陳靜 魏增江 林卓立 廣東省藥品監(jiān)督管理局審評認證中心 （廣東 廣州 510080）

內(nèi)容提要： 地中海貧血是我國長江以南各省高發(fā)遺傳病之一，基因檢測是診斷金標準，文章從地中海基因檢測試劑質(zhì)量管理規(guī)范核查的角度進行研究，旨在為現(xiàn)場檢查和審評提供參考，把控產(chǎn)品的安全性和有效性。

根據(jù)《6840體外診斷試劑分類子目錄（2013版）》[4]，地中海貧血基因檢測試劑屬于三類體外診斷試劑的范疇。根據(jù)《體外診斷試劑注冊管理辦法》的規(guī)定，境內(nèi)第二類、第三類醫(yī)療器械注冊質(zhì)量管理體系核查，由省、自治區(qū)、直轄市食品藥品監(jiān)督管理部門開展[5]。截止2019年2月，經(jīng)國家藥品監(jiān)督管理局網(wǎng)站查詢，廣東省地中海貧血基因檢測試劑有效期內(nèi)注冊證超過全國注冊證60%，廣東省對地貧基因檢測試劑質(zhì)量管理規(guī)范核查具有豐富經(jīng)驗，本文就地貧基因檢測試劑質(zhì)量管理規(guī)范核查的主要問題和重點關注事項進行闡述，旨在為現(xiàn)場檢查和審評提供參考，規(guī)范行業(yè)發(fā)展，確保產(chǎn)品的安全性、有效性、可靠性[6,7]。

1.主要原材料

地中海貧血基因檢測試劑的主要原材料包含引物、探針、酶、dNTP、參考品等。具體如下。

1.1 引物和探針

著重關注引物和探針的設計原則，引物、探針核酸序列、模板核酸序列及二者的對應情況。質(zhì)量標準至少包括純度檢查、功能性試驗等。如為外購，應包含合成產(chǎn)物的質(zhì)檢證明。如帶有熒光標記物的探針，應明確標記的熒光基團。

1.2 酶

地中海貧血基因檢測試劑主要包括DNA聚合酶，其質(zhì)量標準包括DNA聚合酶活性、熱啟動能力、熱穩(wěn)定性，是否具有內(nèi)切或外切酶活性。如其他工具酶，應包含質(zhì)檢證明和驗證資料。

1.3 脫氧三磷酸核苷（dNTP）

包含dATP、dUTP、dGTP、dCTP和dTTP；質(zhì)量標準應至少包括純度檢查及（或）功能性實驗等。

1.4 產(chǎn)品研制所用參考品

參考品是產(chǎn)品性能溯源的根源，應關注如下內(nèi)容：①陽性參考品：包括全部缺失/突變類型。臨床常見突變/缺失基因位點的陽性參考品可使用含人類基因組的臨床樣本或其核酸提取液，臨床少見的缺失/突變基因位點可使用細胞系或質(zhì)粒樣品。②陰性參考品：使用經(jīng)鑒定無相應靶突變序列的質(zhì)粒樣品、含人類基因組的臨床樣本或其核酸提取液。③檢測限參考品：參考陽性參考品，需包含所有的突變類型。④重復性參考品：使用臨床常見缺失/突變基因位點的質(zhì)粒、細胞系、臨床樣本核酸提取液等。

2.主要生產(chǎn)工藝及反應體系

2.1 主要生產(chǎn)工藝

地中海貧血基因檢測試劑類產(chǎn)品的生產(chǎn)工藝主要包括PCR反應液制備、質(zhì)控品制備、膜條和/或顯色相關配套試劑制備等，關鍵工序應準確識別，評價關鍵工藝參數(shù)需設置過程控制點。

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2.2 反應體系重點關注

樣本用量、采集和處理方式等；引物/探針、酶、dNTP、緩沖離子的濃度和用量等；擴增程序的確定；溫度、時間等關鍵參數(shù)的確認。

3.性能評估

地貧基因檢測試劑的性能評估主要包括：準確性、特異性、檢測限、重復性、核酸提取效率等。性能指標和檢驗方法應符合YY/T 1527-2017《α/β-地中海貧血基因分型檢測試劑盒》的要求。

