江慧洪 綜述， 林謀斌 審校

(同濟(jì)大學(xué)附屬楊浦醫(yī)院普外科，同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院胃腸外科和轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究所，上海 200090)

結(jié)直腸癌是全球第三大惡性腫瘤，每年新發(fā)病例140余萬(wàn)，死亡近70萬(wàn)人[1]?，F(xiàn)代腫瘤學(xué)認(rèn)為，腫瘤是經(jīng)典遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)改變累積的復(fù)雜過(guò)程，且表觀遺傳學(xué)改變可能更早發(fā)生[2]。DNA甲基化作為表觀遺傳修飾的重要方式，可以在不改變DNA序列的情況下調(diào)控基因的表達(dá)[3]。近年來(lái)的研究表明，眾多基因的異常甲基化在結(jié)直腸癌的早期階段及癌前病變中就已發(fā)生，并可在患者的外周血、糞便等體液中檢測(cè)到[4-6]。結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)歸及預(yù)后與病變的分期密切相關(guān)，開(kāi)展早期篩查是改善腸癌患者預(yù)后的關(guān)鍵[7]。因此，DNA甲基化標(biāo)志物有望成為結(jié)直腸癌早期診斷的有效手段，應(yīng)用前景廣闊?，F(xiàn)就DNA甲基化在結(jié)直腸癌早期診斷中的研究進(jìn)展作一綜述。

1 DNA甲基化在結(jié)直腸癌中的作用機(jī)制

DNA甲基化是指在甲基轉(zhuǎn)移酶的催化下，CpG兩個(gè)核苷酸的胞嘧啶被選擇性添加甲基，形成5-甲基胞嘧啶[3]。CpG序列在人類(lèi)基因組中的分布很不均一，常聚集出現(xiàn)，稱(chēng)之為CpG島。CpG島多位于基因的啟動(dòng)子和第一外顯子區(qū)，與56%的人類(lèi)基因組編碼基因密切相關(guān)[2,8]。甲基化可通過(guò)多種方式影響基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，包括干擾轉(zhuǎn)錄因子對(duì)DNA元件的識(shí)別和結(jié)合，募集組蛋白去乙酰化酶形成轉(zhuǎn)錄抑制復(fù)合物及改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)等。DNA甲基化異常主要表現(xiàn)為基因組整體甲基化水平降低和部分啟動(dòng)子區(qū)異常高甲基化，前者可導(dǎo)致原癌基因活化、基因印記缺少和染色體不穩(wěn)定增加，后者則會(huì)引起抑癌基因、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)基因和細(xì)胞凋亡基因等表達(dá)沉默[8-10]。近年來(lái)，高通量檢測(cè)技術(shù)為甲基化研究提供了有力工具。目前已在結(jié)直腸癌中發(fā)現(xiàn)眾多異常的DNA甲基化，并與腸癌的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)[11]。研究[12]報(bào)道，p14、HLTF、ITGA4、CDKN2A/p16、CDH1和ESR1等基因甲基化改變參與了結(jié)直腸腺瘤的形成；而TIMP3、CXCL12、ID4和IRF8等基因甲基化異常在腸癌的侵襲及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了重要作用。此外，研究發(fā)現(xiàn)DYPD、TYMP、UMPK和SPARC基因甲基化狀態(tài)與5-氟尿嘧啶化療方案的療效有關(guān)[13-14]，UGT1A1基因 高甲基化則會(huì)影響腸癌細(xì)胞對(duì)伊立替康的敏感性[15]。

1999年，Toyota等[16]首次發(fā)現(xiàn)在約20%的結(jié)直腸癌中存在高甲基化聚集現(xiàn)象，稱(chēng)之為CpG島甲基化表型(CpG island methylator phenotype, CIMP)。Weisenberger等[17]提出可通過(guò)檢測(cè)CACNA1G、IGF2、NEUROG1、RUNX3和SOCS1基因的甲基化狀態(tài)來(lái)判定CIMP。眾多研究發(fā)現(xiàn)，CIMP陽(yáng)性結(jié)直腸癌具有獨(dú)特的分子病理特征，其多發(fā)生在高齡、女性患者和右半結(jié)腸，表現(xiàn)出較差的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀況和預(yù)后，并與MLH1高甲基化、BRAF突變、微衛(wèi)星不穩(wěn)定(microsatellite instability, MSI)等密切相關(guān)[18-19]。目前普遍認(rèn)為結(jié)直腸癌的發(fā)生主要涉及3條分子通路： 染色體不穩(wěn)定性(chromosome instability, CIN)、MSI和CIMP。在此基礎(chǔ)上，Simons等[20]將腸癌分為CIN-only、MSI、CIMP-only、CIMP+CIN和三陰型等5種亞型，這對(duì)于結(jié)直腸癌個(gè)體化診療方案的實(shí)施具有重要意義。

