歐陽偉，潘群興，錢 晶，王晶宇，王曉麗，夏興霞，諸玉梅，王永山

（1. 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部獸用生物制品工程技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京210014；2. 江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚(yáng)州 225009）

傳染性法氏囊?。↖nfectious bursal disease，IBD）是由傳染性法氏囊病病毒（infectious bursal disease virus，IBDV）引起的以侵害幼禽法氏囊為主要特征的傳染病。該病不僅引起患病動物死亡，而且還導(dǎo)致機(jī)體免疫抑制，使機(jī)體的免疫防御能力降低和對多種疫苗免疫接種失敗。IBDV屬雙RNA病毒科雙RNA病毒屬，基因組易變異，且IBDV的生物學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定以及多種禽鳥類可帶毒傳播，致該病毒難以根除[1]。從IBD疫苗免疫失敗的雞群中分離到的IBDV自然重配超強(qiáng)毒株表現(xiàn)出更強(qiáng)的致病性[2-4]。以上因素的共同作用，使IBD仍是危害養(yǎng)雞業(yè)的主要疫病之一，并呈現(xiàn)出新的流行特點(diǎn)：早期感染、免疫抑制、免疫失敗、與其他病原共感染或混合感染、協(xié)同致病、臨床癥狀及病變多樣化，已成為亟待解決的重大科學(xué)與生產(chǎn)實(shí)際問題。因此，尋求IBD防治新途徑已成為雞傳染病防控中亟待解決的問題。

天然免疫（innate immunity）是激活獲得性免疫的重要基礎(chǔ)和前提，在機(jī)體抵御病毒感染方面具有非常關(guān)鍵的作用。病原微生物感染宿主后，宿主細(xì)胞通過自身的模式識別受體（pattern recognition receptor，PRRs）識別病毒的病原相關(guān)分子模式（pathogen associated molecular pattern，PAMPs），激活宿主的天然免疫應(yīng)答，誘導(dǎo)產(chǎn)生I型干擾素、炎性細(xì)胞因子和趨化因子等免疫活性介質(zhì)，同時也誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞的成熟，激活獲得性免疫反應(yīng)[5,6]。

模式識別受體中的RIG-I樣受體（RLR）家族包括：RIG-I、MDA5和LGP2，主要分布在細(xì)胞質(zhì)中，其識別的病毒PAMPs包括病毒基因組DNA、單鏈RNA（ssRNA）、雙鏈RNA（dsRNA）、含5'端三磷酸基團(tuán)的RNA以及病毒蛋白[7,8]。人源RIG-I和MDA5在進(jìn)化上保守，其分子結(jié)構(gòu)及在整個信號通路中的地位較為一致，是識別細(xì)胞內(nèi)病毒核酸（包括病毒自身的基因組和病毒復(fù)制過程中產(chǎn)生的核酸中間體）、激活干擾素系統(tǒng)的兩個關(guān)鍵的PRRs。雞源細(xì)胞缺乏RIG-I，其功能由MDA5補(bǔ)償[9,10]。雞細(xì)胞PRRs如何識別病毒PAMP啟動天然免疫應(yīng)答其分子機(jī)制尚不清楚。

microRNA（miRNA）是一種21～25 nt的小分子RNA，本身不具有開放閱讀框（open reading frame，ORF）[11]。細(xì)胞內(nèi)源性miRNA可以作為一種引導(dǎo)性分子通過堿基配對與靶mRNA結(jié)合，從而在轉(zhuǎn)錄后水平引起靶mRNA的剪切或是翻譯的抑制，在多種生理和病理途徑中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[12]。miRNAs在天然免疫細(xì)胞內(nèi)有獨(dú)特的表達(dá)譜，miRNA可以有效靶向PRRs介導(dǎo)的天然免疫信號通路上的眾多分子，包括PRRs、接頭蛋白、激酶、轉(zhuǎn)錄因子以及炎性因子等[13,14]。目前，尚缺乏miRNAs對雞細(xì)胞chMDA5介導(dǎo)的抗病毒天然免疫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)控研究。

