李智超，王友令，徐騰飛，栗永華，車(chē)路平，劉盼嬈，仇旭升，孫英杰，譚 磊，廖 瑛，宋翠萍，丁 鏟，姚 剛，孟春春，王金泉

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241；3.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所，濟(jì)南 250023）

雞傳染性支氣管炎（infectious bronchitis，IB）是臨床常見(jiàn)疾病之一，呈世界范圍流行，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為B類(lèi)傳染病。雞傳染性支氣管炎是由冠狀病毒科、冠狀病毒屬中的傳染性支氣管炎病毒（Infectious bronchitis virus，IBV）引起的一種急性、高度接觸性傳染性呼吸道疾病[1]。IBV基因組為單股不分節(jié)段的正鏈RNA，基因組長(zhǎng)約27.6 kb[2]，具有5'端帽子結(jié)構(gòu)和3'端poly(A)結(jié)構(gòu)，包含5'Cap-Replicase-S-3a-3b-3c/E-M-5a-5b-N-poly(A)3'至少10個(gè)以上開(kāi)放性閱讀框（open reading frame，ORF）[3]，可轉(zhuǎn)錄出6種亞基因組mRNA（Gene1～6）[4]。IBV的5'和3'端均存在非轉(zhuǎn)錄區(qū)（untranslated region，UTR）[5]。病毒基因組的5'端為復(fù)制酶（Replicase）基因（Gene1）大小約為20 kb，包含了非編碼區(qū)5'UTR和編碼具有活性的聚合酶的ORF1a和ORF1b獨(dú)特編碼區(qū)[6]，分別編碼440 kDa和300 kDa多肽，下游的ORF1b可通過(guò)核糖體移碼作用與上游的ORF1a形成700 kDa多聚蛋白pp1ab，ORF1a和ORF1b編碼了15種非結(jié)構(gòu)蛋白[7]，在RNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和病毒復(fù)制中發(fā)揮重要作用。IBV的3'端包含Gene2～6，其中基因2、3、4、6分別編碼病毒的纖突蛋白（S）、小膜蛋白（E）、膜蛋白（M）和磷酸化的核衣殼蛋白（N）[8]。Gene3和Gene5是多順子結(jié)構(gòu)，是分散在編碼結(jié)構(gòu)蛋白的ORF之間的輔助基因，Gene3含有分別編碼3a、3b和3c/E的3個(gè)ORF，Gene5含有分別編碼5a和5b的2個(gè)ORF[9]。3a、3b、5a及5b均為非結(jié)構(gòu)蛋白，M和E蛋白是形成病毒樣顆粒和病毒出芽及裝配所需的膜相關(guān)蛋白[10]。N蛋白是磷酸化的核蛋白，與病毒RNA合成有關(guān)[11]。S蛋白是病毒的主要免疫原蛋白，在體內(nèi)翻譯后由宿主蛋白酶切割為N端的S1和C端的S2，S1亞基附著于病毒包膜，負(fù)責(zé)病毒包膜和宿主細(xì)胞膜的融合[12]，S1糖蛋白含有誘導(dǎo)病毒中和、血清型特異性抗體、血凝抑制抗體和交叉反應(yīng)ELISA抗體的抗原表位[13]，并且在病毒組織嗜性和毒力中起重要作用。

當(dāng)前我國(guó)IB呈現(xiàn)常發(fā)態(tài)勢(shì)，尤其在IB免疫雞群中經(jīng)常爆發(fā)IBV強(qiáng)毒感染[14,15]，本實(shí)驗(yàn)室在河北邯鄲某肉雞場(chǎng)中分離到1株IBV，將其命名為CK/CH/HD/171018，并對(duì)其進(jìn)行了毒力測(cè)定和全基因組序列擴(kuò)增與分析，為日后預(yù)防和控制IBV提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 毒株、SPF雞和SPF雞胚IBV分離株CK/CH/HD/171018分離自河北邯鄲某免疫過(guò)IB（H120株）疫苗的發(fā)病商品肉雞群。SPF雞和SPF雞胚購(gòu)自北京梅里亞公司。

