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(1.上海海洋大學 海洋科學學院，上海 201306；2.上海海洋大學 大洋漁業(yè)資源可持續(xù)開發(fā)教育部重點實驗室，上海 201306；3.國家遠洋漁業(yè)工程技術研究中心，上海 201306；4.遠洋漁業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，上海201306)

水體中氧含量是魚類生存的關鍵因素之一，影響著魚體的生長發(fā)育、新陳代謝、繁殖等生命過程。水體中正常的氧濃度為6.5～7.0 mg/L，當水體中的溶解氧濃度低于2.0 mg/L時為低氧/缺氧(Hypoxia)狀態(tài)[1-2]。氧分子是真核細胞線粒體有氧能源的終端電子受體。氧含量的減少會降低細胞的能量代謝，從而激發(fā)活性氧的產(chǎn)生，導致細胞損傷和凋亡[3]。過強、持續(xù)時間過長的低氧刺激會打破生物體與環(huán)境間的平衡，對機體產(chǎn)生危害，但輕度、較長時間的低氧環(huán)境則可以增加生物體對低氧的耐受力[2-4]。

熱休克蛋白(Heat shock proteins, HSPs)是生物受到環(huán)境中的物理、化學、生物等刺激時發(fā)生應激反應而大量產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，又稱應激蛋白，從細菌到哺乳動物等各種有機體均廣泛存在，是機體自我保護的物質(zhì)基礎[5-7]。當生物體受到外界刺激時，細胞便會自動關閉正常蛋白的合成進而迅速誘導合成一系列HSP蛋白來快速地調(diào)整應激發(fā)生過程中細胞的存活性能，提升細胞的抗損傷能力，幫助細胞適應應激環(huán)境，恢復正常的生理活動[8]。HSP家族中，根據(jù)蛋白分子量的大小通常劃分為4類：HSP90家族[9]、HSP70家族[10-11]、HSP60家族和HSP40小分子家族。每個HSP家族成員均具有各自功能，但在生命活動過程往往又相互協(xié)調(diào)，共同發(fā)揮作用。

斑馬魚Daniorerio是一種小型鯉科熱帶魚[12]，自20世紀70年代美國俄勒岡大學的George Streisinger教授利用斑馬魚進行遺傳學及發(fā)育生物學方面的研究以來，斑馬魚已越來越多地被應用于科學研究，成為繼小鼠后又一重要的模式生物[12-13]。為研究熱休克蛋白應對低氧脅迫的生物學功能，本研究中以斑馬魚為研究對象，對低氧脅迫與常氧條件下斑馬魚鰓組織進行轉錄組測序，比較了低氧脅迫與常氧條件下斑馬魚鰓中熱休克蛋白家族基因的表達差異，以期為揭示斑馬魚的低氧適應機制提供新線索。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗樣本為大洋漁業(yè)資源可持續(xù)開發(fā)教育部重點實驗室(以下簡稱本實驗室)培育多代的野生型斑馬魚(WT)，養(yǎng)殖溫度為28 ℃，飼養(yǎng)水體溶解氧濃度為6.7 mg/L。每日8:00、19:00喂食豐年蟲。

