朱晶婷，趙 波，藍(lán)志豪，何竺柳，李 壯，裘麗君，張 翎，儲張杰

（浙江海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，浙江舟山 316022）

凡納濱對蝦Penaeus vannamei是目前世界上養(yǎng)殖產(chǎn)量最高的三大蝦類之一[1],然而隨著對蝦養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大,集約化程度不斷提高,對蝦養(yǎng)殖病害發(fā)生頻率亦相應(yīng)增加[2]。其中早死綜合征（Early mortality syndrome，EMS）又稱急性肝胰腺壞死病（AHPNS），是近年來危害凡納濱對蝦最為嚴(yán)重的疾病，主要由高致病性副溶血弧菌Vibrio parahaemolyticus引起[3]。有研究表明養(yǎng)殖水體中副溶血弧菌濃度超過1.5×103CFU/mL[4]，蝦池內(nèi)極易發(fā)生早死綜合征。不僅如此，副溶血弧菌還會引起對蝦體內(nèi)機(jī)能協(xié)調(diào)失常、免疫力降低等[5]，這迫使人們開始研究其發(fā)病原因,尋找診斷[6]、控制和防治的方法[7]。

20世紀(jì)，抗生素的發(fā)現(xiàn)促進(jìn)了人類醫(yī)學(xué)的巨大進(jìn)步，水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)亦不斷受益。研究顯示，慶大霉素、紅霉素、環(huán)丙沙星等多種抗生素均能有效的抑制副溶血弧菌菌株的生長，可作為防治弧菌病的藥物。但由于抗生素的長期不合理使用，副溶血弧菌的耐藥性越來越強(qiáng)，且出現(xiàn)了多重耐藥性問題[8]，引起了國內(nèi)外的廣泛關(guān)注[9]。

隨著益生菌研究的日益增多，其在水產(chǎn)養(yǎng)殖上的應(yīng)用迅速發(fā)展。許多研究表明枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis可有效抑制弧菌的生長，提高凡納濱對蝦抗致病性副溶血弧菌的感染能力[10]，但對其用藥量和用藥頻率并沒有詳細(xì)的說明。本文通過研究枯草芽孢桿菌對副溶血弧菌生長繁殖的影響，以期找到枯草芽孢桿菌對不同濃度副溶血弧菌最適宜的菌種用量和用藥頻率，為水產(chǎn)動物細(xì)菌性疾病的防控提供重要參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌種來源

試驗用枯草芽孢桿菌菌種由南京茂捷微生物科技有限公司提供；試驗用副溶血弧菌從岱山縣和諧水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司的對蝦養(yǎng)殖水樣中分離，通過涂TCBS瓊脂平板獲得單菌落，經(jīng)生理生化鑒定、科赫法感染鑒定，確定為致病性副溶血弧菌。

1.1.2 培養(yǎng)基

營養(yǎng)肉湯瓊脂培養(yǎng)基：500 mL蒸餾水、1.5 g普通肉湯、1.5 g可溶性淀粉、2.5 g NaCl、硫酸錳20 mg、7.5 g瓊脂、pH 7.0～7.2。

TCBS瓊脂培養(yǎng)基：取8.9 g TCBS瓊脂培養(yǎng)基粉煮沸溶解于1 000 mL蒸餾水中，冷卻至60℃時傾入無菌平皿中。

1.1.3 實驗儀器

紫外分光光度計（上海棱光技術(shù)有限公司220V，50 Hz）、立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠，LDZX-75KBS）、電熱恒溫培養(yǎng)箱（寧波江南儀器廠，DP303A-2FD）、雙人單面凈化工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司，SW-CJ-2FD）、電爐（嘉興欣欣儀器設(shè)備有限公司，CD-20APX）。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌液ODX值標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

通過全波長掃描（300～800 nm以內(nèi)）實驗確定兩種菌出現(xiàn)吸收峰的吸收波長。分別繪制2種菌液ODX值與相對濃度（0.1～1之間）及菌落總數(shù)之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而計算出枯草芽孢桿菌和副溶血弧菌菌懸液的初始濃度。

1.2.2 枯草芽孢桿菌和副溶血弧菌的不同比例混合競爭培養(yǎng)

通過稀釋初始濃度菌液，使液體培養(yǎng)基中枯草芽孢桿菌濃度和弧菌濃度比例為 1：100、1：50、1：10、1：1、10：1、50：1、100：1 的 7 個濃度試驗組及 1：0、0：1 2 個對照試驗組。取 9 個 1 500 mL 的錐形瓶，加入 998 mL的液體培養(yǎng)基，加入相應(yīng)濃度菌液，置于37℃、150 r/min的搖床中培養(yǎng)。在試驗開始4 h，8 h，12 h，24 h時在每組中取1 mL菌液，稀釋到最適濃度涂營養(yǎng)肉湯平板和TCBS平板各3組，同時設(shè)置2組平行組，記錄數(shù)據(jù)取平均值。每次取完1 mL菌液后補(bǔ)充1 mL液體培養(yǎng)基。