本研究擬在前期工作基礎(chǔ)上，分析鑒定IBDV感染對chMDA5表達(dá)的影響，以及chMDA5在識別IBDV感染中的作用，并進(jìn)一步在miRNA水平分析chMDA5的調(diào)控機(jī)制，探索雞細(xì)胞識別/啟動抗病毒天然免疫反應(yīng)的關(guān)鍵分子，為預(yù)防和治療免疫抑制疾病的新策略提供理論基礎(chǔ)和藥物靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 病毒、細(xì)胞和試劑IBDV 弱毒（B87株）雞B淋巴細(xì)胞傳代細(xì)胞（DT40）適應(yīng)毒株和DT40細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存；RNAiso Plus購自TaKaRa公司；5×All-In-One RT MasterMix（with AccuRT Genomic DNA Removal Kit）和EvaGreen 2×qPCR MasterMix購自ABM公司；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑和Lipofectamine RNAiMAX購自Invitrogen公司；T7 RiboMAX Express RNAi System體外轉(zhuǎn)錄試劑盒、雙熒光素酶報告載體（pRL-CMV、pGL3-control）以及Dual Luciferase Reporter Gene Assay Kit均購自Promega公司；SuperSignal West Pico化學(xué)發(fā)光底物購自Thermo公司；pcDNA3.1-Flag+chMDA5真核表達(dá)質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 IBDV感染對chMDA5表達(dá)水平的影響在病毒感染前24 h預(yù)鋪DT40細(xì)胞于6孔板，第二天，每孔接種103TCID50的IBDV B87株，在IBDV感染后2 h、4 h、12 h和24 h 4個時間點(diǎn)分別收集細(xì)胞培養(yǎng)物，同時設(shè)立正常的DT40細(xì)胞做對照。用qRT-PCR和Western blot 分別分析chMDA5 的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平。

1.3 chMDA5過表達(dá)和抑制表達(dá)對IBDV復(fù)制的影響運(yùn)用siRNA在線設(shè)計(jì)工具（http://rnaidesigner.lifetechnologies.com/rnaiexpress/），針對chMDA5基因保守區(qū)分別設(shè)計(jì)了2個siRNA（在siRNA正義鏈序列的5'端和反義鏈的3'端分別加上T7 RNA聚合酶啟動子序列，使兩者能夠成為互補(bǔ)雙鏈），并通過Blast分析確認(rèn)他們特異性，同時設(shè)計(jì)siRNA陰性對照siRNACON。DNA寡核苷酸由北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。

將合成的單鏈DNA序列通過退火配對，分別得到正義siRNA轉(zhuǎn)錄模板和反義siRNA轉(zhuǎn)錄模板。反應(yīng)體系：正義DNA模板（100 pmol/μL）10 μL，反義DNA模板（100 pmol/μL）10 μL，5×Oligo annealing buffer 20 μL，無Nuclease-Free water 60 μL，95℃ 5 min，室溫退火30 min，制備雙鏈DNA模板。siRNA的轉(zhuǎn)錄合成按T7 RiboMAX Express RNAi System體外轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行。

將pcDNA3.1-Flag+chMDA5或si-chMDA5轉(zhuǎn)染DT40細(xì)胞，轉(zhuǎn)染按Lipofectamine 2000操作說明書進(jìn)行。24 h后，每孔接種103TCID50的IBDV B87株，感染后24 h，測IBDV滴度。同時設(shè)立pcDNA3.1（+）空質(zhì)?；騭iRNACON轉(zhuǎn)染對照。

1.4 chMDA5過表達(dá)和抑制表達(dá)對IFN-β promoter、Mx promoter活性的影響將pcDNA3.1-Flag+chMDA5、si-chMDA5分別與pGL3-Basic+IFN-β promoter、pRL-CMV或pGL3-Basic+Mx promoter、pRL-CMV共轉(zhuǎn)染DT40細(xì)胞，轉(zhuǎn)染按Lipofectamine 2000操作說明書進(jìn)行，同時設(shè)立pcDNA3.1（+）空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對照。5 h后，更換成2 mL含2%胎牛血清的DMEM。siRNA轉(zhuǎn)染組，轉(zhuǎn)染后24 h棄細(xì)胞上清，每孔接種103TCID50的IBDV B87株，感染后24 h，使用雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測試劑盒檢測各孔熒光素酶活性。