試驗用試劑：RNA提取試劑盒NucleoZOL由吉泰生物公司提供；RNA測序建庫試劑盒VAHTS Stranded mRNA-seq Library Prep Kit for Illumina?由諾維贊生物公司提供；RNA反轉錄試劑盒購于天根生物公司；熒光定量PCR試劑盒FastStart Universal SYBR Green Master購于Roche公司；組織蛋白裂解液與Anti-ACTIN抗體購于生工生物工程(上海)股份有限公司；Anti-HSP47抗體與Anti-HSP90ab1抗體分別購于Proteintech蛋白公司和Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 樣本低氧處理 將野生型斑馬魚(WT)置于低氧馴化箱(長沙華曉電子科技有限公司)進行不同低氧條件脅迫處理。低氧脅迫的預試驗發(fā)現(xiàn)：低氧脅迫初期，斑馬魚的游泳速度減慢，且成群聚集在水面，出現(xiàn)輕微浮頭現(xiàn)象。隨著低氧脅迫時間的延長，魚群浮頭現(xiàn)象逐漸消失。低氧脅迫兩周后，斑馬魚恢復正常運動和生理狀況。故選取低氧馴化兩周后的斑馬魚來進行后續(xù)試驗。低氧脅迫時，水體中的溶解氧濃度按照每兩小時1.0 mg/L的速度降低，6 h后溶解氧濃度降低至2.0 mg/L(記為中度低氧)；歷經(jīng)8 h將常氧濃度(6.7 mg/L)降低至1.0 mg/L氧濃度(記為重度低氧)。保持2.0 mg/L(中度低氧)、1.0 mg/L(重度低氧)的水體養(yǎng)殖環(huán)境，馴化斑馬魚兩周。每種溶解氧濃度條件(6.7、2.0、1.0 mg/L)下，養(yǎng)殖的斑馬魚至少為30尾。取常氧、低氧馴化兩周后的斑馬魚各30尾，冰上麻醉，解剖獲得各組織。以15尾斑馬魚為一個單位進行后續(xù)試驗，且每組樣本均設兩個重復，以常氧條件下的斑馬魚樣本作為對照。

1.2.2 鰓組織的轉錄組建庫與測序 利用NucleoZOL試劑盒提取常氧(6.7 mg/L)、中度低氧(2.0 mg/L)、重度低氧(1.0 mg/L)條件下鰓組織的總RNA。具體步驟按照NucleoZOL試劑盒使用方法嚴格執(zhí)行。分別制備中度低氧、重度低氧下的斑馬魚鰓的RNA樣本各2個，每個RNA樣本的制備包括15尾斑馬魚，共制備4組低氧斑馬魚RNA樣本，分別為中度低氧(2.0 mg/L)的總RNA樣本(2.0 G1、2.0 G2)和重度低氧(1.0 mg/L)的總RNA樣本(1.0 G1、1.0 G2)，隨后將總RNA樣本放于冰箱(-20 ℃)中保存，用于后續(xù)建庫試驗。4個總RNA樣本制備好后，按照VAHTS Stranded mRNA-seq Library Prep Kit for Illumina?試劑盒說明書進行轉錄組建庫，將4個轉錄組庫送北京諾禾致源生物信息科技有限公司進行轉錄組測序。而對照組常氧斑馬魚鰓的轉錄組測序數(shù)據(jù)已由本實驗室報道[14]。

1.2.3 實時熒光定量RT-PCR 對在常氧、低氧(1.0、2.0 mg/L)條件下馴化兩周的斑馬魚，提取鰓、心臟、皮膚、腎和肌肉組織的總RNA。按照反轉錄試劑盒提供的步驟將RNA反轉錄成cDNA，以cDNA為模板進行qRT-PCR試驗。所得數(shù)據(jù)進行溶解曲線分析及計算其2-△△Ct值，并用SPSS 22.0 軟件進行One Way ANOVA 分析。比較低氧和常養(yǎng)條件下斑馬魚各組織中Hsp47、Hsp90ab1 基因的表達水平差異。以β-actin作為qRT-PCR的內(nèi)參基因，基因的引物設計如表1所示。

表1 實時熒光定量PCR引物Tab.1 Primers for qRT-PCR

1.2.4 Western Blot法分析 分別提取常氧、中度低氧、重度低氧條件下的斑馬魚鰓組織蛋白，加入組織蛋白裂解液(強裂解液A∶液B=100∶1)，充分裂解后離心提取上清，加入含有巰基乙醇的上樣緩沖液，沸水煮10 min變性。從每個樣本提取30 μg的蛋白進行10% SDS-PAGE 蛋白膠電泳。用孔徑為0.45 μm 的PVDF 膜(Millipore) 在250 mA 下轉膜1 h。封閉后分別用Anti-HSP47抗體(1∶1000)、Anti-HSP90ab1抗體(1∶1000)和Anti-ACTIN抗體(1∶2000) 孵育過夜。再用PBST 洗滌3 次(每次5 min)，二抗孵育(1∶2000)，室溫下靜置1 h。用PBST 洗滌3次，加入顯影液，使用化學發(fā)光成像儀成像，檢測蛋白的表達。

