王歡歡, 譚斯尹, 王慧, 杜虹, 侯濤, 陳賢建, 黎俊珺, 黃瑩

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ATS藻板與自然礁石上藻群生物多樣性的比較

王歡歡, 譚斯尹, 王慧, 杜虹, 侯濤, 陳賢建, 黎俊珺, 黃瑩

汕頭大學(xué)生物系, STU-UNIVPM藻類聯(lián)合研究中心, 廣東 汕頭 515063

ATS(algal turf scrubber)系統(tǒng)是一種利用潮間帶藻類高效去除富營(yíng)養(yǎng)化水體中氮(N)、磷(P)元素的水質(zhì)凈化系統(tǒng), 藻類是支持整個(gè)系統(tǒng)最重要的組成部分, 其群落結(jié)構(gòu)與水質(zhì)凈化效果密切相關(guān)。該研究基于Illumina MiSeq平臺(tái)的高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)海水水族缸的ATS系統(tǒng)中藻板樣品和自然礁石上的藻類進(jìn)行多樣性分析。18S rDNA研究結(jié)果表明, ATS系統(tǒng)中經(jīng)篩選得到藻類優(yōu)化序列21390條, 其中對(duì)絲藻屬占主要地位, 占序列總數(shù)的22.79%, 其次19.07%序列歸入斜紋藻屬; 宋井、展南亭、后宅3個(gè)地區(qū)的藻類經(jīng)篩選分別得到88435、87129、106458條優(yōu)化序列, 主要為分枝色指藻屬、寬果藻屬和日本馬澤藻屬。ATS系統(tǒng)和自然環(huán)境樣品共有的優(yōu)勢(shì)藻為骨條藻屬和仙菜屬。本實(shí)驗(yàn)在研究ATS系統(tǒng)與自然礁石上的藻類群落相似性的同時(shí), 深入探究了其群落結(jié)構(gòu)的差異性, 為進(jìn)一步優(yōu)化ATS系統(tǒng)的功能提供了理論依據(jù)。

ATS系統(tǒng); 高通量測(cè)序; 藻類多樣性; 潮間帶藻

潮間帶藻類過濾法(algal turf scrubber), 簡(jiǎn)稱ATS, 是最早由Adey博士在19世紀(jì)80年代提出的一種水處理方法(Adey, 1982)。Smithsonian海水系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室的Walter Adey博士將其應(yīng)用于海水觀賞水族缸養(yǎng)殖系統(tǒng), 通過ATS系統(tǒng)中的潮間帶藻類吸收水中的營(yíng)養(yǎng), 凈化養(yǎng)殖水體(單樂州等, 2014)。作為ATS系統(tǒng)中最核心裝置的藻板, 是由潮間帶藻類為主構(gòu)成的微型生態(tài)系統(tǒng), 包括藻類、細(xì)菌、真菌和少量浮游生物等。該系統(tǒng)中藻類能快速吸收水體中的氮、磷等營(yíng)養(yǎng)鹽, 維持水質(zhì)清潔, 還能為水族缸提供微小浮游生物等, 作為珊瑚、魚類等的餌料, 是一種溫和而有效的生態(tài)型水處理方法, 特別適合于海水養(yǎng)殖系統(tǒng)的水體凈化。近年來, 國(guó)內(nèi)已有公司將ATS系統(tǒng)成功應(yīng)用于小丑魚養(yǎng)殖的水體凈化(方濤等, 2012; 單樂州等, 2016; 張艷敏等, 2017)。藻板的凈水效果與其中藻類的組成以及微生物的群落結(jié)構(gòu)密切相關(guān), 因此, 對(duì)ATS系統(tǒng)中藻板上的藻類及微生物多樣性研究十分重要。然而, 多數(shù)使用者一般只關(guān)注于藻板培育的條件摸索, 但對(duì)于其生物多樣性研究并未有系統(tǒng)性研究。