1.5 chMDA5過表達(dá)和抑制表達(dá)對NF-κB和IRF7信號通路的影響將pcDNA3.1-Flag+chMDA5或sichMDA5分別與pGL3-Basic+NF-κB、pRL-CMV或pGL3-Basic+IRF7、pRL-CMV共轉(zhuǎn)染DT40細(xì)胞，轉(zhuǎn)染按Lipofectamine 2000操作說明書進(jìn)行，同時設(shè)立pcDNA3.1（+）空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對照。5 h后，更換成2 mL含2%胎牛血清的DMEM，轉(zhuǎn)染后24 h棄細(xì)胞上清。siRNA轉(zhuǎn)染組，轉(zhuǎn)染后24 h棄細(xì)胞上清，每孔接種103TCID50的IBDV B87株，感染后24 h，使用雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測試劑盒檢測各孔熒光素酶活性。

1.6 生物信息學(xué)預(yù)測調(diào)控chMDA5的miRNA用生物信息學(xué)在線工具miRDB（http://mirdb.org/miRDB/）預(yù)測調(diào)控chMDA5的miRNA，合成miRNA的模擬物，進(jìn)行功能分析。

1.7 雙熒光素酶報告系統(tǒng)分析gga-miR-142-5p對chMDA5 3'UTR的調(diào)控作用將gga-miR-142-5p、pGL3-chMDA5 3'UTR和pRL-CMV共轉(zhuǎn)染DT40細(xì)胞，轉(zhuǎn)染按Lipofectamine 2000操作說明書進(jìn)行，5 h后，更換成2 mL含2%胎牛血清的DMEM，轉(zhuǎn)染后24 h棄細(xì)胞上清，使用雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測試劑盒檢測各孔熒光素酶活性。同時設(shè)立miRNA control轉(zhuǎn)染對照組。

1.8 gga-miR-142-5p對chMDA5 mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)的影響將gga-miR-142-5p轉(zhuǎn)染DT40細(xì)胞，轉(zhuǎn)染按Lipofectamine 2000操作說明書進(jìn)行，5 h后，更換成2 mL含2%胎牛血清的DMEM，轉(zhuǎn)染后24 h，用Western blot和定量PCR分別檢測chMDA5的蛋白水平和mRNA水平。同時設(shè)立miRNA control轉(zhuǎn)染對照組。

1.9 gga-miR-142-5p對IFN-β promoter和Mx promoter活性的影響將gga-miR-142-5p或ggamiR-142-5p inhibitor分別與pGL3-Basic+IFN-β promoter或pGL3-Basic+Mx promoter和pRL-CMV共轉(zhuǎn)染DT40細(xì)胞，轉(zhuǎn)染按Lipofectamine 2000操作說明書進(jìn)行，5 h后，更換成2 mL含2%胎牛血清的DMEM，轉(zhuǎn)染后24 h棄細(xì)胞上清，每孔接種103TCID50的IBDV B87株，感染后24 h，使用雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測試劑盒檢測各孔熒光素酶活性。同時設(shè)立mimic control或inhibitor control轉(zhuǎn)染對照組。

1.10 gga-miR-142-5p對NF-κB和IRF7信號通路的影響將gga-miR-142-5p或gga-miR-142-5p inhibitor分別與pGL3-Basic+NF-κB或pGL3-Basic+IRF7和pRL-CMV共轉(zhuǎn)染DT40細(xì)胞，轉(zhuǎn)染按Lipofectamine2000操作說明書進(jìn)行，5 h后，更換成2 mL含2%胎牛血清的DMEM，轉(zhuǎn)染后24 h棄細(xì)胞上清，每孔接種103TCID50的IBDV B87株，感染后24 h，使用雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測試劑盒檢測各孔熒光素酶活性。同時設(shè)立mimic control或inhibitor control轉(zhuǎn)染對照組。