2 結果與分析

2.1 轉錄組測序與基因差異表達分析

對從低氧斑馬魚鰓中提取的4個RNA(2.0 G1、2.0 G2、1.0 G1、1.0 G2)進行建庫、測序，得出數(shù)據(jù)后與本實驗室已發(fā)表的常氧斑馬魚鰓轉錄組數(shù)據(jù)進行對比[14](常氧斑馬魚鰓轉錄組數(shù)據(jù)來源于http://asia.ensembl.org/info/data/ftp/index. html)。 對比后選取P<0.05、|lgFC|>2的基因作為差異基因進行后續(xù)分析。

斑馬魚轉錄組用于比較的基因共17 813個，在兩個低氧脅迫條件下發(fā)生顯著改變的基因數(shù)目各不相同。其中，共有1582個基因表達量在兩個低氧脅迫下均顯著上調(diào)，2134個基因表達量在兩個低氧脅迫下同時顯著下調(diào)。在兩種低氧濃度下表達量均發(fā)生顯著改變的基因中，篩選出全部HSP蛋白家族基因進行分析。結果發(fā)現(xiàn)，在兩種低氧脅迫下，斑馬魚HSP蛋白家族基因中產(chǎn)生顯著變化的基因共28個，其中16個HSP蛋白家族基因表達量顯著上調(diào)，12個HSP蛋白家族基因的表達量顯著下調(diào)(P<0.05)。表達量增加最多的是Hsp47基因，除分子量較大的Hsp90ab1基因外，其他表達量上升的熱休克蛋白基因均為Hsp40的同源基因，均為小分子量HSP蛋白基因(圖1)。

2.2 低氧脅迫下Hsp47與Hsp90ab1基因的表達

低氧脅迫下，在表達顯著上升的HSP家族基因中挑選出表達量增加最大的Hsp47基因、分子量最大的Hsp90ab1基因進行qRT-PCR驗證。按照前述低氧處理方法進行中度低氧(2.0 mg/L)、重度低氧(1.0 mg/L)馴化。提取常氧、中度低氧和重度低氧3個培養(yǎng)環(huán)境下的試驗組斑馬魚鰓、心臟、皮膚、腎臟、肌肉組織的總RNA，電泳檢測后進行后續(xù)qRT-PCR試驗。

從圖2可見：與常氧相比，在重度低氧脅迫(1.0 mg/L)時，斑馬魚鰓、肌肉和心臟中的Hsp47基因表達極其顯著升高(P<0.001)；在中度低氧脅迫(2.0 mg/L)時，斑馬魚肌肉中Hsp47基因表達比常氧條件下極其顯著升高(P<0.001)，

注：熱圖中每個方格表示HSP蛋白家族基因在低氧脅迫下的表達量豐度，豐度隨顏色由綠到黑到紅依次增加。綠色代表低氧脅迫下表達量下調(diào)的基因，紅色代表低氧脅迫下表達量上調(diào)的基因Note：Heat map indicates HSP family genes expression abundance during increase from green color,then black to red color hypoxia stresses in a pane.Green indicates the down-regulated genes while red indicates up-regulated genes during the hypoxia stress圖1 低氧脅迫下HSP蛋白家族基因差異表達熱圖Fig.1 Heat map of the differential expression of HSP genes during hypoxia stress

在鰓中的表達也比常氧下的表達極顯著升高(P<0.01)。與常氧條件下相比，兩種低氧脅迫下，Hsp47基因在皮膚和腎臟中的表達量均極顯著下降(P<0.01)。

低氧脅迫下，在各組織中的大分子量蛋白基因Hsp90ab1表達量與Hsp47基因有明顯差異。從圖3可見：與常氧時相比，在重度低氧脅迫(1.0 mg/L)時，除心臟之外，斑馬魚鰓、肌肉、皮膚和腎臟中的Hsp90ab1基因表達極其顯著升高(P<0.001)；在中度低氧脅迫(2.0 mg/L)時，僅有鰓與肌肉中的Hsp90ab1基因表達量比常氧時極其顯著升高(P<0.001)，而心臟與腎臟中的Hsp90ab1基因表達量表現(xiàn)出顯著或極顯著下降(P<0.05或P<0.01)。

