛經(jīng)絕而骨痿，致骨骼疏松發(fā)生。故本病與脾胃的關(guān)系也密切。因此治療應(yīng)補腎虛同時兼顧脾胃。本實驗取腎之背俞穴腎俞，配合胃之下合穴足三里，起到培腎壯骨、健脾益氣、強壯體質(zhì)的作用。針灸治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的療效及闡明其作用機理，仍然是目前針刺治療PMOP研究的主要內(nèi)容之一。

本實驗結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組脛骨、脛骨上端骨密度均降低（P＜0.05），證實造模能降低骨密度。與模型組相比，腎俞足三里組大鼠脛骨、脛骨上端骨密度均升高（P＜0.05）；非經(jīng)非穴組脛骨、脛骨上端骨密度差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。從結(jié)果可以看出，針刺腎俞、足三里可使脛骨、脛骨上端骨密度升高，這表明針刺腎俞、足三里穴可改善絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的骨密度降低。本研究從實驗的角度驗證了針刺腎俞、足三里穴可改善絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的骨密度降低。結(jié)合其他實驗研究［7-9］都得出針刺相關(guān)穴位可以改善去卵巢大鼠的骨密度水平，其結(jié)論與我們的研究結(jié)論一致。

作為 Wnt/β-catenin通路的兩個下游靶基因，c-myc和Cyclin D1通過一系列的轉(zhuǎn)錄后，可使細胞進入S期，促進成骨細胞增殖分化。c-myc通過基因啟動子上的TCF4結(jié)合位點與 β-catenin結(jié)合，調(diào)節(jié)細胞周期，促進G1到S期的轉(zhuǎn)變，從而促進成骨細胞的分化增殖。Cyclin D1作為細胞周期增殖的關(guān)鍵蛋白，促進細胞周期從G1期到 S轉(zhuǎn)換，從而調(diào)節(jié)細胞分化增殖［10-11］。另外，Runx2作為調(diào)節(jié)成骨細胞分化和骨發(fā)育的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，能調(diào)控膜內(nèi)和軟骨內(nèi)骨化成骨，促進骨形成［12］。

根據(jù)實驗的結(jié)果顯示，腎俞足三里組 c-myc mRNA表達與假手術(shù)組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），說明針刺腎俞、足三里穴產(chǎn)生的作用能防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥大鼠模型。針刺腎俞、足三里對 Cyclin D1 mRNA表達差異均無統(tǒng)計學意義，延長實驗周期或者擴大樣本量也許能進一步發(fā)現(xiàn)他們的關(guān)系，也可能是針刺腎俞、足三里的作用靶向并非是 Cyclin D1。模型組大鼠腰椎Runx2 mRNA較空白組降低，提示腰椎中 Runx2 mRNA表達降低可能是絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病機制之一，通過針刺腎俞、足三里穴可能通過使腰椎中Runx2 mRNA表達升高而防治 PMOP，腎俞足三里組Runx2灰度值雖略大于非經(jīng)非穴組，考慮受樣本量、干預(yù)時間限制，目前Runx2灰度值還不足以體現(xiàn)差異。

“腎主骨”，腎氣虛衰是絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的根本病因，腎俞穴是腎臟之氣輸注在背腰部的腧穴，針之可補腎壯骨、強壯體質(zhì)，固護人體先天之本。足三里為胃腑之下合穴，針之可補益脾胃、強壯機體、培補后天。中醫(yī)從整體出發(fā)，顧先天及后天之本，改善 PMOP病機，從而達到改善骨質(zhì)疏松的治療目的。本實驗結(jié)果提示該腧穴配合對臨床具有較好的參考價值。