由于藻類、微生物均存在種類繁多、種屬間差異細(xì)微以及部分微藻在培養(yǎng)觀察中形態(tài)容易發(fā)生變異等限制因素, 傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)分類法在藻類和微生物的快速鑒定中還存在著許多不足。所以, 近年許多研究者將分子生物學(xué)手段應(yīng)用到藻類和微生物的快速鑒定中(劉京等, 2005)?，F(xiàn)代分子生物技術(shù)的蓬勃發(fā)展為群落多樣性、物種豐度提供了越來越豐富的研究方法。高通量測(cè)序作為下一代測(cè)序技術(shù)近年來迅速發(fā)展起來, 它具有測(cè)序準(zhǔn)確率高、耗時(shí)短以及信息處理量大等優(yōu)點(diǎn), 結(jié)合生物信息學(xué)的數(shù)值分析, 能科學(xué)地表征或預(yù)測(cè)藻類和微生物的群落結(jié)構(gòu)(李克亞等, 2016)。本研究通過MiSeq平臺(tái)高通量測(cè)序分析ATS系統(tǒng)的藻板樣品和自然礁石上潮間帶藻樣品, 比較自然礁石潮間帶藻類和ATS系統(tǒng)藻板上生物多樣性的不同, 以期獲得不同種群的生物多樣性特征, 為后續(xù)研究ATS藻板上的藻類對(duì)營(yíng)養(yǎng)鹽的吸收能力以及優(yōu)化藻板結(jié)構(gòu)提供理論依據(jù), 同時(shí)也為ATS藻板在海水養(yǎng)殖水體凈化上的進(jìn)一步應(yīng)用提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 樣本的采集

2016年9月, 在廣東省汕頭市永亨生物科技有限公司的ATS系統(tǒng)藻類培育室中進(jìn)行ATS藻板上的海藻采集。利用五點(diǎn)采樣法在藻板進(jìn)行樣本采集, 共采集5組藻類樣本(該ATS系統(tǒng)引用水體為廣東省汕頭市南澳縣南澳島的海水)。

2017年5月, 在廣東省汕頭市南澳縣南澳島的3個(gè)不同位置(宋井、展南亭、后宅, 具體地理位置見表1)潮間帶的礁石上進(jìn)行藻類采集, 分別標(biāo)號(hào)為sj、znt和hz, 每組采集3組樣本, 共采集9組藻類樣本。

1.2 藻類樣本全基因組DNA的提取

將采集的藻類用無菌水清洗3次, 用吸水紙吸干, 稱取0.1g樣品, 在液氮冷凍條件下將樣品研磨成粉末狀, 使用植物基因組DNA提取試劑盒 (DP305) (天根生化, 北京)提取全基因組DNA, 根據(jù)說明書操作。

1.3 全基因組測(cè)序

將DNA樣品送往生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行高通量測(cè)序及分析, 海藻的基因組的擴(kuò)增采用18sRNA通用引物對(duì)V4F/V4R。

V4F: 5′-GGCAAGTCTGGTGCCAG-3′;

V4R: 5′-ACGGATCTRATCRTCTTCG-3′。

1.4 測(cè)序結(jié)果分析

1.4.1 數(shù)據(jù)預(yù)處理

將去除嵌合體的序列與數(shù)據(jù)庫(kù)代表性序列在美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心 (National Center for Biotechnology Information , NCBI)中的BLAST(https:// blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)工具進(jìn)行對(duì)比, 剔除低于閾值的序列, 最后得到優(yōu)質(zhì)序列。

1.4.2 操作分類單元(Operational Taxonomic Units , OTU)分類

使用QIIME(Quantitative Insights Into Microbial Ecology, http://qiime.org/)軟件中的Usearch程序?qū)⑺袠颖景凑招蛄虚g的距離進(jìn)行聚類, 然后根據(jù)序列之間的97%相似性將序列分成不同的操作分類單元(OTU)。

1.4.3 稀疏曲線的建立

本實(shí)驗(yàn)使用97%相似度的OTU, 在Mothur(http:// mothur.org/)軟件上用rarefaction.single命令做稀釋曲線分析, 利用R(https://www.r-project.org/)軟件制作豐富度(richness)和香農(nóng)(Shannon)指數(shù)曲線圖。