1.2.3 瓊脂擴(kuò)散法

將含有枯草芽孢桿菌菌液的濾紙片貼在已接種了副溶血弧菌的瓊脂表面上，接種濃度比見表1，每個比例設(shè)置2個平行組，于37℃恒溫箱中培養(yǎng)。每隔12 h用毫米尺量取抑菌圈直徑，跟蹤檢測60 h，選取外圈成圓形的抑菌圈進(jìn)行測量，同時提取抑菌圈里面的物質(zhì)取樣，并通過革蘭氏染色與顯微觀察確定細(xì)菌種類。

表1 瓊脂擴(kuò)散法Tab.1 Agar diffusion method

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理采用Excle2007、Origin9.1進(jìn)行統(tǒng)計和處理。液體混合競爭培養(yǎng)中，枯草芽孢桿菌所占百分比即其抑菌率=（營養(yǎng)肉湯平板的細(xì)菌菌落總數(shù)-TCBS平板的細(xì)菌菌落總數(shù)）/營養(yǎng)肉湯平板的細(xì)菌菌落總數(shù)；瓊脂擴(kuò)散法中抑菌率%=（抑菌圈直徑-濾紙片直徑）/抑菌圈直徑。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌液ODX值標(biāo)準(zhǔn)曲線

通過全波長測試，確定了兩種菌出現(xiàn)吸收峰的吸收波長，ODX（枯草芽孢桿菌）=600 nm；ODX（副溶血弧菌）=595 nm；并繪制菌懸液ODX值與相對濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1）及菌懸液ODX值與細(xì)菌總數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖2）。根據(jù)關(guān)系曲線配置測算得枯草芽孢桿菌的初始濃度為1.31×107CFU/mL、副溶血弧菌的初始濃度為1.22×107CFU/mL。

圖1 枯草芽孢桿菌和和副溶血弧菌OD值標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of OD value of B.subtilis and V.parahaemolyticus

圖2 枯草芽孢桿菌和副溶血弧菌菌液總數(shù)與OD值關(guān)系曲線Fig.2 The relationship between the total number of B.subtilis and V.parahaemolyticus and OD

2.2 不同比例下枯草芽孢桿菌和副溶血弧菌的頡頏作用

培養(yǎng)24 h結(jié)束后，測定混合菌液中枯草芽孢桿菌和副溶血弧菌的總量（表2），觀察各比例處理下枯草芽孢桿菌的抑菌率隨時間變化（圖3）?？傮w來看枯草芽孢桿菌對副溶血弧菌有較好的頡頏作用，且相對濃度越高頡頏作用越明顯，其中組7比例（桿菌：弧菌=100：1）抑制效果最佳，4 h后弧菌完全被抑制，組6（桿菌：弧菌=50：1）8 h 后弧菌完全被抑制。組 5（桿菌：弧菌=10：1）24 h 后抑菌率可維持在 88%以上；組 4（桿菌：弧菌=1：1）24 h后抑菌率可維持在80%以上。其余3組比例處理下能產(chǎn)生頡頏作用但效果不佳。此外枯草芽孢桿菌對副溶血弧菌的頡頏作用在8～12 h最為明顯，12 h后枯草芽孢桿菌對副溶血弧菌的頡頏作用逐漸減緩。

表2 24 h時枯草芽孢桿菌和副溶血弧菌的生長情況Tab.2 Growth of V.parahaemolyticus and B.subtilis after 24 hours

2.3 瓊脂擴(kuò)散法

培養(yǎng)60 h結(jié)束后，各比例濃度濾紙片處理后顯示枯草芽孢桿菌對副溶血弧菌有明顯的頡頏作用（圖5）?？傮w來看，枯草芽孢桿菌對副溶血弧菌的頡頏作用與濃度比程正比，且當(dāng)枯草芽孢桿菌與副溶血弧菌的濃度比大于0.1時即會產(chǎn)生明顯抑菌圈，但是若副溶血弧菌處于高水平濃度時，兩者濃度比需大于等于1才能產(chǎn)生穩(wěn)定持久的抑制作用。此外0～12 h枯草芽孢桿菌對副溶血弧菌產(chǎn)生頡頏作用最為明顯，12～24 h，24～36 h產(chǎn)生的頡頏作用逐漸削弱，36 h以后保持平穩(wěn)不變。其中有5組試驗比例在36 h前枯草芽孢桿菌對副溶血弧菌有頡頏作用，而后36 h其的頡頏作用幾乎消失，分析顯示桿菌濃度過低會導(dǎo)致抑菌圈內(nèi)的桿菌被弧菌競爭性抑制而導(dǎo)致頡頏效果降低。

2.4 對平板抑菌圈的物質(zhì)探究

通過對抑菌圈里的物質(zhì)取樣，革蘭氏染色與顯微觀察，證實抑菌圈內(nèi)部的細(xì)菌是枯草芽孢桿菌，進(jìn)一步支持枯草芽孢桿菌可有效抑制副溶血弧菌的結(jié)論。

