黃 兵，韓紅玉，董 輝，趙其平，朱順海

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部動物寄生蟲學(xué)重點實驗室，上海 200241）

0 前言

球蟲（Coccidia）隸屬于頂復(fù)器門（Apicomplexa Levine，1970）、孢子蟲綱（Sporozoasida Leuckart，1879）、真球蟲目（Eucoccidiorida Léger and Duboscq，1910）的原蟲，廣義的球蟲范圍包括真球蟲目中隱球蟲亞目（Adeleorina L é ger，1911）和艾美耳球蟲亞目（Eimeriorina L é ger，1911）所含的種類近2000種，其中艾美耳球蟲亞目的種類約1500種，隸屬于10科37屬；狹義的球蟲范圍主要指艾美耳球蟲亞目中艾美耳科（Eimeriidae Minchin，1903）所含的種類，約有1300多種，隸屬于16屬，其中艾美耳屬（EimeriaSchneider，1875）的球蟲超過1000種[1]。據(jù)統(tǒng)計，全世界已在無脊椎動物和脊椎動物發(fā)現(xiàn)艾美耳科球蟲2599種，其中在哺乳類1028種、鳥類734種、爬行類456種、兩棲類53種、魚類314種、無脊椎類14種[2]。球蟲病是危害動物健康的一類重要原蟲病，特別對養(yǎng)禽業(yè)的危害巨大，每年可導(dǎo)致上億元的經(jīng)濟損失。幾十年來我國在球蟲與球蟲病防治研究方面做了大量工作，僅從中國知網(wǎng)以“球蟲”作為主題檢出的各類文獻達13 000多條。

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所（原：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海家畜寄生蟲病研究所、中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海家畜血吸蟲病研究所）是我國從事球蟲與球蟲病防治研究的主要單位之一，開發(fā)的國家二類新獸藥——地克珠利曾獲得國家科技進步三等獎，研制的抗球蟲病DLV三價疫苗是國內(nèi)首個獲得國家新獸藥證書的球蟲疫苗，起草制訂了第1個球蟲病診斷技術(shù)國家標準，在國內(nèi)外發(fā)表球蟲相關(guān)研究報告300多篇。回顧過去近40年的工作，主要在以下幾個方面取得重要進展。

1 流行病學(xué)

球蟲在我國畜禽中分布十分廣泛，種類較多。史天衛(wèi)等[3]（1989）對上海地區(qū)雞球蟲種類進行了初步調(diào)查，記錄了雞的6種艾美耳球蟲。據(jù)文獻記載[4-6]，在我國的馬、駱駝、牛、羊、豬、犬、貓、兔、雞、鴨、鵝、鴿、鵪鶉等已檢出球蟲145種（表1），其中艾美耳球蟲122種，等孢球蟲（IsosporaSchneider, 1881）13種，泰澤球蟲（TyzzeriaAllen，1936）6種，溫揚球蟲（WenyonellaHoare，1933）4種；球蟲分布達到15個及以上省市自治區(qū)的有41種，包括雞球蟲9種、牛球蟲5種、兔球蟲11種、羊球蟲9種、豬球蟲5種、鴨球蟲2種（表2）；還鑒定命名了11個新種，包括艾美耳球蟲10種和等孢球蟲1種（表3）。經(jīng)調(diào)查，1）上海雞場的球蟲感染率通常在45%以上，1/3雞場感染率達90%～100%；球蟲陽性雞的感染強度（每克糞便卵囊數(shù)，OPG）為400～63 800個，平均OPG為32 114個，超過50%雞場的OPG在48 000個以上；鑒定出6種球蟲，即柔嫩艾美耳球蟲（E. tenella）、毒害艾美耳球蟲（E. necatrix）、巨型艾美耳球蟲（E. maxima）、堆型艾美耳球蟲（E. acervulina）、變位艾美耳球蟲（E. mivati）以及緩艾美耳球蟲（E. mitis）[7]。2）上海鴨場的球蟲感染率為61%，3月齡以內(nèi)鴨的感染率為100%；球蟲陽性鴨的OPG為300～112 200，平均OPG為4 841；鑒定出10種球蟲，其中艾美耳屬6種、溫揚屬3種、等孢屬1種[8,9]。3）上海部分鴿場的球蟲感染率為52.8%，球蟲陽性鴿的OPG為300～512 400，平均OPG為50 159個，肉鴿的感染率（55.2%）和平均OPG（52 110個）均高于信鴿（40.9%和37 583個）；鑒定出5種球蟲，即拉氏艾美耳球蟲（E. labbeana）、鴿艾美耳球蟲（E.columbae）、原鴿艾美耳球蟲（E. columbarum）、杜氏艾美耳球蟲（E. duculai）和卡氏艾美耳球蟲（E. kapotei），拉氏艾美耳球蟲為肉鴿的優(yōu)勢種，原鴿艾美耳球蟲為信鴿的優(yōu)勢種[5]。4）上海17個奶牛場（2005年-2006年）的球蟲感染率為40.82%（10%～63.64%），平均OPG為1919個（100～43 500個），鑒定出6種球蟲，分別是牛艾美耳球蟲（E.bovis）、橢圓艾美耳球蟲（E. ellipsoidallis）、邱氏艾美耳球蟲（E. zürnii）、懷俄艾美耳球蟲（E.wyomingensis)、柱狀艾美耳球蟲（E. cylindrica）和亞球形艾美耳球蟲（E. subspherica）[10]。上海24個奶牛場（2010年～2011年）的球蟲感染率為47.12%，平均OPG為3181個，感染率和OPG均隨牛月齡的增長而下降，鑒定出10種球蟲，除前面提及的6種外，另檢出阿拉巴馬艾美耳球蟲（E. alabamensis）、奧博艾美耳球蟲（E. auburnensis）、巴西利亞艾美耳球蟲（E. brasiliensis）和皮利他艾美耳球蟲（E. pellita）[11]。全國6個省市自治區(qū)（2010年）27個奶牛場435份糞樣，除北京1個場9份糞樣未檢出球蟲外，其余5個省市自治區(qū)的26個奶牛場全部檢出球蟲，426份糞樣的球蟲檢出率為50.94%，平均OPG為3158個[12]。5）青海省4縣324份牦牛糞樣（2010年11月～2011年1月），球蟲陽性率為34.9%，平均OPG為251，1歲內(nèi)犢牛的感染率和OPG均顯著高于1歲以上青年牛和成年牛，鑒定出14種球蟲，除前面提及的10種外，還檢出加拿大艾美耳球蟲（E. canadensis）、伊利諾斯艾美耳球蟲（E.illinoisensis）、孟買艾美耳球蟲（E. bombayansis）和布基隆艾美耳球蟲（E. bukidnonensis）[13]。