1.4.4 群落結(jié)構(gòu)圖的構(gòu)建

對(duì)OTU聚類結(jié)果與對(duì)應(yīng)代表性序列統(tǒng)計(jì)結(jié)果在屬的水平上進(jìn)行處理, 對(duì)于豐度百分比低于1%的物種視為稀少物種, 大于等于1%的物種視為優(yōu)勢(shì)物種。然后對(duì)優(yōu)勢(shì)物種的豐度百分比進(jìn)行柱狀圖處理分析。

使用Hemi(https://www.r-project.org/)軟件對(duì)物種豐度進(jìn)行屬水平的矩陣?yán)L圖, 同時(shí)熱圖對(duì)樣本進(jìn)行聚類。為了展示效果, 只顯示豐度最高的前50個(gè)物種分類信息, 其余的物種分類合并成其他(other)。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣本序列信息和多樣性指數(shù)

從表1可知, 通過各樣本的Shannon、Chao1、Simpson多樣性指數(shù)的對(duì)比發(fā)現(xiàn), 總體上看, ATS系統(tǒng)的藻類的數(shù)量和種類均多于3個(gè)自然地區(qū); 而3個(gè)自然地區(qū)之間相比較, 發(fā)現(xiàn)展南亭的藻類數(shù)量和種類最多, 其次是宋井, 最低是后宅, 表明了ATS系統(tǒng)的藻類群落多樣性比3個(gè)自然地區(qū)豐富。

表1 每個(gè)樣品藻類群落的OTU、豐富度指數(shù)、多樣性指數(shù)和測(cè)序覆蓋范圍

Shannon曲線和稀疏曲線可以反映實(shí)驗(yàn)測(cè)序深度是否足夠大和數(shù)據(jù)是否合理。圖1中a和b說明了OTU數(shù)目隨著樣本序列數(shù)的增加, 趨勢(shì)趨緩, 基本達(dá)到平臺(tái)期, 說明獲取了大多數(shù)樣品信息, 基本能夠反映研究樣本的藻類群落結(jié)構(gòu)。從圖1c和d可以看出, 隨著測(cè)序數(shù)量的增加, Shannon曲線趨向平坦, 說明測(cè)序量合理, 測(cè)序數(shù)據(jù)量足夠大, 能夠反映樣本中的絕大多數(shù)藻類信息。

圖1 自然藻類稀疏曲線(a)、ATS系統(tǒng)藻類稀疏曲線(b)、自然藻類Shannon曲線(c)和ATS系統(tǒng)藻類Shannon曲線(d)

2.2 藻類群落結(jié)構(gòu)分析

根據(jù)Sliva數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)樣品18S rDNA測(cè)序序列進(jìn)行比對(duì)。從圖2可知, 在ATS系統(tǒng)中, 優(yōu)勢(shì)藻有對(duì)絲藻屬、斜紋藻屬, 隱藻屬、羽紋藻屬、海門冬藻屬、爬管藻屬、骨條藻屬、仙菜屬、曲舟藻屬、紅孢囊藻, 分別占總序列數(shù)22.79%、19.07%、12.68%、11.17%、9.63%、7.90%、5.92%、4.17%、3.74%、2.93%。優(yōu)勢(shì)藻種多數(shù)屬于紅藻和硅藻。其中對(duì)絲藻屬、海門冬藻屬、仙菜屬屬于大型藻類, 其余的為微型藻類。

在宋井(sj)藻類樣本中, 優(yōu)勢(shì)藻有分枝色指藻屬、石花菜屬、日本馬澤藻屬、縱胞藻屬、角毛藻、基扇耳殼藻、骨條藻屬、阿米巴藻, 分別占總序列數(shù)39.28%、20.75%、12.52%、5.33%、5.24%、4.53%、3.40%、1.68%。其中, 鑒定出非藻類生物馬拉色霉菌屬和鈣質(zhì)海綿亞綱占5.36%和1.89%。優(yōu)勢(shì)藻多屬于紅藻門和硅藻門。其中石花菜屬、日本馬澤藻屬、縱胞藻屬屬于大型藻類, 其余的為微型藻類。