1.2 菌種、載體及主要試劑Trizol購(gòu)于Thermo Fisher Scientific，pMD19-T克隆載體購(gòu)自寶生物工程大連有限公司，DH5α及普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購(gòu)于天根生化科技有限公司，5'-full RACE試劑盒、3'-full RACE試劑購(gòu)于北京天恩澤基因科技有限公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)及合成根據(jù)GenBank發(fā)表的所有IBV的全基因組序列，應(yīng)用DNAStar軟件包中的Clustal W方法進(jìn)行比對(duì)，選擇保守區(qū)域，進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，引物序列及相關(guān)信息見(jiàn)表1，引物送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.4 病毒增殖與鑒定取IBV分離株CK/CH/HD/171018通過(guò)尿囊腔途徑接種10日齡SPF雞胚，去除24 h之內(nèi)死亡的胚，收集36 h雞胚的尿囊液，-80℃保存。盲傳3代，進(jìn)行HA檢查陰性和侏儒胚陽(yáng)性檢查，同時(shí)取適量病毒按Trizol試劑說(shuō)明書(shū)提取病毒基因組RNA，應(yīng)用RT-PCR擴(kuò)增S1基因并進(jìn)行序列鑒定。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

1.5 SPF雞致病性實(shí)驗(yàn)取3日齡SPF雛雞20羽，隨機(jī)分為2組，每組10羽，分別經(jīng)滴鼻點(diǎn)眼接種105.0EID50IBV分離株CK/CH/HD/171018株尿囊液及PBS，0.2 mL/羽，分兩個(gè)隔離器飼養(yǎng)，連續(xù)觀(guān)察14 d，記錄接種雞的精神狀況及發(fā)病癥狀，對(duì)發(fā)病死亡雞進(jìn)行剖檢并記錄氣管、肺臟及腎臟等病理變化。

1.6 病毒基因組的擴(kuò)增

1.6.1 病毒RNA的提取 取適量病毒按Trizol試劑說(shuō)明書(shū)提取病毒基因組RNA。

1.6.2 基因組不同片段RT-PCR擴(kuò)增 根據(jù)引物Tm值，擴(kuò)增反應(yīng)熱循環(huán)參數(shù)：針對(duì)P1～P9、P11～P16對(duì)引物，95℃預(yù)變性5 min，94℃變性1 min、55℃退火1 min，72℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min；針對(duì)P10及P17～P32引物，95℃預(yù)變性5 min、94℃變性1 min、52℃退火1 min，72℃ 延伸2 min，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸 10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳或4℃保存。

1.6.3 5'和3'RACE方法擴(kuò)增病毒的5'端及3'端序列 按北京天恩澤基因科技有限公司試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。PCR反應(yīng)結(jié)束后，取20 μL的PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢查PCR結(jié)果，確認(rèn)后進(jìn)行DNA測(cè)序。

1.7 目的基因克隆按普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒說(shuō)明書(shū)分別將擴(kuò)增的目的片段回收純化，克隆至pMD19-T載體并進(jìn)行測(cè)序。

1.8 序列拼接和基因組全序列的生物信息學(xué)分析根據(jù)GenBank中參考毒株的基因序列，利用DNAStar.Lasergene.v7.1生物軟件中的Cluster W方法，將CK/CH/HD/171018與參考毒株進(jìn)行比較后各基因片段拼接，并對(duì)其全基因組和各個(gè)基因片段分別與IBV參考株進(jìn)行同源性比較。利用MEGA7軟件將CK/CH/HD/171018株的全基因組與57個(gè)國(guó)內(nèi)外參考毒株的全基因組進(jìn)行序列比對(duì)并構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹(shù)。應(yīng)用RDP3軟件分析病毒全基因組序列中基因重組情況，運(yùn)用RDP、GENECONV、BootScan、MaxChi、Chimaera、SiScan、3Seq 7種重組分析方法來(lái)確定重組事件，運(yùn)用Simplot軟件進(jìn)一步確定重組事件及其重組斷點(diǎn)。

2 結(jié)果

2.1 IBV分離株CK/CH/HD/171018對(duì)SPF雞胚致病性將IBV CK/CH/HD/171018株接種10日齡的SPF雞胚，傳至第3代時(shí)可見(jiàn)胎兒發(fā)育障礙、胚體頭背部局部出血、胚體卷曲、羊膜增厚等典型IBV病變，與其他IBV強(qiáng)毒株對(duì)雞胚的致病性一致。

2.2 IBV分離株CK/CH/HD/171018毒對(duì)SPF雞致病性動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明3日齡的SPF雞感染IBV分離株CK/CH/HD/171018后出現(xiàn)羽毛松亂、精神萎靡及腹瀉癥狀，個(gè)別出現(xiàn)呼吸道癥狀。攻毒組雞群在第5 d開(kāi)始出現(xiàn)死亡，死亡一直持續(xù)到第14 d，死亡率達(dá)到100%（圖1A）。病死雞的剖檢結(jié)果顯示，主要病變發(fā)生在腎臟和氣管，所有死亡雞的腎臟都病變明顯，表現(xiàn)為腎臟明顯腫大，實(shí)質(zhì)蒼白，小管和尿道擴(kuò)張，并有尿酸鹽沉積，是呈現(xiàn)典型的“花斑腎”癥狀，個(gè)別病死雞氣管有出血點(diǎn)，其他臟器肉眼可見(jiàn)病變不明顯（圖1B）。