表1 我國檢出的畜禽球蟲種類Table 1 The Coccidian species of livestock and poultry in China

（續(xù)上表）

表2 分布達15個省市自治區(qū)的41種球蟲Table 2 41 species of Coccidia distributed in 15 or more provinces, municipalities and autonomous regions

表3 國內(nèi)新發(fā)現(xiàn)的11個球蟲新種Table 3 11 new species of Coccidia identi fied in China

（續(xù)上表）

2 蟲種分離

球蟲的純種分離是進行球蟲形態(tài)學(xué)、遺傳學(xué)、分子生物學(xué)、體外培養(yǎng)、免疫學(xué)以及藥物篩選等研究的基礎(chǔ)與前提條件，進行球蟲純種分離的常用方法是單卵囊分離。我們采用該方法，先后分離獲得了柔嫩艾美耳球蟲[14]、毒害艾美耳球蟲[15]、堆型艾美耳球蟲[16]、變位艾美耳球蟲[17]、巨型艾美耳球蟲[18]等5種球蟲的純種，對該5種球蟲和布氏艾美耳球蟲[19]的基本生物學(xué)特征和致病性進行了測定。觀察了柔嫩艾美耳球蟲配子體生殖階段的超微結(jié)構(gòu)[20]，檢測了柔嫩艾美耳球蟲、毒害艾美耳球蟲、變位艾美耳球蟲的卵囊排泄期[21]和該3種球蟲的交叉免疫保護效果[22]，規(guī)范了雞球蟲的分離、培養(yǎng)、鑒定、保存方法[23]。隨后，又對實驗室保存的6種11株雞球蟲進行了單卵囊純化，經(jīng)對單卵囊分離物進行鑒定，發(fā)現(xiàn)保存的布氏艾美耳球蟲被柔嫩艾美耳球蟲污染[24]。對實驗室確定為純種的5種12株雞球蟲，進行了線粒體細胞色素C氧化酶Ⅰ亞基（mtCOI）基因片段序列的克隆和同源性與系統(tǒng)進化分析，結(jié)果顯示球蟲同種不同株間的同源性為100%，異種間為86.1%～98.4%，說明mtCOI基因可成為區(qū)分雞球蟲不同種的理想靶基因[25]。王鑫等[26]（2009）、蔡蘭等[27]（2011）分別用18S rDNA基因?qū)嶒炇冶４娴?種8株、4種15株雞艾美耳球蟲進行系統(tǒng)進化分析，結(jié)果球蟲不同種間的同源性為96.5%～98.1%和94.6%～99.4%，巨型艾美耳球蟲不同株間的同源性為98.7%～99.3%和96.9%～99.8%，柔嫩艾美耳球蟲不同株間的同源性為99.7%～99.9%和99.0%～99.9%，說明18S rDNA基因不僅可以區(qū)分不同種，還有可能成為區(qū)分同種不同株的理想靶基因。這些研究結(jié)果為雞球蟲的分子遺傳學(xué)鑒定提供了實驗基礎(chǔ)。

