黃春艷 周微 劉金麗 佟雷 王妍 邵麗麗 史嘉翊

【摘要】 目的：分析熊膽粉用于運動性疲勞大鼠抗疲勞作用及其作用機理，旨在為開發(fā)緩解疲勞和提高運動能力的系列天然產(chǎn)品提供可靠的實驗室依據(jù)。方法：將50只wistar大鼠根據(jù)隨機數(shù)字表法分為五組，每組各10只，分別為空白對照組（未給藥未運動）、疲勞模型組（未給藥的運動大鼠）、高劑量給藥組[2.8 g/（kg·d）熊膽粉]、中劑量給藥組[1.4 g/（kg·d）熊膽粉]、低劑量給藥組[0.7 g/（kg·d）熊膽粉]?？瞻讓φ战M和疲勞模型組大鼠每日給予相應(yīng)劑量的蒸餾水。末次灌胃給予熊膽粉溶液后，將各組大鼠分別置于段氏實驗跑臺，觀察其初始時刻狀態(tài)，記錄并對比各組大鼠跑臺運動時間;取血，檢測并對比各組大鼠血清血乳酸（BLA）、尿素氮（BUN）表達及乳酸脫氫酶（LDH）活力;取血后將大鼠處死，取大鼠肝臟，精密稱取100 mg，另取各實驗組大鼠后肢大腿內(nèi)側(cè)肌肉組織100 mg，檢測并對比其肝糖原（LG）、肌糖原（MG）含量。結(jié)果：五組運動大鼠中，高劑量給藥組運動時間>中劑量給藥組>低劑量給藥組>疲勞模型組，組間兩兩比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。五組大鼠中，空白對照組血清BLA、BUN表達、LDH活力最低，后依次為高劑量給藥組、中劑量給藥組、低劑量給藥組，疲勞模型組最高。血清BLA、BUN表達五組組間兩兩比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;中劑量給藥組與高劑量給藥組LDH活力比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），其他組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。五組大鼠中，高劑量給藥組大鼠LG、MG表達均最高，后依次為中劑量給藥組、低劑量給藥組，疲勞模型組表達均最低;各組MG含量組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;中劑量給藥組與低劑量給藥組LG含量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）;其他組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：熊膽粉能夠提高運動性疲勞大鼠LDH活力，增加其LG與MG含量，使大鼠BLA含量降低，運動耐力大大增強，藥物抗運動性疲勞效果理想。

【關(guān)鍵詞】 運動性疲勞 熊膽粉 抗疲勞作用

[Abstract] Objective： To analyze the anti-fatigue effect of bear bile powder in rats with exercise-induced fatigue and its mechanism of action， and to provide reliable laboratory basis for the development of a range of natural products that relieve fatigue and improve athletic performance. Method： A total of 50 wistar rats were divided into 5 groups according to random number table， with 10 rats in each group， they were blank control group （without administration and exercise）， fatigue model group （exercised rats were without administration）， high-dose administration group （exercised rats were given 2.8 g/kg Bear Bile Powder）， middle-dose administration group （exercised rats were given 1.4 g/kg Bear Bile Powder）， low-dose administration group （exercised rats were given 0.7 g/kg Bear Bile Powder）. The rats in blank control group and fatigue model group were given same dose of distilled water each day. After the last gavage with Bear Bile Powder solution， each group of rats was placed on the Duans experimental treadmill， the initial time state was observed， and the treadmill running time of each group of rats were recorded and compared. The blood of rats were taken， the blood lactic acid （BLA）， blood urea nitrogen （BUN） expression and lactate dehydrogenase （LDH） activity in each group were detected and compared. After taking the blood， the rats were sacrificed and the liver of the rats were taken. 100 mg inner thigh muscle tissue of the hind limbs of rats were taken， and the contents of liver glycogen （LG） and muscle glycogen （MG） were detected and compared. Result： Among five groups of exercised rats， the exercise time of high-dose administration group was longer than that of middle-dose administration group， low-dose administration group and fatigue model group， and the difference was statistically significant between two groups （P<0.05）. Among five groups of rats， the serum BLA， BUN expression and LDH activity in blank control group were the lowest， followed by high-dose administration group， middle-dose administration group， and low-dose administration group， and fatigue model group was the highest. The statistical analysis found that there was statistical difference in the expression of serum BLA and BUN among five groups （P<0.05）. There was no statistical difference in the LDH activity between middle-dose administration group and high-dose administration group （P>0.05）， but there was statistical difference between other two groups （P<0.05）. Among five groups of rats， the expression of LG and MG were the highest in the high-dose administration group， followed by the middle-dose administration group and low-dose administration group， and the expression of fatigue model group was the lowest. The statistical analysis found that there was significant difference in the content of MG between two groups （P<0.05）; There was no statistical difference in the content of LG between middle-dose administration group and high-dose administration group （P>0.05）， but there was statistical difference between other two groups （P<0.05）. Conclusion： Bear Bile Powder for rats with exercise-induced fatigue can increase LDH activity， increase LG and MG contents， decrease BLA in rats， enhance exercise tolerance， and achieve ideal anti-fatigue effect.