1.11 gga-miR-142-5p對IBDV復(fù)制的影響將ggamiR-142-5p或gga-miR-142-5p inhibitor轉(zhuǎn)染DT40細(xì)胞，轉(zhuǎn)染按Lipofectamine 2000操作說明書進(jìn)行，5 h后，更換成2 mL含2%胎牛血清的DMEM，轉(zhuǎn)染后24 h，每孔接種103TCID50的IBDV B87株，感染后24 h，收集細(xì)胞上清，測病毒滴度。同時設(shè)立mimic control或inhibitor control轉(zhuǎn)染對照組。

2 結(jié)果

2.1 IBDV感染對chMDA5表達(dá)水平的影響用qRTPCR分析IBDV感染后4個時間點(diǎn)（2 h，4 h，12 h和24 h）細(xì)胞培養(yǎng)物中chMDA5 mRNA含量，結(jié)果顯示，chMDA5 mRNA的表達(dá)水平在IBDV感染后的2～24 h內(nèi)總體呈上升趨勢，在感染后的第24 h表達(dá)量最高。用Western blot分析IBDV感染后12 h和24 h 2個時間點(diǎn)細(xì)胞培養(yǎng)物中chMDA5蛋白含量結(jié)果見圖1，chMDA5的蛋白水平在IBDV感染后的12 h和24 h均高于正常對照細(xì)胞。以上結(jié)果表明，IBDV感染可促進(jìn)chMDA5在DT40細(xì)胞中的表達(dá)。

圖1 qRT-PCR和Western blot分析IBDV感染對chMDA5 表達(dá)水平的影響（＊P<0.05,＊＊P<0.01）Fig. 1 IBDV infection increased the transcription and protein expression level of chMDA5 in DT40 cells(＊P<0.05,＊＊P<0.01)

2.2 chMDA5過表達(dá)和抑制表達(dá)對IBDV復(fù)制的影響將chMDA5在DT40細(xì)胞中瞬時過表達(dá)，接種IBDV，用TCID50測上清中的病毒滴度，結(jié)果見圖2。chMDA5過表達(dá)組IBDV滴度顯著低于對照組，表明chMDA5過表達(dá)可抑制IBDV在DT40細(xì)胞中的復(fù)制，而chMDA5抑制表達(dá)組IBDV滴度顯著高于對照組。以上結(jié)果表明chMDA5具有抗IBDV復(fù)制功能。

圖2 chMDA5過表達(dá)和抑制表達(dá)對IBDV復(fù)制的影響(＊P<0.05 )Fig. 2 Chicken MDA5(chMDA5) can inhibit IBDV replication in DT40 cells(＊P<0.05 )

2.3 chMDA5過表達(dá)和抑制表達(dá)對IFN-β promoter、Mx promoter活性的影響為了分析chMDA5抗IBDV復(fù)制的機(jī)理，用雙熒光素酶報告系統(tǒng)分析chMDA5對IFN-β和抗病毒基因Mx表達(dá)的影響，結(jié)果見圖3。chMDA5過表達(dá)可激活I(lǐng)FN-β promoter和Mx promoter活性。用siRNA下調(diào)chMDA5表達(dá)，感染IBDV，用雙熒光素酶報告系統(tǒng)分析發(fā)現(xiàn)IFN-β promoter和Mx promoter活性降低。以上結(jié)果表明，chMDA5可促進(jìn)IFN-β和抗病毒基因Mx的表達(dá)。

圖3 chMDA5過表達(dá)和抑制表達(dá)對IFN-β promoter、Mx promoter 活性的影響（＊P<0.05, ＊＊P<0.01）Fig. 3 chMDA5 increased the activity of IFN-β promoter and Mx promoter(＊P<0.05,＊＊P<0.01 )

2.4 chMDA5過表達(dá)和抑制表達(dá)對IRF7和NF-κB信號通路的影響為了分析chMDA5促進(jìn)IFN-β promoter活性是依賴IRF7還是NF-κB通路，用雙熒光素酶報告系統(tǒng)分析chMDA5對IRF7和NF-κB報告質(zhì)粒熒光素酶活性的影響，結(jié)果見圖4。結(jié)果表明，chMDA5激活I(lǐng)FN-β promoter活性主要通過IRF7通路，而對NF-κB信號通路無影響。

