張萍，周玉成，程悅寧，程世鵬，楊艷玲

（中國農(nóng)業(yè)科學院特產(chǎn)研究所，長春 130112）

熒光偏振（FP）由于其均勻的格式、速度、準確性和自動化的高通量能力，構成了包括臨床、食品和環(huán)境[1-2]等各種應用領域?qū)π》肿舆M行常規(guī)分析的最有效的技術之一。熒光偏振免疫分析法（Fluorescen cepolarization immunoassay，F(xiàn)PIA）是基于對抗體結合位點的自由分析和熒光標記抗原的競爭的一種方法，其操作簡單，易于自動化，適于快速篩選。因為分析物可以與高分子量的抗體結合，所以無需分離的步驟。目前，F(xiàn)PIA用于確定農(nóng)業(yè)產(chǎn)品和環(huán)境樣本中農(nóng)藥[3-4]、抗生素[5-7]和真菌毒素[8-9]的存在，且FPIA在病原檢測方面也已經(jīng)得到了廣泛應用。筆者綜述了熒光偏振免疫技術的發(fā)展歷史、原理、優(yōu)缺點和在病原檢測中的應用，概括了近幾年國內(nèi)、外針對各種病原建立的熒光偏振免疫分析方法研究進展。

1 FPIA的發(fā)展歷史

在20世紀初期，Perrin最初建立了熒光偏振檢測方法。1954年，免疫分析就已成為臨床化學和生物化學等領域中的一個重要方法。雖然放射標記免疫分析法具有特異性強、靈敏度高和使用范圍廣等優(yōu)點，但放射危害以及標記物不穩(wěn)定等缺點也很明顯。在此研究基礎上，陸續(xù)發(fā)展了酶免疫法、化學發(fā)光免疫法、熒光免疫法和電化學免疫法等免疫分析方法。這些方法在實際應用中，大多數(shù)使用非均相的免疫分析技術。非均相系統(tǒng)靈敏度高且特異性好，但操作過程復雜繁瑣，受到限制。20世紀70年代，熒光偏振第一次應用到抗原抗體反應中，并用該法研究了生物系統(tǒng)中抗原-抗體和激素-受體之間的作用[10-11]。1976年，熒光偏振免疫方法首次應用于篩選血清中的治療性藥物[12]。1977年，F(xiàn)PIA方法在檢測農(nóng)藥苯菌靈的主要代謝物2-氨基苯并咪唑中起到重要作用，但由于受到熒光偏振測量儀發(fā)展的限制，其應用并不常見。20世紀80年代初，Jolley等[13-15]對FPIA方法進行改良，并將FPIA方法用于人體治療藥物和毒物含量測定，檢測人血清中氨基糖苷類抗生素被認為是FPIA方法在醫(yī)藥檢測應用中的開端。1988年，Colbert等[16]首次將FPIA方法應用在檢測農(nóng)藥殘留研究中，并且建立了檢測血液中百草枯含量的方法。Eremin等[17]建立了在豬肉中檢測磺胺二甲嘧啶殘留量的方法，并用該方法對食品中藥物殘留進行檢測。而后，美國Jolley Consulting and Research公司推出更先進的熒光偏振光分析儀，并具有易于自動化、靈敏度高且可輸入多個參數(shù)等優(yōu)點。Baker等[18]在2000年設計了雙光路熒光偏振光分析儀，可以消除背景干擾，在測定復雜生物樣品時，具有更好的靈敏度和精確度。

2 FPIA的原理

熒光偏振免疫分析與傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）相比，最顯著優(yōu)勢在于它是在液相中進行的一種均相分析，無需分離游離和結合的示蹤物，省略了洗滌步驟。當溶液中的熒光基團暴露于平面偏振光下，產(chǎn)生的輻射就會被極化。在激發(fā)和發(fā)射過程中，熒光體的運動產(chǎn)生了反極化的結果，因此，熒光基團的運動速度越快，發(fā)射角度越偏，使用偏振器可以將熒光發(fā)射分離成水平和垂直分量。

在最簡單的意義上，偏振（P）可以表達為垂直（IV）和水平（IH）平面上的發(fā)射差除以它們的總和，即P=（IV-IH）/（IV+IH）。在沒有待測因素影響情況下，抗體結合示蹤物，限制了其運動，偏振值較高。在待測樣品存在情況下，示蹤物與抗體結合少，大部分存在于溶液中，其偏振值較低。許多學者曾對這種分析原理多次進行詳細的描述[19-21]。