3 診斷技術(shù)

球蟲病的診斷以病原學(xué)檢查為主，在臨床上常結(jié)合臨床癥狀和病理剖檢。為使球蟲病的診斷更加規(guī)范和便于操作，在全國動物檢疫標準化技術(shù)委員會的指導(dǎo)下，我們起草了“動物球蟲病診斷技術(shù)”國家標準，由國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局于2002年2月正式發(fā)布（GB/T 18647-2002）[28]。該標準適用于禽類和兔的球蟲病（感染）的診斷，包括病原檢查和病理檢查兩部分，詳細敘述了每項檢查的操作步驟和判定依據(jù)，已在動物進出口檢驗檢疫和現(xiàn)場球蟲病的診斷中廣泛使用。隨著人們對大家畜（特別是奶牛）球蟲病的重視，我們在進行奶牛球蟲感染情況調(diào)查的基礎(chǔ)上，對奶牛球蟲卵囊的檢測方法進行了研究[29]，考察了6種卵囊漂浮液分別對4種奶牛糞便量的球蟲檢測效果，確定飽和鹽水為奶牛球蟲卵囊檢測漂浮液，10 g為合適的糞便取樣量，為建立奶牛球蟲病診斷技術(shù)標準奠定了基礎(chǔ)。在逐步規(guī)范奶牛球蟲病病原檢測方法的同時，也開展了奶牛球蟲感染PCR診斷方法的研究[30]，用提取的奶牛球蟲基因組DNA進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后條帶單一而清晰，孢子化卵囊和未孢子化卵囊均能擴增出大小相同的片斷，經(jīng)特異性檢測，作為對照樣品的安氏隱孢子蟲（Cryptosporidium andersoni）、剛地弓形蟲（Toxoplasma gondii）、柔嫩艾美耳球蟲（E.tenella）基因組DNA均無相同的擴增條帶，實驗顯示其最少卵囊檢出量為5000 個/mL，臨床樣品檢測顯示最少檢出量的OPG為2780 個，該方法還有待進一步完善。

4 藥物防治

自1939年發(fā)現(xiàn)磺胺類藥物具有抗球蟲效果以來，國內(nèi)外使用過的抗球蟲藥物品種已超過30種，包括3大類，屬于離子載體類抗球蟲藥有莫能菌素（Monensin）、拉沙里菌素（Lasalocid）、鹽霉素（Salinomycin）、那拉霉素（Narasin）、馬杜霉素（Maduramicin）、賽杜霉素（Semduramycin）和海南霉素（Hainanmycin）等及相關(guān)制劑，屬于化學(xué)合成類抗球蟲藥主要有磺胺喹噁啉（Sulfaquinoxaline）、尼卡巴嗪（Nicarbazin）、呋喃唑酮（Furazolidone）、球痢靈（Zoalene）、氨丙啉（Amprolium）、磺胺氯吡嗪（Sulfachlorpyrazine）、氯羥吡啶（Clopidol）、磺胺間二甲氧嘧啶（Sulfadimethoxine）、癸氧喹酯（Decoquinate）、氯苯胍（Robenidine）、氟腺呤（Arprinocid）、常山酮（Halofuginone）、妥曲珠利（Toltrazuril）和地克珠利（Diclazuril）等及相關(guān)制劑，屬于中草藥類抗球蟲藥主要有青蒿、驅(qū)球凈、五草湯、敵球靈和白頭翁散等。這些抗球蟲藥的使用，為有效控制畜禽球蟲病、促進養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展做出了重大貢獻。