圖3 液體競爭培養(yǎng)中不同時間枯草芽孢桿菌對副溶血弧菌的抑制率Fig.3 In liquid competitive the changes of V.parahaemolyticus by B.subtilis over time

圖4 平板試驗中不同時間枯草芽孢桿菌對副溶血弧菌的抑制率Fig.4 In the table experiment B.subtilis inhibition rate against V.parahaemolyticus at different times

3 討論

在枯草芽孢桿菌和副溶血弧菌的頡頏培養(yǎng)下，枯草芽孢桿菌對副溶血弧菌生長的抑制較為明顯，同時還發(fā)現(xiàn)隨著桿菌濃度比的增加，桿菌對弧菌的頡頏作用也隨之增加。先前有研究表明枯草芽孢桿菌可以抑制許多致病菌，如秦瑤等[11]的研究結(jié)果顯示枯草芽孢桿菌對致病性大腸桿菌和沙門氏菌有抑菌作用，陳莉等[12]的研究結(jié)果顯示枯草芽孢桿菌N1729對棉花病原菌、枯萎病菌和黃萎病菌有抑菌作用。而本文實驗結(jié)果得出枯草芽孢桿菌對副溶血弧菌亦有較強(qiáng)的頡頏作用，可抑制其生長，也證明吳耀華[13]在南美白對蝦早死綜合征防控中提出將枯草芽孢桿菌作為解毒制劑的措施是可行的。

而目前對于枯草芽孢桿菌使用時最適宜抑菌濃度及投放量的研究較少。市售有很多枯草芽孢桿菌的產(chǎn)品，但對其用藥量和用藥頻率并沒有詳細(xì)的說明，很多研究也沒有跟蹤監(jiān)測枯草芽孢桿菌和副溶血弧菌不同濃度培養(yǎng)下隨時間的動態(tài)變化。本文采用瓊脂擴(kuò)散法和液態(tài)培養(yǎng)法動態(tài)跟蹤監(jiān)測不同濃度下枯草芽孢桿菌和副溶血弧菌的頡頏作用，瓊脂擴(kuò)散試驗法中發(fā)現(xiàn)桿菌與弧菌濃度比為0.1時就能產(chǎn)生明顯的抑菌圈，但抑菌率始終維持在較低的數(shù)值，且36 h后抑菌圈內(nèi)桿菌將逐漸被弧菌競爭性抑制使得抑菌圈逐漸變小；液態(tài)頡頏培養(yǎng)法中顯示當(dāng)桿菌與弧菌濃度比大于等于1時，24 h后抑菌率穩(wěn)定維持80%以上。當(dāng)濃度比達(dá)100時抑制率最高，作用時間最短；黃汝添等[14]從枯草芽孢桿菌（Bs-1）中分離出對副溶血弧菌的有抑制效果的抗菌物質(zhì)，每升海水中加入4 mL該物質(zhì)（4×106CFU/mL）對濃度為104CFU/mL的副溶血弧菌有抑菌效果；而本文研究結(jié)果顯示在不提取抗菌物質(zhì)的前提下，1：1的濃度比已能達(dá)到良好的抑菌效果，100：1的濃度比可在短時間內(nèi)完全抑制弧菌生長。

本實驗在得出枯草芽孢桿菌對副溶血弧菌有明顯頡頏作用的基礎(chǔ)上，從不同濃度比例和時間維度上分析枯草芽孢桿菌對副溶血弧菌的抑制特點，對于副溶血弧菌爆發(fā)時的病原濃度不同、處理時間不同，應(yīng)采用不同的濃度比。通過實驗看出當(dāng)枯草芽孢桿菌與副溶血弧菌的比例為100：1時，枯草芽孢桿菌對副溶血弧菌的頡頏作用最為明顯，4 h時培養(yǎng)液中就檢測不到副溶血弧菌；比例為50：1時8 h時培養(yǎng)液中就檢測不到副溶血弧菌；比例為10：1時，24 h后仍能保持88%以上的抑菌率；比例大于等于1時，枯草芽孢桿菌對副溶血弧菌的頡頏作用明顯；比例小于1時，會產(chǎn)生頡頏作用但效果不穩(wěn)定。綜上結(jié)果表明，基于對枯草芽孢桿菌添加成本的考慮，不同時段枯草芽孢桿菌最適使用濃度不同。4 h內(nèi)投放枯草芽孢桿菌最適濃度比為50：1；8 h內(nèi)投放最適濃度比為10：1；8 h后間歇性投放濃度比為1：1的枯草芽孢桿菌。

該研究通過跟蹤監(jiān)測枯草芽孢桿菌和副溶血弧菌不同濃度比的拮抗作用，尋找到一種較為合適的用藥濃度和用藥頻率，為減少抗生素在水產(chǎn)養(yǎng)殖防控弧菌中的使用提供了可行的途徑。

圖5 抑菌圈內(nèi)菌種革蘭氏染色觀察Fig.5 Gram staining of strains in the inhibition zone