[Key words] Exercise-induced fatigue Bear Bile Powder Anti-fatigue effect

First-authors address： Mudanjiang Medical University， Mudanjiang 157011， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2019.31.007

運動性疲勞是指運動導(dǎo)致的肌肉最大輸出功率或最大收縮暫時性下降的一種生理現(xiàn)象，肌肉運動能力下降是其主要標(biāo)志與本質(zhì)特性[1]。隨著現(xiàn)代競技體育發(fā)展，人們運動強度越來越大，尤其是青壯年人群，運動性疲勞發(fā)生率越來越受人們重視，現(xiàn)已成為運動醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究熱點[2]。正常情況下，運動性疲勞只是一種生理現(xiàn)象，是機體的自我保護，屬于超量恢復(fù)的一個良性過程。適度的運動性疲勞若施以合理干預(yù)，能夠幫助機體機能水平恢復(fù)與提高，反之若未及時恢復(fù)或治療，不斷累積的疲勞會引起過度疲勞導(dǎo)致力竭，生理性的運動性疲勞會轉(zhuǎn)變?yōu)椴±硇赃\動性疲勞，嚴(yán)重傷害運動機體[3-4]?？梢?，給予運動性疲勞患者早期合理治療干預(yù)的重要性。

目前，運動性疲勞治療主要方法包括心理療法、藥物療法、物理療法等手段，主要是為了緩解患者運動疲勞，提高其機體運動能力，但治療效果均無法達到預(yù)期[5]。隨著人們對中醫(yī)藥的重視，加之其治療的特性，越來越多的研究證實，中藥干預(yù)運動性疲勞效果理想，且具有安全性[6]。運動性疲勞在祖國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中類似于“勞損”“勞倦”“虛勞”，藥物治療方面有活血行氣藥、補虛藥等[7]。熊膽粉是人工引流熊膽干燥品，現(xiàn)已被國家衛(wèi)生部批準(zhǔn)作為新藥使用，其性寒、味苦，入脾、肝、膽、大腸、胃經(jīng)，具有平肝明目之功。現(xiàn)代藥理學(xué)研究證實，熊膽粉化學(xué)成分復(fù)雜，經(jīng)其制作而成的熊膽粉制劑有一定抗疲勞之效，加之該藥能保肝利膽，故可考慮將其運用至運動性疲勞的治療中[8-9]。但目前并無研究證實其用于運動性疲勞的價值。本研究通過分析熊膽粉的抗疲勞作用及其作用機理，旨在為開發(fā)緩解疲勞和提高運動能力的系列天然產(chǎn)品提供可靠的實驗室依據(jù)，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 于2017年10月12日購入50只雄性Wister大鼠，大鼠日齡3～7 d，平均（5.0±2.0）d;體重230～270 g，平均（250.0±20.0）g。隨機將50只大鼠分為五組，每組各10只，分別為空白對照組、疲勞模型組、高劑量給藥組、中劑量給藥組、低劑量給藥組。各組大鼠常規(guī)分籠飼養(yǎng)，自由進食飲水，自然光照?？瞻讓φ战M大鼠日齡3～5 d，平均（4.0±1.0）d;體重230～250 g，平均（240.0±10.0）g。疲勞模型組大鼠日齡4～6 d，平均（5.0±1.0）d;體重240～260 g，平均（250.0±10.0）g。高劑量給藥組大鼠日齡3～7 d，平均（5.0±2.0）d;體重230～260 g，平均（245.0±15.0）g。中劑量給藥組日齡3～6 d，平均（5.5±1.5）d;體重230～270 g，平均（250.0±20.0）g。低劑量給藥組大鼠日齡3～5 d，平均（4.0±1.0）d;體重240～260 g，平均（250.0±10.0）d。各組大鼠一般資料比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。