2 血液DNA甲基化檢測(cè)在結(jié)直腸癌早期診斷中的應(yīng)用

腸鏡檢查仍是當(dāng)前結(jié)直腸癌篩查最準(zhǔn)確的方法，但成本較高，且存在一定并發(fā)癥風(fēng)險(xiǎn)，患者依從性欠佳。糞便隱血檢查雖然價(jià)格便宜、操作簡(jiǎn)單，但敏感性和特異性都不高。DNA甲基化異常是結(jié)直腸癌發(fā)生的早期事件，且可在外周血、糞便等體液中檢測(cè)到[4]。因此，利用甲基化標(biāo)志物來(lái)實(shí)現(xiàn)腸癌的無(wú)創(chuàng)早期篩查是近些年來(lái)研究的熱點(diǎn)。

在眾多血液DNA甲基化檢測(cè)的研究中，Septin9最引人注目。作為與細(xì)胞分裂和細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)的Sept基因家族成員，其表達(dá)與結(jié)直腸癌的發(fā)病緊密相關(guān)[21]。最新的關(guān)于外周血Septin9甲基化檢測(cè)診斷結(jié)直腸癌的綜述顯示，其總體敏感性為66%(95%CI： 64%～69%)，特異性為91%(95%CI： 90%～91%)，篩查效能明顯優(yōu)于糞便隱血檢查[22]。研究顯示Septin9檢測(cè)的敏感性與腫瘤分期密切相關(guān)，在Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ期結(jié)直腸癌中，敏感性分別為35%、46%和63%，而在進(jìn)展期腺瘤的篩查中，敏感性?xún)H為11%，這是因?yàn)椴∽冊(cè)皆纾w內(nèi)循環(huán)腫瘤DNA水平越低[23]。NEUROG1屬于堿性螺旋-環(huán)-螺旋(basic helix-loop-helix, bHLH)家族成員，在神經(jīng)分化、發(fā)育過(guò)程中起著重要作用。Herbst等[24]研究顯示，血液NEUROG1甲基化標(biāo)志物用于檢測(cè)結(jié)直腸癌的敏感性和特異性分別為61%和91%，在Ⅰ期腸癌篩查中，敏感性仍可維持在52%左右。ALX4是一種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，研究顯示它可以通過(guò)調(diào)控LEF-1的間質(zhì)特異活性參與結(jié)直腸癌的起病，并在上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-to-mesenchymal transition, EMT)中發(fā)揮重要作用[25]。Ebert等[26]發(fā)現(xiàn)，血清ALX4高甲基化篩查腸癌的敏感性和特異性分別為83%和70%，而當(dāng)ALX4和Septin9聯(lián)合檢測(cè)時(shí)，雖然敏感性下降到71%，但特異性高達(dá)95%[27]。TMEFF2是一類(lèi)進(jìn)化保守的跨膜蛋白，在結(jié)直腸癌中呈高甲基化狀態(tài)。He等[28]發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合分析血液中ALX4、SEPT9和TMEFF2基因的甲基化狀態(tài)，診斷腸癌的敏感性和特異性分別高達(dá)81%和90%。Lee等[29]報(bào)道了4個(gè)基因甲基化組合(APC、MGMT、RASSF2A和WIF1)，其篩查腸癌的敏感性為87%，特異性為92%。這些研究均提示，多基因聯(lián)合檢測(cè)有助于提高結(jié)直腸癌篩查的準(zhǔn)確性。此外，APC、hMLH1、NGFR、SFRP2、P16、HPP1和RUNX3等基因的異常甲基化也被報(bào)道是結(jié)直腸癌篩查潛在的外周血標(biāo)志物[30]。

血液DNA甲基化檢測(cè)存在的最大缺陷在于缺乏組織特異性，目前報(bào)道的這些標(biāo)志物在結(jié)直腸癌以外的腫瘤中也存在。因此，血液DNA甲基化異常，往往還需結(jié)合腸鏡檢查等以確定腫瘤的位置。隨著全基因組甲基化測(cè)序等新技術(shù)的應(yīng)用，期望將來(lái)能發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌特異性的標(biāo)志物。

3 糞便DNA甲基化檢測(cè)在結(jié)直腸癌早期診斷中的應(yīng)用

與血液相比，以糞便為基礎(chǔ)的檢查存在一定優(yōu)勢(shì)[31]： 由于結(jié)直腸腺瘤和早期癌都發(fā)生在腸道內(nèi)并與糞便直接接觸，脫落的腫瘤細(xì)胞會(huì)直接混在糞便中，不僅組織特異性強(qiáng)，收集的腫瘤DNA量也明顯更高；此外，糞便DNA檢測(cè)不受飲食等因素影響，樣本的采集和保存也更為方便。