上海獸醫(yī)研究所從事球蟲病藥物防治研究近40年，建立了一套完善的抗球蟲藥物臨床試驗方法，先后完成了氯苯胍、蒽環(huán)類抗生素80334、尼卡巴嗪、馬杜霉素、海南霉素、地克珠利等藥物的抗雞球蟲病臨床試驗。率先開展了國產(chǎn)氯苯胍防治雞球蟲病研究，進行了氯苯胍對雞球蟲病的籠飼試驗與田間試驗、對雞的安全試驗、新舊工藝產(chǎn)品的療效對比試驗等，該項研究獲得1980年上海市農(nóng)業(yè)科技成果二等獎[31,32]。與上海醫(yī)藥工業(yè)研究院合作，開展了蒽環(huán)類抗生素80334防治雞球蟲病研究，進行了防治柔嫩艾美耳球蟲病籠飼試驗[33]、雞球蟲混合感染試驗[34]、不同地理株防治試驗[35]、野外試驗[36]、對雞的安全試驗[37]、在雞體內(nèi)殘留動態(tài)[38]、對柔嫩艾美耳球蟲作用后裂殖體超微結(jié)構(gòu)觀察[39]等，該項研究獲得1984年中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院技術(shù)改進三等獎[40]。與上海醫(yī)藥工業(yè)研究院合作，開展了尼卡巴嗪防治雞球蟲病研究，進行了籠飼試驗[41]、雞體內(nèi)殘留量測定[42]、田間試驗與安全試驗[43]、對雞球蟲免疫力產(chǎn)生影響的觀察[44]等，該項研究獲得1990年國家醫(yī)藥管理局科技進步三等獎[45]。與美國氰胺公司合作，承擔(dān)了馬杜霉素進口注冊的抗雞球蟲病臨床驗證工作，分別完成了籠飼試驗[46]和田間試驗[47]。自主研制開發(fā)了抗球蟲病新藥地克珠利，用原料藥或預(yù)混劑進行了防治雞柔嫩艾美耳球蟲試驗[48]、不同劑量的藥效試驗[49]、防治雞球蟲病現(xiàn)場試驗[50]、防治雞球蟲不同地理株試驗[51]、防治雞球蟲5個蟲種的籠飼試驗[52]等，原料藥和0.5%預(yù)混劑于1997年4月率先獲得農(nóng)業(yè)部頒發(fā)的新獸藥證書[（97）新獸藥證字第03號、04號]，該項研究分別獲得1998年農(nóng)業(yè)部科技進步二等獎和1999年國家科技進步三等獎[53]。同時開發(fā)了0.5%地克珠利溶液，考察了其預(yù)防雞球蟲病的效果[54]，于1999年4月獲得農(nóng)業(yè)部頒發(fā)的新獸藥證書[（99）新獸藥證字第04號]，該項研究獲得2000年中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科學(xué)技術(shù)二等獎[55]。與江蘇省常州市第二制藥廠合作，開展了海南霉素防治雞球蟲病研究，進行了該藥對5種雞球蟲的藥效試驗[56]、防治雞球蟲病舍飼試驗[57]，雞球蟲廣州分離株的療效試驗[58]、雞球蟲病的預(yù)防和治療效果評價[59]等，該產(chǎn)品為我國第一個獲得一類新獸藥證書的原創(chuàng)性抗球蟲藥。此外，還進行了水溶性氨丙啉防治柔嫩艾美耳球蟲籠飼試驗，經(jīng)連續(xù)7 d飲水給藥，其抗球蟲指數(shù)（anticoccidiosis index，ACI）達188，試驗組飲水量與健康對照組無顯明差異[60]；比較了地克珠利、常山酮、氯羥吡啶、馬杜霉素、鹽霉素預(yù)防柔嫩艾美耳球蟲的效果，其ACI，地克珠利、常山酮、馬杜霉素均在192以上，氯羥吡啶為168～180，鹽霉素為165～171[61]；進行了地克珠利、拉沙里菌素、莫能菌素防治現(xiàn)場奶牛球蟲病研究，連續(xù)用藥9 d后奶牛的球蟲卵囊減少率分別為78.91%、80.92%、98.82%[62]；開展了地克珠利、磺胺喹惡啉鈉、磺胺氯吡嗪鈉、托曲珠利、白頭翁散等5種藥物對肉鴿球蟲病的防治試驗，其相對卵囊減少率，2種磺胺藥均在98%以上，白頭翁散為91%～99%，托曲珠利為88%～93%，地克珠利為67.4%～79.6%[63]。近年還研制與測定了中草藥制劑TF-103[64]、化學(xué)合成藥納川珠利（Nitromezuri）[65,66]與沙咪珠利（Acetamizuril）[67]的抗球蟲效果，有望開發(fā)成新的抗球蟲藥。