在展南亭(znt)藻類樣本中, 優(yōu)勢(shì)藻有寬果藻屬、莖刺藻屬、沙哈林藻屬、夜光藻屬、阿米巴藻、分枝色指藻屬、斯氏藻屬, 分別占總序列數(shù)32.26%、27.24%、18.92%、10.97%、4.15%、2.90%、1.91%。優(yōu)勢(shì)藻多數(shù)屬于紅藻門和甲藻門。其中莖刺藻屬、沙哈林藻屬、分枝色指藻屬屬于大型藻類, 其余的為微型藻類。

在后宅(hz)藻類樣本中, 優(yōu)勢(shì)藻有日本馬澤藻屬、石花菜屬、菱形藻屬、錐狀斯氏藻、仙菜屬、角甲藻屬、骨條藻屬, 分別占總序列數(shù)32.72%、26.71%、10.78%、3.18%、2.33%、1.75%、1.34%。其中, 馬拉色菌屬占13.65%。多數(shù)優(yōu)勢(shì)藻屬于硅藻門和紅藻門。其中日本馬澤藻屬、石花菜屬、仙菜屬屬于大型藻類, 其余的為微型藻類。

圖2 屬水平上優(yōu)勢(shì)藻的群落結(jié)構(gòu)分布圖

根據(jù)優(yōu)勢(shì)藻用Hemi軟件制作群落結(jié)構(gòu)豐度圖。從圖3得知, 自然區(qū)域宋井(sj)、后宅(hz)和展南亭(znt)的藻種群落結(jié)構(gòu)具有較大程度的相似性, 三者均含有較大豐度的石莼、細(xì)柱藻角毛藻夜光藻和莖刺藻屬。ATS系統(tǒng)與3個(gè)自然地區(qū)的樣本在優(yōu)勢(shì)藻類上具有一定的相似性, 如這4種藻類群落均包括一定豐度的耳殼藻、溝鞭藻和硅藻, 說明ATS系統(tǒng)中的優(yōu)勢(shì)藻種結(jié)構(gòu)與自然環(huán)境中的優(yōu)勢(shì)藻種結(jié)構(gòu)上相似。另一方面, 在ATS系統(tǒng)中有的藻類在3個(gè)自然地區(qū)并不存在, ATS系統(tǒng)藻類群落中特有的對(duì)絲藻和海門冬藻, 且這部分藻類的豐度都在15%以下, 猜測(cè)可能的原因是: 1)公司在制作ATS系統(tǒng)的過程中, 為了平衡藻類結(jié)構(gòu)、增強(qiáng)藻類吸收營(yíng)養(yǎng)鹽的能力而對(duì)藻種做出了篩選, 改變了藻類群落結(jié)。2)ATS系統(tǒng)的生長(zhǎng)環(huán)境等因素較為穩(wěn)定, 附在藻板上的孢子能夠生長(zhǎng)成為藻類; 而自然礁石上環(huán)境相對(duì)惡劣, 耐受性差的藻類不能正常生長(zhǎng)甚至死亡。

3 討論

本研究利用Illumina MiSeq高通量測(cè)序平臺(tái), 對(duì)海水水族缸的ATS系統(tǒng)和3個(gè)地區(qū)的自然礁石進(jìn)行了藻類生物多樣性分析, 對(duì)二者的藻類樣品進(jìn)行18S rDNA測(cè)序。對(duì)ATS系統(tǒng)和3個(gè)地區(qū)自然礁石上的藻類樣品的18S rDNA測(cè)序, 最終分別得到21390和282022條優(yōu)質(zhì)序列, 二者分別產(chǎn)生842、1083個(gè)OUT, 獲得的主要藻類群落屬于紅藻門、硅藻門和甲藻門。