3 FPIA方法的優(yōu)缺點

3.1 FPIA的優(yōu)點

無需洗滌操作，減少試劑用量；檢測迅速，易于自動化，便于快速篩選；熒光標記抗原均一性好，穩(wěn)定性高；不易受溶液顏色和儀器靈敏度變化等因素的影響，結果穩(wěn)定。

3.2 FPIA的缺點

靈敏度比ELISA方法低；易受背景熒光、光散射以及樣本基質(zhì)的影響；檢測范圍較窄，信噪比（S/N）較低；純化步驟復雜；需要特定的分析儀器，價格昂貴[22]。

4 FPIA研究進展

4.1 單試劑FPIA檢測方法

單試劑FPIA檢測方法是抗原抗體與選定的示蹤物混合，進行競爭性抗原反應，將傳統(tǒng)的FPIA方法操作步驟進行簡化，孵育時間短，便于操作和運輸。由于示蹤物對抗體具有一定的保護作用，所以，單試劑FPIA比普通FPIA更加穩(wěn)定[23]。

4.2 停流FPIA方法

當樣品中病原含量較低時，競爭免疫系統(tǒng)達到平衡，難以區(qū)別分析信號和本地信號。停流FPIA技術測量示蹤物與抗體起始反應速度，大大降低了散射光和基質(zhì)熒光對檢測結果的影響，且反應測量速度快，僅需要 4～6 s。

4.3 置換FPIA方法

置換FPIA技術是將示蹤物與抗體提前在溶液中進行平衡，然后與樣品結合，抗原將溶液中的示蹤物與抗體結合物中的示蹤物置換出，測定置換出的示蹤物，換算樣品中的抗原濃度，無需孵育便可檢測，檢測時間短，反應過程較為穩(wěn)定，標準曲線在7 d內(nèi)穩(wěn)定[23]。

4.4 有機溶劑FPIA方法

在非極性有機溶劑中，表面活性劑形成的反相膠束系統(tǒng)可以溶解多種生物活性物質(zhì)，形成透明膠狀溶液。反相膠束系統(tǒng)的優(yōu)勢是可以測定非極性有機溶劑中的分析物。在分析動植物組織中的藥物殘留時，用可與水混溶的有機溶劑直接提取三氯乙醛[24]、2，4，5-三氯苯氧乙酸和甲基對硫磷[9]等藥物；另外，F(xiàn)PIA反應中至少可耐受25%的甲醇或者10%乙腈，而在檢測赭曲霉素A時，即使甲醇含量100%，靈敏度也不會發(fā)生很大變化[25]。

4.5 芯片F(xiàn)PIA方法

微芯片分析是一種很有前景的藥物治療監(jiān)測方法。它是在微晶片上測定熒光偏振，并獲得血清素的濃度。Tachi等[25]成功地對血清中血清素進行了定量分析，在65s內(nèi)可分析出結果；微芯片F(xiàn)PIA方法取得的結果與克隆酶免疫分析（CEDIA）和顆粒增強濁度抑制免疫分析（PETINIA）的結果有良好的相關性。傳統(tǒng)FPIA是用于分析各種藥物的通用方法，基于微芯片的FPIA系統(tǒng)不僅用于植物的分析，還可用于其他藥物的分析。

5 熒光偏振免疫技術在病原檢測中的應用

5.1 在布魯氏菌檢測中的應用

1996年，已經(jīng)出現(xiàn)將FPIA與其他血清學方法結合檢測牛布魯氏菌的案例。將經(jīng)過平板凝集試驗（BPAT）、補體結合試驗（CFT）、間接酶聯(lián)免疫吸附實驗（IELISA）和競爭性酶聯(lián)免疫吸附實驗（CELISA）檢測過的9 480份血清樣品進行了FPIA試驗。這些血清中，有561份樣品是從檢測出布魯氏菌的組織和牛奶中分離出來的，8669份來自流行病學和血清學檢測均為陰性的牛，250份來自免疫后不同時期的牛。當隔斷值（Cut-off值）為90 mP時，F(xiàn)PIA的敏感性和特異性分別是99.02%、99.96%，均高于其他傳統(tǒng)檢測方法[26]。2014年，訾占超等[27]闡述了熒光偏振技術在布魯氏菌病檢測中的應用并進行了分析。