4.臨床試驗

臨床試驗符合《體外診斷試劑注冊管理辦法》[5]和《體外診斷試劑臨床試驗技術指導原則》[8]等法規(guī)的要求。

4.1 試驗機構

臨床試驗選擇至少3家（含3家）國家藥品監(jiān)督管理局醫(yī)療器械臨床試驗備案的臨床機構，同時出具醫(yī)學倫理委員會意見[9]。根據(jù)地中海貧血具有地域性的特性，應綜合不同地區(qū)、民族等人群差異，以及流行病學背景，選擇具有一定地域代表性的試驗機構和受試者。

4.2 試驗方法

地貧基因檢測試劑的臨床試驗所選對比試劑在預期用途、適用人群、樣本類型等方面應與申報產(chǎn)品具有較好的可比性。性能指標不低于對比產(chǎn)品。對檢測結果不相符的樣本，應選擇合適的方法（如第三方試劑、臨床普遍認為靈敏度和特異性較好的核酸序列測定方法等）進行確證。

4.3 受試對象

明確納入/排除標準、樣本剔除標準等。例如，受試人群應盡可能包含預期用途所聲稱的所有適用人群，不同區(qū)域、不同年齡段以及不同性別的受試者應盡量均勻分布。

4.4 樣本量

臨床試驗樣本量至少1000例。地中海貧血基因檢測試劑臨床試驗的樣本量與多種因素相關，如檢測的可重復性、干擾因素、亞組間的差異性、地貧基因類型的人群攜帶率等，需結合產(chǎn)品的具體情況進行臨床驗證，如有需要，建議細化各種亞組別/類型樣本的例數(shù)要求。

4.5 臨床評價指標及統(tǒng)計學分析

地貧基因檢測試劑一般為定性檢測，其臨床評價指標一般涉及：陽性符合率、陰性符合率、總符合率等。建議使用四格表卡方或kappa檢驗進行一致性分析。

5.采購環(huán)節(jié)

采購環(huán)節(jié)關注主要原材料的采購，具有制定供應商管理制度。包括與供應商簽訂質(zhì)量協(xié)議；建立供應商審核制度。主要原材料按批次進行進貨查驗，記錄完整并確保整個過程具有可追溯性。

6.生產(chǎn)管理環(huán)節(jié)

人員：具備相關專業(yè)知識、工作技能，經(jīng)過培訓并通過考核。

設備/器具：設備/器具應在驗證/校準合格期內(nèi)，且與生產(chǎn)批量匹配，精準度應滿足要求，并在生產(chǎn)一定周期后進行再確認。生產(chǎn)過程中使用的移液器應與生產(chǎn)批量相適應，首選量程相近的微量移液器。

物料：生產(chǎn)時所使用的原材料應與設計開發(fā)輸出的原材料要求一致，且經(jīng)過驗收/檢驗。生產(chǎn)過程中主要原輔料應物料平衡。

生產(chǎn)環(huán)境：地中?；驒z測試劑的生產(chǎn)和檢驗應當在獨立空間內(nèi)進行，防止擴增時的氣溶膠造成交叉污染。其配制、分裝、點膜、干燥、切割以及內(nèi)包裝等生產(chǎn)區(qū)域滿足相應的潔凈度級別[7]。

生產(chǎn)工藝：根據(jù)設計開發(fā)輸出的生產(chǎn)工藝規(guī)程進行生產(chǎn)，對于生產(chǎn)過程的關鍵控制點進行監(jiān)控。

標識：生產(chǎn)過程中應對設備、產(chǎn)品及其檢驗狀態(tài)作出標識。

追溯：生產(chǎn)過程中持續(xù)保持相關記錄并符合可追溯性要求。

7.質(zhì)量控制環(huán)節(jié)

檢驗要求：菌種的來源、驗收、儲存、保管、使用、銷毀，應執(zhí)行國家有關規(guī)定，菌種傳代應有記錄，并具有可追溯性。

追溯：應有批檢驗記錄，并滿足可追溯要求。

不合格品控制：建立不合格品控制程序。

留樣：應根據(jù)產(chǎn)品和工藝特點制定留樣制度。

放行：應按產(chǎn)品放行審核程序的要求對產(chǎn)品進行放行管理。

8.小結

基因診斷對于地貧確診是必須的，是高風險胎兒產(chǎn)前診斷的有效手段。為了保障地貧基因檢測試劑的安全性，有效性，本文從地貧基因檢測試劑質(zhì)量管理規(guī)范核查的角度出發(fā)，規(guī)范行業(yè)發(fā)展，也為檢查和審評提供參考。