目前，在結(jié)直腸癌患者糞便中可檢測(cè)出的糞便DNA分子標(biāo)志物有多種，可分為單基因檢測(cè)和多基因聯(lián)合檢測(cè)兩大類(lèi)。2004年，Müller等[32]報(bào)道了首個(gè)糞便甲基化標(biāo)志物——SFRP2，其通過(guò)調(diào)節(jié)Wnt信號(hào)通路參與腸癌的發(fā)生發(fā)展，研究顯示SFRP2在腸癌篩查中的敏感性為77%～90%，特異性為77%，在腺瘤患者中檢出率約為50%。Melotte等[33]發(fā)現(xiàn)，NDRG4是候選腫瘤抑制基因，NDRG4啟動(dòng)子甲基化可作為標(biāo)志物用于糞便樣品檢測(cè)直腸癌，敏感性和特異性分別為61%和93%。Vimentin甲基化是另一個(gè)被廣泛報(bào)道的糞便標(biāo)志物，其診斷結(jié)直腸癌的敏感性和特異性分別為46%和90%[34]。此外，TFPI2、MGMT、RASSF2、OSMR、SPG20、SLIT2、3OST2、ESR1和PHACTR3等甲基化標(biāo)志物也被報(bào)道可用在糞便樣品篩查結(jié)直腸癌及進(jìn)展期腺瘤[30]。Lu等[35]在糞便中聯(lián)合檢測(cè)SFRP2、GATA4/5、NDRG4和vimentin等基因的甲基化狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合檢測(cè)的敏感性高達(dá)96.4%，明顯高于各單項(xiàng)檢測(cè)標(biāo)志物。2012年，Ahlquist等[36]利用QuARTS技術(shù)研發(fā)了一種多靶點(diǎn)檢測(cè)試劑盒，包括Vimentin、NDRG4、BMP3、TFPI2等4種基因的異常甲基化，其對(duì)結(jié)直腸癌和進(jìn)展期腺瘤的篩查敏感性分別達(dá)到了90%和89%，特異性分別為85%和54%，篩查效能要明顯優(yōu)于血液Septin 9甲基化標(biāo)志物[37]。目前，市場(chǎng)上已經(jīng)有應(yīng)用糞便DNA檢測(cè)作為結(jié)直腸癌早期篩查的試劑盒，如美國(guó)的Cologuard、ColoSureTM和PreGen-Plus，國(guó)內(nèi)則有“常衛(wèi)清”“長(zhǎng)安心”等試劑盒。多種指南也表明糞便DNA檢測(cè)可以作為拒絕做腸鏡檢查人群的替代篩查方法，但檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性的受試者仍需要腸鏡檢查的進(jìn)一步確認(rèn)[38-39]。

既往甲基化研究的技術(shù)主要是基于一代測(cè)序的亞硫酸氫鹽測(cè)序PCR(bisulfite sequencing PCR, BSP)、甲基化特異性PCR(methylation specific-PCR, MSP)、MethyLight和甲基化敏感性高分辨率熔解曲線分析(methylation-sensitive high-resolution melting, MS-HRM)，但存在引物設(shè)計(jì)難度大、檢測(cè)失敗風(fēng)險(xiǎn)高、不能獲得序列的堿基狀態(tài)等缺陷[40]。隨著二代、三代測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)，高通量和高準(zhǔn)確性得以實(shí)現(xiàn)，并帶來(lái)了更多的DNA甲基化檢測(cè)方法，但糞便DNA甲基化檢測(cè)還需從改進(jìn)糞便處理流程，篩選更佳的標(biāo)志物組合等多方面進(jìn)行優(yōu)化。

4 展 望

表觀遺傳學(xué)改變是結(jié)直腸癌發(fā)病機(jī)制中的驅(qū)動(dòng)事件，而且DNA甲基化對(duì)腸癌基因組的影響比基因突變更大、更早。目前的研究表明，基于血液、糞便樣品中的甲基化標(biāo)志物的檢測(cè)有望為結(jié)直腸癌無(wú)創(chuàng)篩查提供一種經(jīng)濟(jì)、高效的手段。但如何優(yōu)化DNA甲基化標(biāo)志物的檢測(cè)流程，提高篩查的敏感性和特異性，是提升結(jié)直腸癌無(wú)創(chuàng)篩查技術(shù)性能所需克服的又一難題。相信隨著研究的深入和各種高通量研究手段的應(yīng)用，DNA甲基化檢測(cè)定將成為結(jié)直腸癌早期診斷的有力工具。