1.2 方法 空白對照組未運動。建立疲勞模型大鼠，建模方法：在22～25 ℃的室溫下，將40只需要制備模型的大鼠放置在直徑為150 cm，高為60 cm，水深為40 cm，水溫為25～30 ℃的Morris水迷宮水槽中進行游泳訓(xùn)練，在大鼠下腹部掛10 g鉛團負(fù)重游泳，每次將同組的大鼠一起放入，以大鼠口鼻被水淹沒7 s中為宜，后撈起。撈起后續(xù)迅速將大鼠吹干。訓(xùn)練時間：1次/d，6次/周，間隔1 d休息，共訓(xùn)練5周。給藥方法：空白對照組未給藥，疲勞模型組為運動大鼠但未給藥，高劑量給藥組給予熊膽粉2.8 g/（kg·d），中劑量給藥組給予熊膽粉1.4 g/（kg·d），低劑量給藥組給予熊膽粉0.7 g/（kg·d），其中空白對照組與疲勞模型組每日給予對應(yīng)劑量的蒸餾水。大鼠跑臺運動時間測定：末次灌胃給予熊膽粉溶液后，將疲勞模型組、高劑量給藥組、中劑量給藥組及低劑量給藥組大鼠分別置于段氏實驗跑臺，觀察大鼠初始時刻狀態(tài)，此時大鼠應(yīng)激性表現(xiàn)強烈，經(jīng)過在跑臺的運動后，大鼠體現(xiàn)出疲勞狀態(tài)，此時大鼠應(yīng)激性反應(yīng)與逃避反應(yīng)能力均顯著下降，出現(xiàn)此狀態(tài)后分別記錄各組大鼠跑臺運動時間。全部大鼠給藥干預(yù)觀察時間均為5周。

1.3 觀察指標(biāo)與檢測方法 （1）運動時間：檢測記錄并對比五組大鼠運動時間，即開始運動至力竭時間。（2）大鼠血清中血乳酸（Blood lactic acid，BLA）、尿素氮（Urea nitrogen，BUN）表達及乳酸脫氫酶（Lactate dehydrogenase，LDH）活力測定：使用0.25 mL/100 g 3%戊巴比妥鈉腹腔注射，麻醉跑步運動后疲勞大鼠，將其固定于解剖臺上，將其腹腔剪開并扒開內(nèi)臟，經(jīng)其腹主動脈采血4 mL，各組大鼠血液樣本經(jīng)2 000 r/min離心后，使用吸管收集上清液，使用Olympus Au400型全自動生化分析儀檢測大鼠BLA、BUN含量;使用深圳晶美生物工程有限公司提供的乳酸脫氫酶試劑盒，經(jīng)分光光度法檢測其表達。（3）大鼠肝糖原（Liver Glycogen，LG）、肌糖原（Muscle glycogen，MG）貯備量檢測：每只大鼠在完成取血后，將其處死，立即取肝臟與骨骼肌組織各100 mg，使用0.95%冰生理鹽水洗凈，使用濾紙將水分吸干，向內(nèi)投入10%中性福爾馬林溶液固定1～2 d，切片后制作組織切片。使用深圳深圳晶美生物工程有限公司提供的試劑盒檢測大鼠肝臟LG與肌肉MG。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，以（x±s）表示計量資料，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，計數(shù)資料以率（%）表示，比較采用字2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 五組運動大鼠運動時間比較 疲勞模型組、高劑量給藥組、中劑量給藥組、低劑量給藥組運動大鼠運動時間分別為（5.26±0.48）、（9.03±0.56）、（8.69±0.71）、（8.12±0.65）min，高劑量給藥組運動時間>中劑量給藥組>低劑量給藥組>疲勞模型組，組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（F=62.229，P<0.001）。

2.2 五組大鼠血清中BLA、BUN表達及LDH活力比較 五組大鼠中，空白對照組血清BLA、BUN表達、LDH活力最低，后依次為高劑量給藥組、中劑量給藥組、低劑量給藥組，疲勞模型組最高。血清BLA、BUN表達五組間兩兩比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;中劑量給藥組與高劑量給藥組LDH活力比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），其他組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

2.3 五組大鼠LG、MG含量比較 五組大鼠中，高劑量給藥組大鼠LG、MG表達均最高，后依次為中劑量給藥組、低劑量給藥組，疲勞模型組表達均最低。各組MG含量組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;中劑量給藥組與低劑量給藥組LG含量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），其他組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

3 討論

運動性疲勞是一種常見生理反應(yīng)，可直接影響機體運動水平正常發(fā)揮，影響運動性疲勞的因素多樣，其中代謝性產(chǎn)物的堆積帶來的影響最為劇烈，如蛋白質(zhì)代謝產(chǎn)物尿素氮與糖酵解代謝產(chǎn)物乳酸等[4]。