圖4 chMDA5過表達(dá)和抑制表達(dá)對IRF7和NF-κB信號通路的影響（＊P<0.05）Fig. 4 chMDA5 activated the activity of IFN-β promoter depending mainly on IRF7 signaling pathway, not on NF-κB signaling pathway(＊P<0.05)

2.5 miRNA調(diào)控chMDA5（IFIH1）抑制IBDV復(fù)制的分子機(jī)制用生物信息學(xué)預(yù)測調(diào)控chMDA5（IFIH1）的miRNA，發(fā)現(xiàn)gga-miR-142-5p可與chMDA5 3'UTR結(jié)合（圖5A）。進(jìn)一步用雙熒光素酶報告系統(tǒng)分析gga-miR-142-5p與 chMDA5 3'UTR的相互作用，結(jié)果顯示gga-miR-142-5p可以作用于chMDA5的3'UTR，使熒光素酶活性顯著降低59%。用Western blot 檢測gga-miR-142-5p能否調(diào)控chMDA5蛋白在DT40細(xì)胞中的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，gga-miR-142-5p過表達(dá)可下調(diào)chMDA5蛋白在DT40細(xì)胞中的表達(dá)（圖5B）。用qRT-PCR分析chMDA5 的mRNA水平，gga-miR-142-5p轉(zhuǎn)染組與對照組無顯著差異，表明gga-miR-142-5p下調(diào)chMDA5蛋白的表達(dá)主要是通過轉(zhuǎn)錄后抑制chMDA5 mRNA的翻譯而不是降解chMDA5 mRNA來實(shí)現(xiàn)（圖5C和5D）。

圖5 gga-miR-142-5p對chMDA5（IFIH1）的調(diào)控作用Fig. 5 gga-miR-142-5p can target chMDA5

2.6 gga-miR-142-5p對IFN-β promoter、Mx promoter活性的影響為了分析gga-miR-142-5p對IFN-β promoter、Mx promoter活性的影響，用雙熒光素酶報告系統(tǒng)分析gga-miR-142-5p過表達(dá)對IFN-β和抗病毒基因Mx 表達(dá)的影響，結(jié)果見表6。gga-miR-142-5p過表達(dá)可使IFN-β promoter和Mx promoter活性降低；而gga-miR-142-5p抑制表達(dá)可使IFN-β promoter和Mx promoter活性增加。

圖6 gga-miR-142-5p對IFN-β promoter、Mx promoter活性的影響（＊P<0.05）Fig. 6 gga-miR-142-5p inhibited the activity of IFN-β promoter and Mx promoter(＊P<0.05)

2.7 gga-miR-142-5p對IRF7和NF-κB信號通路的影響用雙熒光素酶報告系統(tǒng)分析gga-miR-142-5p是否能影響IRF7和NF-κB信號通路，結(jié)果見圖7。gga-miR-142-5p過表達(dá)或抑制表達(dá)可影響IRF7通路，而對NF-κB信號通路無影響。

圖7 gga-miR-142-5p對IRF7和NF-κB信號通路的影響（＊P<0.05）Fig.7 gga-miR-142-5p inhibited IRF7 signaling pathway, but had no effect on the NF-κB signaling pathway(＊P<0.05)

2.8 gga-miR-142-5p對IBDV復(fù)制的影響為了分析gga-miR-142-5p對IBDV復(fù)制的影響，將gga-miR-142-5p過表達(dá)或抑制表達(dá)，用TCID50測上清中的病毒滴度，結(jié)果見圖8。gga-miR-142-5p可促進(jìn)IBDV在DT40細(xì)胞中的復(fù)制。

圖8 gga-miR-142-5p對IBDV復(fù)制的影響（＊P<0.05）Fig. 8 gga-miR-142-5p promoted the replication of IBDV(＊P<0.05)