圖1 SPF雞感染IBV分離株CK/CH/HD/171018后死亡情況（A）與腎臟、氣管病變（B）Fig.1 Survival rate of chickens (A) and gross lesions in kidney and trachea tissues from chickens experimentally infected with IBV strain CK/CH/HD/171018

2.3 IBV分離株CK/CH/HD/171018全基因組序列測(cè)定結(jié)果基因組內(nèi)部分段擴(kuò)增共獲得23個(gè)片段，擴(kuò)增目的條帶大小與預(yù)期結(jié)果基本一致；應(yīng)用3'和5'RACE試劑盒擴(kuò)增得到了與預(yù)期大小一致的末端片段。將得到的目的片段克隆至pMD19-T載體并進(jìn)行測(cè)序。

2.4 IBV分離株CK/CH/HD/171018全基因組序列測(cè)定和拼接將測(cè)序獲得的各基因片段序列利用DNAStar中Megalign程序?qū)ζ溥M(jìn)行拼接和比對(duì)，獲得分離株CK/CH/HD/171018的全基因組序列。結(jié)果顯示，CK/CH/HD/171018基因組的結(jié)構(gòu)為5'Cap-Replicase-S-3a-3b-3c/E-M-5a-5b-N-poly(A)3'，與典型的IBV基因組組成特征相同（表2），CK/CH/HD/171018株核苷酸全長(zhǎng)為27 688 bp。全基因組序列登錄至GenBank中，其登錄號(hào)為MH020185。

2.5 IBV分離株CK/CH/HD/171018遺傳進(jìn)化分析本研究將IBV分離株CK/CH/HD/171018與57個(gè)國(guó)內(nèi)外參考毒株的S基因（圖2）進(jìn)行比較，繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果表明，該分離株CK/CH/HD/171018與中國(guó)株CK/CH/LJL/140734及CK/CH/LJL/140924的親緣關(guān)系最近，屬于QX型IBV。

表2 推測(cè)分離株CK/CH/HD/171018的ORFTable 2 ORF encoded in CK/CH/HD/171018 genome

2.6 IBV分離株CK/CH/HD/171018的重組分析本研究對(duì)IBV分離株CK/CH/HD/171018全基因進(jìn)行重組來(lái)源分析。首先，分離株CK/CH/HD/171018全基因、各個(gè)基因片段與參考株同源性對(duì)比，結(jié)果見(jiàn)表3。分離株CK/CH/HD/171018全基因與QX的同源性最高，其Gene1與CK/CH/LSC/99I型的GX-YL9株及GX-YL5株同源性高達(dá)95.5%～97%，基因S、3、M、5、N與QX型同源性較高，這一結(jié)果暗示IBV分離株CK/CH/HD/171018在Gene1上可能發(fā)生重組事件。故此，我們將CK/CH/HD/171018與參考株全基因進(jìn)行重組分析。應(yīng)用RDP3軟件分析顯示IBV CK/CH/HD/171018株Gene1中檢測(cè)出2個(gè)重組事件。在事件1中，7種檢測(cè)方法顯著性分別達(dá)到RDP（5.517×10-47）、GENECONV（1.542×10-29）、BootScan（2.826×10-30）、MaxChi（1.644×10-15）、Chimaera（4.061×10-18）、SiScan（1.669×10-14）及3Seq（2.410×10-30），重組片段位于5661～8223 bp，重組來(lái)源minor與major母代毒株分別是GX-YL9與DY07。事件2重組片段位于14 101～18 762 bp，重組來(lái)源minor與major母代毒株分別是DY07與GX-YL9，有5種檢測(cè)方法檢測(cè)的重組概率P值小于1×10-12。2個(gè)重組事件均可以在Simplot軟件分析中得到確認(rèn)（圖3）。

3 討論

本研究分離了IBV變異株CK/CH/HD/171018株，致病性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，分離株C K/C H/HD/171018人工感染3日齡SPF雞后，可引起嚴(yán)重腎臟病變、咳嗽、甩鼻及張口呼吸等臨床癥狀，從d5開(kāi)始有死亡，死亡率達(dá)到100%，表明本研究分離株屬于IBV強(qiáng)毒株。