5 抗藥性檢測

任何一種抗球蟲藥的長期或不合理使用，都會導(dǎo)致球蟲耐藥性的產(chǎn)生。定期檢測現(xiàn)場球蟲對抗球蟲藥物的耐受程度，將有助于制訂合理的用藥方案，有效控制球蟲病的發(fā)生，減少因球蟲病造成的經(jīng)濟損失。檢測球蟲耐藥性的方法有籠飼試驗法、雞胚試驗法、細胞培養(yǎng)試驗法、聚丙烯酰胺凝膠電泳法、同工酶電泳測定法、PCR測定法等，其中籠飼試驗法中又采用卵囊產(chǎn)量、病變記分、增重、最適抗球蟲活性百分率、糞便記分比率、抗球蟲指數(shù)等單項或多項指標進行評定[68,69]?？追爆幍萚70]（1994）在檢測我國12個省區(qū)15株柔嫩艾美耳球蟲對5種抗球蟲藥物的敏感性時，率先采用最適抗球蟲活性百分率（percent of optimum anticoccidial activity，POAA）、病變記分減少率（reduction of lesion scores，RLS）、相對卵囊產(chǎn)量（relative oocyst production，ROP）3項指標綜合評價所測球蟲株對藥物的抗藥程度，分為敏感（-）、輕度抗藥（+）、中度抗藥（++）、嚴重抗藥（+++）4個等級。黃兵等[71]在對上海一雞場球蟲進行3種抗球蟲藥物的抗藥性檢測中，在POAA、RLS、ROP的基礎(chǔ)上增加了抗球蟲指數(shù)（ACI），采用4項指標進行抗藥性評價，分為敏感（-）、輕度抗藥（+）、中度抗藥（++）、嚴重抗藥（+++或++++）4個等級。隨后在對上海9個區(qū)縣10個雞場的球蟲進行6種藥物的抗藥性檢測中[72]，繼續(xù)采用了POAA、RLS、ROP、ACI 4項指標來評判所檢測球蟲的抗藥性，結(jié)果達到中度及以上抗藥程度的百分比為莫能霉素100%、氨丙啉90%、氯羥吡啶80%、馬杜霉素50、氯苯胍10%、地克珠利為0。陳兆國等[73]從4項指標各自的特點、評價結(jié)果的一致性、其他指標、試驗總體結(jié)果等4個方面，對采用POAA、RLS、ROP、ACI進行球蟲抗藥性判定的準確性進行了評價，認為該綜合評定球蟲抗藥性的方法是有效的、可靠的。我們根據(jù)現(xiàn)場球蟲抗藥性的檢測結(jié)果，對相關(guān)雞場提出了合理使用抗球蟲藥的建議方案，在試驗基地采取了預(yù)防或減少抗藥性產(chǎn)生的措施，有效地控制了雞球蟲病的發(fā)生，提高了養(yǎng)雞場的經(jīng)濟效益，該項目獲得2003年上海市科技進步獎三等獎[74]。至今，POAA、RLS、ROP、ACI 4項指標已在檢測雞球蟲抗藥性中廣泛應(yīng)用，如檢測廣東[58,75,76]、陜西[77-79]、安徽[80-82]、江蘇[80,83,84]、甘肅[85]、青海[86]、河北[87,88]、吉林[89,90]、廣西[91]、浙江[92]等省地區(qū)相關(guān)雞場球蟲對抗球蟲藥物的抗藥性，均采用這4項指標進行判定。

此外，還誘導(dǎo)獲得了柔嫩艾美耳球蟲地克珠利抗藥株和馬杜拉霉素抗藥株[93]，構(gòu)建了2個抗藥株與敏感株的差異表達基因消減cDNA文庫，發(fā)現(xiàn)一些可能與耐藥性產(chǎn)生相關(guān)的基因（如柔嫩艾美耳球蟲半胱氨酸蛋白酶基因）[94]，用銀染mRNA差異顯示技術(shù)分析了抗藥株與敏感株之間的差異表達基因[96]，并比較了抗藥株與敏感株的18S rDNA基因序列和二級結(jié)構(gòu)差異[97]。從消減cDNA文庫中克隆和表達了與抗藥性相關(guān)的基因M20[97]。根據(jù)M20基因序列設(shè)計特異性引物，建立了SYBR Green real-time PCR和TaqMan Probe real-time PCR兩種用于檢測球蟲抗藥性的方法，并用SYBR Green real-time PCR法對現(xiàn)場分離的球蟲進行抗藥性檢測[98]。用雙向電泳技術(shù)對2個抗藥株與敏感株的第二代裂殖子[99]和孢子化卵囊[100,101]進行了蛋白質(zhì)差異分析，用質(zhì)譜技術(shù)分別鑒定了7個（地克珠利抗藥株4個、馬杜霉素抗藥株3個）差異明顯的蛋白質(zhì)斑點，對其結(jié)構(gòu)和功能進行了預(yù)測。通過對2個抗藥株進行基因重組獲得同時具備抗地克珠利和馬杜霉素的抗藥株重組體[102]，對雙重抗藥株、單重抗藥株和敏感株進行了乳酸脫氫酶、磷酸葡萄糖異構(gòu)酶、葡萄糖-6-磷酸脫氨酸的同工酶分析[103]。這些研究為深入探討球蟲的抗藥性機制奠定了基礎(chǔ)。