綜上所述，低氧脅迫下的斑馬魚，其Hsp47和Hsp90ab1基因在各組織中均有表達，且斑馬魚鰓和肌肉組織中兩種熱休克蛋白基因的表達量均為顯著增加?？梢酝茰y，斑馬魚鰓和肌肉中的熱休克蛋白在低氧應激中發(fā)揮重要作用。

注：*表示與對照組差異顯著(P<0.05);**表示與對照組差異極顯著(P<0.01);***表示與對照組差異極其顯著(P<0.001)，下同Note:*means significant difference compared with the control(P<0.05); **means very significant difference compared with the control(P<0.01); ***means very significant difference compared with the control(P<0.001)，et sequentia圖2 常氧與低氧脅迫下Hsp47基因在各組織中的表達量比較Fig.2 Relative expression of Hsp47 gene in different tissues in the zebrafish exposed to normoxia and hypoxia

圖3 常氧、低氧脅迫下Hsp90ab1基因在各組織中的表達量比較Fig.3 Relative expression of Hsp90ab1 gene in different tissues in zebrafish exposed to normoxia and hypoxia

本試驗中用Western Blot方法，檢測了常氧與低氧脅迫下斑馬魚鰓中HSP47和HSP90ab1蛋白的表達。如圖4所示，在中度低氧(2.0 mg/L)與重度低氧(1.0 mg/L)脅迫下，斑馬魚鰓中的HSP47和HSP90ab1蛋白表達量均顯著高于常氧條件下的蛋白表達量(P<0.05)。

圖4 常氧與低氧脅迫下鰓中HSP47和HSP90ab1蛋白的表達Fig.4 Protein expressions of HSP47 and HSP90ab1 in the gills of zebrafish exposed to normoxia and hypoxia

3 討論

3.1 低氧環(huán)境下熱休克蛋白的調(diào)控作用

氧濃度變化對生物體生存影響較大，在應對生存環(huán)境的氧氣條件改變時，生物體會產(chǎn)生熱激蛋白來應對這一變化，包括Hsp70、Hsp90和Hsp27等基因[15]。研究表明，當小鼠急速運動后處于低氧狀態(tài)時，檢測小鼠腓腸肌中Hsp70的表達，發(fā)現(xiàn)低氧與常氧相比，其表達量明顯上升；進一步將急性低氧處理后的小鼠放在低氧環(huán)境和常氧環(huán)境中觀察，發(fā)現(xiàn)小鼠腓腸肌中Hsp70在低氧環(huán)境下表達量更高[16]。HIFs低氧誘導因子，在低氧狀態(tài)下會大量表達，而HSPs熱激蛋白基因中大多數(shù)是HIFs基因的靶基因。低氧狀態(tài)下HIF-1可以誘導Hsp70的轉錄[17-18]；HSP70蛋白也可通過VHL途徑調(diào)控HIF-1α使其降解[19-20]。還有研究發(fā)現(xiàn)，果蠅在經(jīng)過低氧處理后，血紅細胞中HSP70蛋白過表達的果蠅更耐低氧[21]。HSP90也是一種重要的應對氧氣改變的應激蛋白。研究顯示，急性低氧處理大鼠后，大鼠心肌細胞內(nèi)的Hsp90 mRNA表達量明顯增加[22]，而對大鼠先進行慢性間歇性低壓低氧處理，再進行急性低氧處理，可檢測到大鼠心肌細胞中的Hsp27、Hsp70 mRNA的表達量顯著升高[23]。可見，大鼠的心肌細胞通過增加Hsp27、Hsp70、Hsp90 mRNA的表達來保護心肌細胞免受低氧損傷[24]。面對水體中溶解氧含量的降低，魚類也會通過調(diào)節(jié)自身的生理活動來應對環(huán)境的改變，其中應激蛋白起到不可忽視的作用[25]。