5.2 在真菌毒素檢測中的應用

5.2.1 伏馬菌素 伏馬菌素是發(fā)現(xiàn)于多種商品中的霉菌毒素，包括玉米等，被認為是豬肺水腫綜合癥和馬腦白質(zhì)軟化綜合癥的致病因子。試驗證明，伏馬毒素對嚙齒類動物也有致癌作用。第一個報道霉菌毒素的FPIA應用是用于檢測玉米中的伏馬菌素[28]?？蒲腥藛T對2種數(shù)據(jù)的采集和分析方法進行研究：一種是在添加示蹤劑之前收集樣品（IV，IH）的熒光強度，隨后用于校正添加示蹤劑后獲得的值，通過這種方式，每個樣本都確定了其背景校正，再將樣品的結果與緩沖液的標準曲線對比；另一種是利用緩沖溶液的熒光強度來校正樣本的背景熒光，在這種方法中，將試驗數(shù)據(jù)轉換成一個標準曲線，最大值為1，最小值為0，將樣品的數(shù)據(jù)與緩沖液的標準曲線對比，確定伏馬菌素的含量，不包括提取步驟，分析大約需要2min。玉米樣品檢測范圍為0.5～20.0g FB1/g，平均回收率為94.3%，相對標準偏差為14.6%。第1種方法的校正背景較好，所以性能方面更有優(yōu)勢。

5.2.2 黃曲霉毒素 黃曲霉毒素作為致癌物，與人類和動物健康的相關性低于其他的真菌毒素，而且這些毒素在食物和飼料中的含量也較低。因此，這些毒素的檢測方法需要較高的靈敏度。已有報道關于天然受污染的玉米、高粱、花生糊和花生醬中黃曲霉素敏感的FPIA，示蹤劑是黃曲霉毒素熒光素偶聯(lián)物，孵育時間為15min。黃曲霉素標準溶液中，黃曲霉素B1、B2、G1和G2的抑制曲線的中點分別為28、90、100和100ng/mL；該試驗與高效液相色譜（HPLC）的參考方法相比較，顯示出天然受污染樣品的良好相關系數(shù)（r2=0.97），盡管在爆米花中存在偏差[29]。

5.2.3 玉米赤霉烯酮 玉米赤霉烯酮（ZEN）及其一些同源物質(zhì)都是雌性激素，通常由產(chǎn)生脫氧雪腐的同種真菌產(chǎn)生。FPIA最初用來檢測玉米赤霉烯酮和玉米相關化合物[30]，使用ZEN-熒光素示蹤劑。該方法檢測限為0.1g ZEN/g玉米，說明試驗的效果與示蹤劑孵育的時長短有關。該方法與HPLC相比較，相關系數(shù)（r2）為0.976。為建立一種敏感的FPIA來篩選玉米中玉米赤霉烯酮一類的真菌毒素，制備2種新的單克隆抗體（MAbs），與玉米烯酮類和4種熒光標記示蹤劑密切相關。在靈敏度和特異性方面選擇適當?shù)淖粉櫩贵w后，建立一種能夠檢測出玉米烯酮類且具有相似靈敏度的FPIA。

6 結論

應用FPIA對各種病原分析的技術越來越多。據(jù)報道，F(xiàn)PIA的速度確實非?？?，大多數(shù)需要2～15 min即可完成。重要的試驗參數(shù)，如速度和靈敏度，不僅取決于抗體和示蹤劑的質(zhì)量，還取決于它們?nèi)绾闻c病原相互作用。選擇合適的抗體和示蹤劑組合可以產(chǎn)生快速而敏感的抗原。像其他免疫系統(tǒng)一樣，F(xiàn)PIA會受到樣本矩陣的影響。除了使用最靈敏的抗體和示蹤劑組合外，矩陣效應還可以通過一系列確定的程序來控制，從簡單的稀釋到與矩陣匹配的校準。雖然FPIA非常簡單，但技術的邏輯進展可使分析步驟自動化，以進一步提高易用性，減少與操作相關的變量使用，隨著FPIA技術不斷進步，F(xiàn)PIA檢測方法可能會成為各種病原檢測的主要技術之一。