6 免疫預(yù)防

抗球蟲藥的廣泛使用，對有效控制球蟲病的危害，減少養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟損失發(fā)揮了重要作用。由于球蟲抗藥性的不斷產(chǎn)生，導(dǎo)致藥物效果不斷下降，生產(chǎn)者往往不得不增加藥物的使用劑量，致使藥物在畜禽體內(nèi)的殘留超標，為動物源性食品安全帶來潛在威脅。免疫預(yù)防是球蟲病防治的發(fā)展方向，既可改善球蟲的抗藥性，又能避免藥物殘留。上海獸醫(yī)研究所在上世紀90年初就開始了球蟲病的免疫預(yù)防研究，觀察了NTG處理球蟲誘導(dǎo)雛雞的保護性免疫[104]和腹腔注射短小棒狀桿菌誘導(dǎo)雛雞對球蟲的免疫保護[105]，評估了雙重致弱球蟲疫苗（DLV蟲苗）在實驗室和田間的免疫保護效果[106]，報道了6批中試產(chǎn)品在6個省市進行的24批區(qū)域試驗結(jié)果[107]，該疫苗于2000年獲得國家新獸藥證書[（2000）新獸藥證字第37號]，為國內(nèi)批準的第一個球蟲疫苗，該項研究先后獲得1997年上?？茖W(xué)技術(shù)進步獎二等獎（雞球蟲病綜合免疫預(yù)防的研究）[108]、2003年上?？茖W(xué)技術(shù)進步獎二等獎（雞球蟲混合苗在集約化雞場的應(yīng)用）[109]、2003年中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科學(xué)技術(shù)成果一等獎（雞球蟲三價混合疫苗（DLV苗）免疫預(yù)防研究）[110]。后來，又開展了球蟲早熟株的選育工作，先后成功選育柔嫩艾美耳球蟲早熟株[111]、堆型艾美耳球蟲早熟株[112]、巨型艾美耳球蟲早熟株[113]，其潛在期分別比母株縮短了23 h、15 h、35 h。進行了3種球蟲早熟株對8種抗球蟲藥的敏感性試驗，巨型艾美耳球蟲早熟株對地克珠利、氯苯胍、二硝托胺、癸氧喹酯、尼卡巴嗪、馬杜霉素、鹽霉素和拉沙里菌素均敏感，柔嫩艾美耳球蟲早熟株對鹽霉素輕度敏感、另7種藥物敏感，堆型艾美耳球蟲早熟株對鹽霉素輕度敏感、對二硝托胺不敏感、另6種藥物敏感[114,115]。研究了3種球蟲早熟株的免疫劑量，通過免疫保護效果比較，推薦每羽雞接種卵囊劑量分別為柔嫩艾美耳球蟲早熟株600個、堆型艾美耳球蟲早熟株600個、巨型艾美耳球蟲早熟株200個[116-118]。此外，還完成了早熟株疫苗的懸浮液、保存條件、保存時間、配制工藝等研究，已取得的研究結(jié)果為開發(fā)球蟲早熟株疫苗奠定了良好基礎(chǔ)。

7 體外培養(yǎng)

球蟲的體外培養(yǎng)是研究球蟲內(nèi)生發(fā)育、入侵機制、藥物篩選、蟲株致弱等的重要技術(shù)平臺，包括雞胚傳代和細胞培養(yǎng)兩部分。上海獸醫(yī)研究所在上世紀80年代初就進行了球蟲的雞胚傳代研究，曾在雞胚中連續(xù)傳柔嫩艾美耳球蟲120多代，測其致病性明顯減弱，但回雞后返強明顯。后又開展了雞腎細胞繁殖球蟲研究，成功在雞腎細胞培養(yǎng)物中觀察到柔嫩艾美耳球蟲完整的內(nèi)生性發(fā)育階段，從細胞培養(yǎng)物中收集的卵囊經(jīng)培養(yǎng)孢子化后感染雛雞獲得下一代卵囊[119]。為了提高雞胚培養(yǎng)球蟲卵囊的收獲量，我們又對雞胚的接種日齡、子孢子接種量、胰島素和葉酸的添加量等進行了研究，結(jié)果顯示，接種9日齡雞胚、每胚接種子孢子1×104個、在子孢子混懸液中加入胰島素1000 U/mL和葉酸0.05 mg/mL，在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d，是毒害艾美耳球蟲的雞胚培養(yǎng)適宜體系[120]；接種10日齡雞胚、每胚接種子孢子1×104個、在子孢子混懸液中加入胰島素100 U/mL，在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8～9 d，是柔嫩艾美耳球蟲的雞胚培養(yǎng)適宜體系[121]。首次將雞胚成纖維傳代細胞（DF-1）應(yīng)用于球蟲培養(yǎng)，建立了柔嫩艾美耳球蟲DF-1細胞培養(yǎng)體系，通過對細胞鋪板量、子孢子接種劑量、培養(yǎng)基中胎牛血清濃度等的摸索，優(yōu)化了球蟲細胞培養(yǎng)條件，并建立了流式細胞儀檢測子孢子入侵活力的方法，確定了檢測球蟲子孢子入侵活力的最佳時間，比較了球蟲子孢子對DF-1、MDBK（牛腎細胞）、Vero（猴腎細胞）、BHK（乳倉鼠腎細胞）、MDCK（犬腎細胞）等5種細胞的入侵活力，觀測了不同濃度的子孢子多抗血清對子孢子入侵DF-1細胞的抑制情況[122]。目前，球蟲體外培養(yǎng)技術(shù)已在球蟲分子生物學(xué)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。