圖3 藻類群落在屬水平上的豐度熱圖

Fig. 3 Heatmap of the algal community on the genus level

通過Shannon、Simpson 和 Chao1 多樣性指數(shù)的比較, 發(fā)現(xiàn)ATS系統(tǒng)的藻類多樣性比自然礁石上藻類多樣性要高, 這也是和ATS系統(tǒng)的作用分不開的。ATS系統(tǒng)是由人為篩選吸收營(yíng)養(yǎng)鹽效率高的藻所組成的微生態(tài)結(jié)構(gòu), 具有較多不同的海藻; 而自然潮間帶藻群通常由一個(gè)屬或種的海藻為主, 其他少數(shù)的藻為輔, 因此藻類群落結(jié)構(gòu)比較單一, 所以藻類多樣性相對(duì)較低, 這有可能是因?yàn)樽匀画h(huán)境遭到人為的破壞、生存條件比較惡劣所致。三個(gè)地區(qū)的潮間帶藻群中, 展南亭的藻類生物多樣性最高, 其次是宋井, 最低是后宅, 這可能與不同海區(qū)的鹽度、溫度、酸堿度等理化條件不同有關(guān)。展南亭采樣點(diǎn)附近有排污口, 污水的排放導(dǎo)致海水營(yíng)養(yǎng)鹽濃度升高, 有助于藻類在此地生長(zhǎng); 而后宅雖然是個(gè)小鎮(zhèn), 居民較多, 但是當(dāng)?shù)鼐用裨谠摵^(qū)進(jìn)行大規(guī)模的龍須菜、紫菜等海產(chǎn)品養(yǎng)殖, 會(huì)導(dǎo)致該區(qū)域的營(yíng)養(yǎng)鹽相對(duì)較低, 藻類物種也相對(duì)單一, 造成藻多樣性較低。

比較ATS系統(tǒng)和3個(gè)地區(qū)自然礁石上的藻類群: 在ATS系統(tǒng)中, 對(duì)絲藻屬占主要地位, 占序列總數(shù)的22.79%, 其次19.07%的序列歸入斜紋藻屬, 有12.68%的序列屬于隱藻屬; 而自然礁石上, 分枝色指藻、寬果藻和日本馬澤藻占了主要地位, 分別占序列總數(shù)的39.28%、32.26%、32.72%; 二者的優(yōu)勢(shì)藻多屬于紅藻門和硅藻門, 共有的優(yōu)勢(shì)藻有仙菜屬和骨條藻屬。Gu等(2017)研究發(fā)現(xiàn), 骨條藻對(duì)銨態(tài)氮的最大吸收速率大于最大生長(zhǎng)速率, 說明骨條藻吸收銨態(tài)氮速率更快, 且在其生長(zhǎng)階段可以快速吸收銨態(tài)氮, 在自然環(huán)境中, 具有較強(qiáng)的適應(yīng)環(huán)境中氮變化的能力以及較強(qiáng)的貯存氮鹽的能力。李恒等(2012)發(fā)現(xiàn)紅藻門中一些大型海藻對(duì)水體中硝酸鹽和磷酸鹽的吸收效果明顯, 說明了ATS系統(tǒng)中部分功能藻類源于自然潮間帶藻。此外, 在ATS系統(tǒng)上不存在而在自然礁石上存在的其他優(yōu)勢(shì)藻, 例如日本馬澤藻、角毛藻等, 對(duì)營(yíng)養(yǎng)鹽具有較好的吸收效果, 如王翔宇等(2011)研究的6種大型海藻中, 日本馬澤藻和孔石莼對(duì)氮、磷營(yíng)養(yǎng)鹽的去除能力最強(qiáng), 且葉片較大的馬澤藻去除營(yíng)養(yǎng)的能力更強(qiáng)。葉志娟(2006)的研究表明, 牟氏角毛藻對(duì)不同濃度牙鲆養(yǎng)殖廢水中的氨態(tài)氮的去除率均達(dá)到100％, 硝酸鹽、亞硝酸鹽、磷酸鹽的去除率最高達(dá)100％。這啟示我們?cè)谧匀恢杏性S多具有營(yíng)養(yǎng)鹽高吸收效率的潛在藻種, 對(duì)其進(jìn)行深入的研究并應(yīng)用到ATS系統(tǒng)上, 可進(jìn)一步提高ATS系統(tǒng)的功能和作用。而對(duì)絲藻屬、斜紋藻屬, 隱藻屬、羽紋藻屬等均為ATS系統(tǒng)特有的。Lichtlé(1980)發(fā)現(xiàn), 隱藻在繁殖期間的脫包囊階段需要高強(qiáng)度的光照和高濃度的氮, 這表明隱藻也具有很好的吸收氮的能力。Novoveská等(2016)所設(shè)計(jì)的大型離岸式光生物反應(yīng)器, 其原理同ATS系統(tǒng)類似, 其中包含小球藻屬、隱藻屬及柵藻屬等多種微藻, 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)可有效吸收廢水中75% 的總氮和93% 的總磷。以上研究進(jìn)一步說明了ATS系統(tǒng)的凈水功能是與藻的群落結(jié)構(gòu)和功能相關(guān)的, 且受到人們篩選的控制, 表現(xiàn)出不同于自然礁石上藻類群落結(jié)構(gòu)的獨(dú)特性。