3 討論

病原微生物感染宿主后，宿主細(xì)胞通過自身的模式識別受體識別病毒的病原相關(guān)分子模式，激活宿主的天然免疫應(yīng)答。模式識別受體中的RIG-I樣受體在識別RNA病毒的感染中具有重要的作用。雞源細(xì)胞缺乏RIG-I，其功能由MDA5補(bǔ)償[15]。盡管已有人研究了chMDA5識別AIV感染的機(jī)制研究，但這些研究主要集中在這幾個模式識別受體之間是相互協(xié)同還是拮抗作用，以及下游接頭蛋白或病毒蛋白對模式識別受體的影響，但在miRNA水平分析chMDA5識別RNA病毒感染的分子機(jī)制并不清楚。

本研究以IBDV為模式病毒，發(fā)現(xiàn)在IBDV感染DT40細(xì)胞的早期，可以使細(xì)胞內(nèi)的chMDA5表達(dá)水平顯著升高，說明chMDA5在IBDV的感染中是一個重要的模式識別受體。Karpala等[10]在研究chMDA5對流感病毒復(fù)制的影響時發(fā)現(xiàn)，流感病毒感染可以使chMDA5表達(dá)上調(diào)，激活干擾素的表達(dá)。本研究在分析chMDA5的功能時也發(fā)現(xiàn)，chMDA5可以激活機(jī)體的IFN-β promoter和抗病毒基因Mx promoter活性，激活機(jī)體的天然免疫。但與Ye等[16]的研究結(jié)果不一致，Ye等發(fā)現(xiàn)IBDV感染并不能夠使chMDA5的表達(dá)顯著上調(diào)。分析我們與Ye等的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，可能是因?yàn)槎呤褂玫亩局瓴煌?，本研究使用的是IBDV B87株，而Ye等使用的是IBDV BN株，眾所周知，IBDV毒株易變異，有時一個關(guān)鍵位點(diǎn)氨基酸的變異會導(dǎo)致其生物學(xué)性質(zhì)差異巨大。進(jìn)一步分析chMDA5對IBDV復(fù)制的作用，發(fā)現(xiàn)chMDA5過表達(dá)可以抑制IBDV的復(fù)制，chMDA5抑制表達(dá)，IBDV復(fù)制則增強(qiáng)；而Karpala等[10]發(fā)現(xiàn)，流感病毒感染也可以使chMDA5表達(dá)上調(diào)，但用RNAi的方法下調(diào)chMDA5的表達(dá)之后，卻并不能影響流感病毒的增殖，其機(jī)理尚不清楚。據(jù)其推測，雖然chMDA5表達(dá)被激活，但因?yàn)殡u缺乏RIG-I，這也可能是為什么雞比鴨更易感染流感病毒。并且雞也易感染IBDV強(qiáng)毒株致死，而鴨卻不會致死，這也是否與雞缺乏RIG-I有關(guān)呢？有待進(jìn)一步研究。

雞的chMDA5可激活I(lǐng)FN-β promoter，這與哺乳動物以及鴨的MDA5功能是一致的[16]。此外，雞和鴨MDA5具有較高的同源性，Wei等[17]研究發(fā)現(xiàn)鴨的MDA5激活I(lǐng)FN-β promoter主要是通過IRF7信號通路。Karpala等[10]研究chMDA5的功能發(fā)現(xiàn)，其能夠調(diào)節(jié)IFN-β的表達(dá)，并且這種調(diào)節(jié)作用需要IRF3的參與。