8 分子生物學(xué)

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，對球蟲的研究已從宏觀的普通生物學(xué)深入到微觀的分子生物學(xué)，上海獸醫(yī)研究所對球蟲的研究也從流行病學(xué)調(diào)查與防治向核酸與蛋白質(zhì)擴展。開展了用聚丙烯酰胺凝膠電泳進行球蟲同工酶的初步研究[123]，檢測了柔嫩艾美耳球蟲未孢子化卵囊、孢子化卵囊、孢子囊的乳酸脫氫酶（LDH）、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G6PD）、異檸檬酸脫氫酶（IDH）、6-磷酸葡萄糖脫氫酶（6PGD）、磷酸葡萄糖變位酶（PGM）、堿性磷酸酶（ALP）、葡萄糖磷酸異構(gòu)酶（GPI）的同工酶[124]，研究了柔嫩艾美耳球蟲、毒害艾美耳球蟲、巨型艾美耳球蟲、變位艾美耳球蟲、堆型艾美耳球蟲的LDH、GPI、G6PD、ALP、6PGD的同工酶[125]。利用RT-PCR方法擴增、克隆了柔嫩艾美耳球蟲第二代裂殖子表面抗原基因（λMZ5-7）[126,127]和熱激蛋白（HSP）基因[128]，并在大腸桿菌中得到表達，經(jīng)檢測其重組蛋白具有抗原性，為進一步研究這些基因的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。應(yīng)用雜交瘤技術(shù)制備了抗柔嫩艾美耳球蟲A08蛋白（EtA08）和棒狀體蛋白（EtRP）的單克隆抗體，用單抗對EtRP在子孢子中的分布進行分子定位，觀測了經(jīng)單抗處理后對子孢子入侵細胞的影響，分析了EtA08基因在球蟲不同發(fā)育階段的轉(zhuǎn)錄情況，構(gòu)建了EtA08基因的畢赤酵母表達系統(tǒng)[119-131]。制備了柔嫩艾美耳球蟲乳酸脫氫酶（EtLDH）單克隆抗體，用單抗對EtLDH在第二代裂殖子中的分布進行了定位[132]。針對不同種雞球蟲的保護性抗原基因不同，先后構(gòu)建了柔嫩艾美耳球蟲孢子化卵囊cDNA文庫[133]、堆型艾美耳球蟲孢子化卵囊cDNA文庫[134]、毒害艾美耳球蟲孢子化卵囊cDNA文庫[135]、巨型艾美耳球蟲孢子化卵囊cDNA文庫[136]，對部分文庫進行了抗原基因的篩選[137]，經(jīng)擴增和序列分析，獲得堆型艾美耳球蟲巨噬細胞移動抑制因子基因[138]和堆型艾美耳球蟲1個新基因（GenBank登錄號：EU590120）[139]。為了篩選與雞球蟲入侵和發(fā)育相關(guān)基因，構(gòu)建了柔嫩艾美耳球蟲孢子發(fā)育階段抑制性消減文庫[140]，利用抑制性消減雜交技術(shù)（SSH）和cDNA微陣列技術(shù)，大規(guī)模篩選了柔嫩艾美耳球蟲子孢子和孢子化卵囊階段蟲體差異表達基因，獲得了大量差異表達基因的ESTs序列（Genbank登錄號：ES346882～ES346911、ES351351～ES351428和GR935578～GR935588）[141]。根據(jù)ESTs序列，利用RACE技術(shù)擴增全長基因獲得了11個含完整開放閱讀框的新基因，對一些重要基因功能進行了初步研究，包括EtSerpin[142]，EtAMA1[143]，EtCDPK3[144]，EtPDI[145]，EtLDH[146]，EteIF3[147]，EtCHP559[148]等。部分功能基因在原核表達系統(tǒng)或畢赤酵母表達系統(tǒng)或動物細胞中獲得表達，包括新基因ZB7-C11（Genbank登錄號：GU553107）[149]、EtSAG[150]、新基因ZL583（Genbank登錄號：HQ877408）[151]、EteIF3d[152]、EtCDPK3[153,154]、EtRON2[155]、EtLDH[156]、EtSIR2[157]和EtSerpin[158]等，對獲得的部分重組蛋白進行了免疫保護性初步研究。構(gòu)建了柔嫩艾美耳球蟲子孢子[159]和裂殖子[160]酵母雙雜交cDNA文庫，利用酵母雙雜交技術(shù)以EtAMA1為誘餌在構(gòu)建的子孢子文庫中篩選到與之相互作用的相關(guān)蛋白14個。對其中3個EST序列進行擴增，其基因全長與基因組數(shù)據(jù)庫比對，確定分別為柔嫩艾美耳球蟲保守假象蛋白（EtCHP559）[161]、柔嫩艾美耳球蟲胱硫醚β合成酶（EtCBS）[162]、柔嫩艾美耳球蟲絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（EtSTK）[163]，分別構(gòu)建了這3個基因的真核重組表達質(zhì)粒，在DF-1細胞中獲得表達。還構(gòu)建了柔嫩艾美耳球蟲鈣依賴蛋白激酶4（EtCDPK4）酵母雙雜交誘鉺質(zhì)粒，經(jīng)檢測沒有自激活活性和細胞毒性，能在酵母細胞中表達，為篩選EtCDPK4的互作蛋白奠定了基礎(chǔ)[164]。獲得這些與球蟲入侵、發(fā)育相關(guān)的關(guān)鍵分子或基因，對進一步探討球蟲的入侵與內(nèi)生性發(fā)育機制、發(fā)現(xiàn)新的抗球蟲疫苗候選分子和藥物作用靶標等具有重要意義。