綜上, 高通量測(cè)序結(jié)果展現(xiàn)了ATS系統(tǒng)和自然礁石潮間帶藻類在種群結(jié)構(gòu)上的多樣性, 其中ATS系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)藻主要有對(duì)絲藻屬、斜紋藻屬, 而宋井、展南亭、后宅3個(gè)自然海區(qū)的優(yōu)勢(shì)藻主要為分枝色指藻屬、寬果藻屬和日本馬澤藻屬。在屬水平上, 二者共有的優(yōu)勢(shì)藻有仙菜和骨條藻。同時(shí)在研究過程中還發(fā)現(xiàn)除了藻類以外的其他微生物種群。近年來已經(jīng)有研究表明, 藻和菌種群之間存在互作關(guān)系(趙以軍等, 1996; 沈梅麗等, 2013; 苗禎等, 2016; ), 猜想微生物菌群的存在對(duì)藻類吸收營(yíng)養(yǎng)鹽的能力有一定的影響; 但是在本實(shí)驗(yàn)中并沒有研究藻類功能與微生物菌群之間的聯(lián)系, 這還有待進(jìn)一步的探討。此外，挖掘新的潮間帶藻類并將其應(yīng)用于ATS系統(tǒng)有助于進(jìn)一步優(yōu)化ATS系統(tǒng)的凈水功能, 對(duì)未來實(shí)現(xiàn)ATS系統(tǒng)產(chǎn)業(yè)化具有積極的意義。

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Comparison of biological diversity of algae on algal turf scrubber (ATS) and natural reefs

WANG Huanhuan, TAN Siyin, WANG Hui, DU Hong, HOU Tao, CHEN Xianjian, LI Junjun, HUANG Ying,

Biology department, Shantou University, STU-UNIVPM Joint Algal Research Center, Shantou 515063, China

Algal turf scrubber (ATS) is a system for water cleaning, which uses intertidal algae to effectively eliminate nitrogen (N) and phosphorus (P) elements in eutrophic water. Algae is the most important organism in the whole system, and its community structure is closely related to the effect of water purification. Based on the high-throughput sequencing technology of Illumina MiSeq platform, we analyze the diversity of algal samples in ATS system and natural reefs in this study. The results of 18S rDNA show that the ATS system obtains 21390 algal majorizing sequences. Among these majorizing sequences,accounts for 22.79% of the total number,and the rest sequences are classified as Psammodictyon, accounting for 19.07%. Algae in Song Jing, Zhan Nantingand Hou Zhai areas have 88435, 87129 and 106458 majorizing sequences after filtering, respectively. They are mainly,and. Both the ATS system and the natural environment samples have the dominant species ofand. This research shows that the ATS system has similarity and specificity in its community structure compared to the natural reefs, which provides a theoretical evidence for further improving the function of the ATS system.

ATS system; high-throughput sequencing; algal diversity; intertidal algal

2018-03-24;

2018-05-14. Editor: SUN Shujie

Special Funds for Scientific and Technological Innovation Cultivation of College Students in Guangdong (pdjh2017a0195)

P735.12

A

1009-5470(2019)01-0043-06

10.11978/2018032

2018-03-24;

2018-05-14。孫淑杰編輯

廣東大學(xué)生科技創(chuàng)新培育專項(xiàng)資金(pdjh2017a0195)

王歡歡(1996—), 男, 河南省濮陽(yáng)縣人, 本科, 從事潮間帶藻類研究。E-mail:14hhwang1@stu.edu.cn

杜虹。E-mail: hdu@stu.edu.cn

DU Hong.E-mail: hdu@stu.edu.cn