短時間劇烈運動后，受到心肺功能的限制，短時間內(nèi)無法滿足糖完全氧化需要的氧供，肌肉細胞將處于缺氧狀態(tài)，此時主要依靠機體內(nèi)糖的無氧酵解途徑提供給運動需要的能量，乳酸是糖酵解后主要產(chǎn)物，此時大量的乳酸會堆積于骨骼中，并釋放進入血液中，大大增加機體內(nèi)血乳酸含量[10-11]。機體在正常的狀態(tài)下，其乳酸的合成分泌及清除是一個動態(tài)平衡的狀態(tài)，當(dāng)機體內(nèi)乳酸的合成分泌量超出清除量時，大量累積的乳酸將對內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定產(chǎn)生影響，降低機體運動能力，最終誘發(fā)運動疲勞[12]。應(yīng)曉明等[13]在2009年的研究中發(fā)現(xiàn)，疲勞大鼠血乳酸表達顯著高于健康對照組，該研究認(rèn)為乳酸的累積是產(chǎn)生運動性疲勞的一大外周機制。還有研究認(rèn)為，運動組大鼠血漿乳酸含量較安靜組大鼠高，減少乳酸堆積后可改善疲勞狀態(tài)[14]。本研究結(jié)果顯示，較空白對照組，疲勞模型組大鼠BLA含量更高，該結(jié)果與上述研究結(jié)果一致，提示乳酸堆積可能是誘發(fā)運動性疲勞的主要機制，在干預(yù)時可由此機制著手。在正常的生理條件下，蛋白質(zhì)基本不參與提供能量，若長時間劇烈運動，將破壞體內(nèi)能量系統(tǒng)，此時氨基酸與蛋白質(zhì)分解代謝增強，氨將在肝臟內(nèi)轉(zhuǎn)變?yōu)槟蛩氐?，并向血液?nèi)滲透增加血液內(nèi)尿素氮含量，最終誘發(fā)運動性疲勞[15]。本研究結(jié)果顯示，較空白對照組，疲勞模型組大鼠血清BUN水平更高，可見降低機體尿素氮水平是提高機體抗運動性疲勞的關(guān)鍵所在。肝臟是機體重要器官，在運動期間起到關(guān)鍵作用，肝臟耗氧量在大腦之后，對缺氧敏感度極高。肝臟在機體處于有氧代謝時，肝糖原每摩爾會合成并分泌38 mol ATP，但若在無氧代謝情況下，合成并分泌的ATP僅有3 mol，劇烈運動會大量消耗掉肝糖原，導(dǎo)致機體缺氧，此時肝臟的有氧代謝出現(xiàn)異常，其所需來源主要依賴于肝細胞無氧酵解，ATP生成降低對機體運動能力產(chǎn)生影響，故誘發(fā)疲勞[16]。

既往開展的物理、藥物治療等干預(yù)手段用于運動性疲勞雖有一定效果，但應(yīng)用價值未能達到預(yù)期，現(xiàn)有研究認(rèn)為可采取中醫(yī)藥干預(yù)。運動性疲勞在中醫(yī)學(xué)中無概念，根據(jù)其臨床表現(xiàn)，現(xiàn)代醫(yī)家將其歸屬于“勞倦”等范疇，認(rèn)為其發(fā)生發(fā)展主要因氣血虧損導(dǎo)致對應(yīng)臟腑生理功能失調(diào)或功能障礙引起，可為其選擇保肝抗疲勞之藥[17]。熊膽是熊科動物棕熊或黑熊的干燥膽囊，熊膽粉作為熊科動物黑熊經(jīng)膽囊手術(shù)引流膽汁而得的干燥品，其性寒、味苦，入肝、膽、脾、大腸、胃經(jīng)，具有平肝、清熱、名目之功，現(xiàn)代藥理學(xué)證實，熊膽粉化學(xué)成分復(fù)雜，主要有鵝去氧膽酸、熊去氧膽酸、膽酸、去氧膽酸、膽色素、膽固醇等，其中熊去氧膽酸是其重要成分[18]。瞿鳳國[19]發(fā)現(xiàn)，復(fù)方熊膽粉制劑能通過延長爬桿時間與游泳時間來提高運動耐力，提高肝糖原含量，降低BLA與BUN含量，從而提高乳酸脫氫酶活力，為機體提供更多能力，增強抗疲勞能力，延緩運動性疲勞產(chǎn)生，進一步提高機體對運動負(fù)荷適應(yīng)能力。基于此結(jié)論，本研究對比分析了不同組別大鼠未使用/使用不同劑量熊膽粉后運動各血清學(xué)指標(biāo)水平結(jié)果顯示，疲勞模型組運動時間最短，高劑量給藥組最長，且疲勞模型組血清BLA、BUN表達最高，LG、MG表達最低，而其他各組運動大鼠在接受不同劑量熊膽粉治療后，血清BLA、BUN表達降低，LG、MG表達升高，該結(jié)果與上述研究結(jié)果基本一致，提示熊膽粉可通過降低血清BLA、BUN表達，提高LG、MG表達，增強大鼠運動耐力與抗運動性疲勞能力。

綜上所述，熊膽粉能夠提高運動性疲勞大鼠LDH活力，增加其LG與MG含量，使大鼠BLA含量降低，運動耐力增強，藥物抗運動性疲勞效果理想，為下一步探討熊膽粉對運動性疲勞的效果與機制提供了良好的運動性疲勞動物模型。

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（收稿日期：2019-04-29） （本文編輯：周亞杰）