本研究完成了全基因組測(cè)序，序列分析發(fā)現(xiàn)其與參考株CK/CH/LJL/140924基因組高度同源，同源性高達(dá)98.2%～99.6%，CK/CH/LJL/140924是吉林2014年分離株。CK/CH/HD/171018與CK/CH/LJL/140734、CK/CH/LJL/140924吉林分離株等QX基因型IBV高度同源，且全基因進(jìn)化樹(shù)分析都處于同一進(jìn)化分支，因此我們認(rèn)為CK/CH/HD/171018屬于IBV QX基因型。QX型毒株在現(xiàn)階段已經(jīng)成為最流行的優(yōu)勢(shì)基因型，基因重組事件可能導(dǎo)致QX基因型變異株的出現(xiàn)[16]，每年我國(guó)許多地區(qū)都會(huì)發(fā)生IBV，且QX型IBV已在我國(guó)流行多年，給養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大損失，然而近年來(lái)發(fā)現(xiàn)分離的QX型IBV大都存在重組現(xiàn)象[5,16,17]，這使得我國(guó)QX型IBV的發(fā)病情況越來(lái)越復(fù)雜，也進(jìn)一步加劇了該病的流行情況。

圖2 IBV分離株CK/CH/HD/171018(▲標(biāo)注)與參考株S基因遺傳進(jìn)化樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of S gene of IBV strains (CK/CH/HD/171018 marked with ▲)

IBV容易通過(guò)基因突變、插入、缺失和重組等分子機(jī)制產(chǎn)生新的變異株[18]，其中重組可以發(fā)生在野毒株之間，也可以發(fā)生在疫苗株和野毒株之間[19]，此外還涉及基因突變、插入和缺失等多種變異機(jī)制，目前分離的QX基因型野毒株也呈現(xiàn)多樣性進(jìn)化。由于IBV很容易通過(guò)基因重組及突變發(fā)生變異，導(dǎo)致出現(xiàn)新的變異株。本研究利用RDP3軟件及Simplot 軟件進(jìn)行同源性分析確定了所分離到的IBV分離株CK/CH/HD/171018是通過(guò)基因重組而出現(xiàn)的變異株，重組現(xiàn)象發(fā)生在Gene1處，是QX型DY07野毒株和CK/CH/LSC/99I型GX-YL9野毒株的重組，且引起雞群產(chǎn)生嚴(yán)重的腎臟病變及高死亡率。已有研究標(biāo)明，Gene1包含表達(dá)兩種多蛋白pp1a和pp1ab的復(fù)制酶基因，兩種多蛋白被兩種病毒編碼的蛋白酶切割，通常產(chǎn)生16種非結(jié)構(gòu)蛋白（Nsp1～16），IBV缺乏Nsp1，從而編碼Nsp2～16，復(fù)制酶基因涉及病毒復(fù)制和致病性[20,21]。變異株CK/CH/HD/171018的Gene1發(fā)生野毒株之間的重組可能是決定了該病毒高致病性的原因，但確切的結(jié)論還有待進(jìn)一步的證實(shí)。所以在日后IBV流行病學(xué)檢測(cè)中要對(duì)在Gene1發(fā)生重組的病毒進(jìn)行追蹤調(diào)查其流行情況、變異機(jī)制及致病特征。

表3 IBV分離株CK/CH/HD/171018基因組與參考株序列同源性(%)比較Table 3 Pairwise sequence comparison (%) of CK/CH/HD/171018 and reference IBV strains

圖3 IBV分離株CK/CH/HD/171018株基因組Simplot重組分析Fig.3 Simplot analyses of the complete genomic sequence of IBV strain CK/CH/HD/171018

本研究測(cè)定了IBV分離株CK/CH/HD/171018的全部基因組序列，從分子水平上分析了病毒基因組的分子特性，豐富了IBV的生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)，為進(jìn)一步從分子水平研究IBV的流行情況、變異機(jī)制及致病特征等奠定了基礎(chǔ)。由于QX型IBV強(qiáng)毒株已經(jīng)成為國(guó)內(nèi)優(yōu)勢(shì)基因型，我們必須對(duì)其進(jìn)行持續(xù)的流行病學(xué)監(jiān)測(cè)，同時(shí)盡快評(píng)價(jià)現(xiàn)有IB疫苗對(duì)此類(lèi)變異株的免疫效力，從而制定更有效的防控策略。