3.2 低氧環(huán)境下斑馬魚熱休克蛋白基因的表達差異

本研究中選取模式生物斑馬魚作為研究對象，將其分別放于重度低氧(1.0 mg/L)和中度低氧(2.0 mg/L)的環(huán)境中馴化兩周，運用高通量測序測定斑馬魚在兩個低氧濃度下鰓組織中熱應激蛋白基因的變化情況，檢測到在整個斑馬魚體內(nèi)由低氧引起顯著改變的熱激蛋白基因有28個。在表達量上升的16個基因中，除Hsp90ab1基因的分子量較大外，其他基因均為Hsp40同源基因，均為小分子HSPs蛋白家族基因(圖1)。而在表達量下降的熱休克蛋白基因中，除Hsp90aa1.2和Hsp70.3兩個基因屬于大分子熱休克蛋白基因外，大多數(shù)是小分子的HSPs蛋白家族基因(圖1)?？梢酝茰y，斑馬魚在面對低氧應激時，小分子HSPs顯得更為重要。其他類似研究也表明，小分子HSPs在應對脅迫時，由于其特殊的分子結構和較強的分子伴侶功能，所起到的作用更大[26-27]。

熱休克蛋白HSP47是熱休克蛋白家族中唯一具有膠原特異性的小分子蛋白，首次在小鼠的內(nèi)胚層細胞中分離出來[28]。大多數(shù)研究表明，HSP47主要分布在生物體的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，參與膠原前體的加工、折疊、合成和分泌等過程，它同時參與了細胞生長、增殖等生理活動[29]。當生物體遭遇外界刺激時，HSP47通過調(diào)節(jié)蛋白運輸、聚集和解離等活動來起到保護細胞的作用[28]。HSP90ab1屬于大分子的熱休克蛋白，不僅參與細胞信號傳導、細胞增殖和分化等調(diào)控過程，也參與細胞的氧化損傷保護等調(diào)控[30]。同時也有研究表明，Hsp47與Hsp90ab1基因是低氧應答基因HIF的靶基因，參與HIF低氧作用下的調(diào)控機制，在生物體面對低氧刺激時起到必不可少的作用[19]。

本研究中發(fā)現(xiàn)，低氧脅迫下，Hsp47和Hsp90ab1基因在鰓和肌肉中的mRNA 表達量顯著高于其他組織(皮膚、心臟和腎臟)中的表達量(圖2、圖3)，這表明鰓和肌肉中的熱休克蛋白在低氧應激中起著重要作用。鰓是大多數(shù)水生生物直接與水環(huán)境接觸，進行氧氣交換的器官，在應對環(huán)境中氧氣改變時，表現(xiàn)出強烈的改變。本研究中還發(fā)現(xiàn)，在應對重度低氧(1.0 mg/L)脅迫時，Hsp47、Hsp90ab1基因在大多數(shù)組織中的表達量明顯高于中度低氧(2.0 mg/L)脅迫與常氧組(圖2，圖3)?？梢酝茰y，氧濃度越低，組織應對低氧濃度的反應越強烈。有研究檢測到，在子癇患者體內(nèi)隨病情的加重其體內(nèi)的低氧應答基因HIF和熱激蛋白基因Hsp70的表達量均呈正相關?？梢?，低氧脅迫下，氧濃度越小，其熱激蛋白的表達量也會隨之增加[31]。

由此可知，當生物體的生存環(huán)境發(fā)生改變時，熱激蛋白是機體應對環(huán)境變化時所產(chǎn)生的最重要蛋白之一。本研究結合轉錄組測序、生物信息學、Western blot等手段，挖掘出HSP47和HSP90ab1蛋白可能是斑馬魚低氧應激中最重要的熱休克蛋白成員，具有重要的適應功能。這些研究結果也為后續(xù)進一步描繪斑馬魚低氧應答網(wǎng)絡奠定了基礎。