既然雞的chMDA5可激活I(lǐng)FN-β promoter和抗病毒基因Mx promoter活性，那么是什么在調(diào)控chMDA5的表達(dá)呢？目前對MDA5的調(diào)控研究主要在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平，比如，LGP2是chMDA5的陽性調(diào)控子[18]，IBDV VP3可以阻止chMD5與IBDV的結(jié)合，抑制其在抗病毒天然免疫中的活性[16]。但在miRNA水平分析miRNA對chMD5的直接調(diào)控作用尚無研究。miRNA是基因表達(dá)的調(diào)控子，在各種生理和病理過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[11,12,19]。越來越多的研究表明，機(jī)體自身編碼的miRNA在抗病毒天然免疫中發(fā)揮著越來越重要的作用[20]。在RIG-I樣受體的研究中，已發(fā)現(xiàn)miR-146a是RIG-I樣抗病毒天然免疫通路中的一個負(fù)調(diào)控子[21]。雖然已有研究發(fā)現(xiàn)miRNA在RIG-I樣抗病毒天然免疫中是一個重要的調(diào)控因子，miRNA可以調(diào)控TLR和RIG-I樣通路中的關(guān)鍵蛋白，但還沒有研究發(fā)現(xiàn)能直接調(diào)控模式識別受體MDA5的miRNA。

本研究用生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，調(diào)控chMDA5的miRNA有多個，用雙熒光素酶報告系統(tǒng)分析發(fā)現(xiàn)，能直接與chMDA5的3'UTR作用的miRNA有3個（gga-miR-7442-5p、gga-miR-1739和gga-miR-142-5p），但這2個miRNA（gga-miR-7442-5p和gga-miR-1739）的過表達(dá)對IBDV的復(fù)制沒有影響（數(shù)據(jù)未提供）。只有g(shù)ga-miR-142-5p不僅可以作用于chMDA5的3'UTR，而且將其過表達(dá)之后，能夠使IBDV復(fù)制顯著增加。表明這2個miRNA（ggamiR-7442-5p和gga-miR-1739）在調(diào)控chMDA5抗IBDV復(fù)制中無作用。進(jìn)一步通過qRT-PCR和Western blot分析發(fā)現(xiàn)，gga-miR-142-5p可以調(diào)控chMDA5蛋白的表達(dá)，其機(jī)理主要是抑制chMDA5的翻譯（并不使mRNA降解）來實(shí)現(xiàn)。

Tian等[22]用MDV分別感染易感的和不易感的白來航雞系，用miRNA芯片分析脾臟組織miRNA的差異表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)gga-miR-142-5p在不易感染MDV系的白來航雞中，其gga-miR-142-5p的表達(dá)水平顯著低于易感MDV的白來航雞。Wang等[23]用AIV感染雞，然后用深度測序的方法分析肺和氣管中的miRNA在AIV感染前后的差異表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)雞在感染AIV之后，其gga-miR-142-5p的表達(dá)水平也顯著下調(diào)。從Tian和Wang等的實(shí)驗(yàn)中，以及結(jié)合本研究的結(jié)果，我們可以推斷，當(dāng)MDV、AIV或IBDV感染雞時，機(jī)體可能使gga-miR-142-5p表達(dá)下調(diào)，從而使chMDA5表達(dá)上調(diào)來增強(qiáng)機(jī)體對病毒的識別，提高機(jī)體的天然抗病毒免疫應(yīng)答。

既然gga-miR-142-5p可以調(diào)控chMDA5的表達(dá)，那么它應(yīng)當(dāng)也可以影響IFN-β promoter和Mx promoter的活性？為了驗(yàn)證這個推斷，本研究將gga-miR-142-5p過表達(dá)，感染IBDV，發(fā)現(xiàn)IFN-β promoter和Mx promoter活性降低，IBDV復(fù)制增強(qiáng)。并進(jìn)一步分析gga-miR-142-5p對IRF7信號通路和NF-κB信號通路的影響，也發(fā)現(xiàn)其能夠抑制IRF7信號通路，而不抑制NF-κB信號通路。

綜上，我們發(fā)現(xiàn)IBDV感染可使DT40細(xì)胞中chMDA5的表達(dá)水平顯著升高。chMDA5可激活I(lǐng)FN-β promoter和Mx promoter活性，且chMDA5激活I(lǐng)FN-β promoter活性主要是通過IRF7通路；進(jìn)一步在miRNA水平分析發(fā)現(xiàn)，gga-miR-142-5p可以作用于chMDA5的3'UTR負(fù)調(diào)控chMDA5的表達(dá)從而影響其下游IFN-β promoter和Mx promoter活性來發(fā)揮抗IBDV感染的作用。