10 展望

回顧我所幾十年從事球蟲生物學(xué)與球蟲病防治研究的歷程，老一輩科學(xué)家注重科研與生產(chǎn)的結(jié)合，以解決養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展中的難點作為科研攻關(guān)重點，在雞球蟲病的藥物防治和免疫預(yù)防研究領(lǐng)域取得了輝煌業(yè)績；中青年一代繼承老一輩的優(yōu)良傳統(tǒng)，除繼續(xù)加強抗球蟲新藥物和球蟲疫苗研究外，在球蟲病的流行病學(xué)調(diào)查、球蟲的純種建立與長期保存、體外培養(yǎng)、抗藥性檢測、球蟲入侵與發(fā)育相關(guān)基因的功能研究等方面也取得了長足發(fā)展。展望未來，任務(wù)艱巨，還有許多難題需要青年一代去攻堅克難。1）在球蟲病藥物防治研究方面，由于新藥研制的周期長、投入大，應(yīng)重點加強現(xiàn)場球蟲的耐藥性監(jiān)測，制訂合理與合規(guī)的藥物使用程序，研究消除或延緩球蟲耐藥性產(chǎn)生的方法，適當(dāng)研制與開發(fā)現(xiàn)有藥物的新制劑，延長現(xiàn)有抗球蟲藥物的生命周期。2）在球蟲病免疫預(yù)防研究方面，由于我國畜禽球蟲種類多、分布廣，應(yīng)重點加強主要畜禽球蟲病的多價弱毒活疫苗研究，同時積極篩選具有種、屬特征和較好免疫保護效果的抗原，尋找合適的多抗原表達載體，為研制球蟲基因工程疫苗奠定基礎(chǔ)。3）在球蟲的基礎(chǔ)研究方面，由于球蟲具有較強的宿主特異性、組織特異性和細胞特異性，應(yīng)重點加強不同球蟲的全基因組測序，尋找不同球蟲侵入不同宿主和定位于不同組織與不同細胞的關(guān)鍵分子，為闡明球蟲的入侵與發(fā)育機制提供基礎(chǔ)。4）在球蟲的體外培養(yǎng)研究方面，繼續(xù)尋找或建立能用于體外完成整個球蟲生活史的合適細胞株，為基因編輯技術(shù)有效用于球蟲研究提供基礎(chǔ)。

球蟲病仍是目前和未來較長時間里嚴重危害我國養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的重要寄生蟲病，上海獸醫(yī)研究所作為我國球蟲與球蟲病防治研究領(lǐng)域的國家隊，不論是基礎(chǔ)研究還是應(yīng)用研究，都應(yīng)面向世界農(nóng)業(yè)科技前沿，面向國家重大需求，面向現(xiàn)代農(nóng)業(yè)建設(shè)主戰(zhàn)場，在國家實施鄉(xiāng)村振興戰(zhàn)略中，為提升農(nóng)業(yè)發(fā)展質(zhì)量、促進農(nóng)村社會穩(wěn)定、增加農(nóng)民經(jīng)濟收入做出應(yīng)有的貢獻。