趙 興

浙江大學(xué)明州醫(yī)院(寧波，315100)

目前我國多數(shù)醫(yī)院已開展了產(chǎn)前血清學(xué)篩查，即在孕中期采外周血檢測血清甲胎蛋白(AFP)、游離β-人絨毛膜促性腺激素(β-hCG)和游離雌三醇(uE3)，同時(shí)結(jié)合其他指標(biāo)綜合判斷唐氏綜合征(DS)患兒出生的風(fēng)險(xiǎn)率[2]。但影響結(jié)果的因素很多[3]。近年來，無創(chuàng)DNA產(chǎn)前檢測技術(shù)得到推廣應(yīng)用，用DNA測序技術(shù)對母體外周血漿中的游離DNA片段測序，通過生物信息分析檢測胎兒是否患21-三體綜合征，其檢測結(jié)果僅受母體外周血DNA背景的影響[4]。本研究通過比較兩種檢測方法的臨床應(yīng)用效價(jià)，客觀評價(jià)無創(chuàng)DNA產(chǎn)前檢測技術(shù)與傳統(tǒng)血清學(xué)篩查，為提高臨床檢測水平提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性納入2014年7月—2017年7月本院行產(chǎn)前檢查的孕婦2217例，所有孕婦均在知情同意下參檢，在孕中期行血清學(xué)篩查和無創(chuàng)DNA產(chǎn)前檢測。孕婦年齡(27.7±4.7)歲(20～35歲)，吸煙47例，合并糖尿病56例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①預(yù)產(chǎn)期年齡≤35歲；②單胎妊娠；③產(chǎn)前檢查時(shí)超聲確認(rèn)胎齡為15～20+6周。排除標(biāo)準(zhǔn)：①雙胎、多胎妊娠；②接受體外受精—胚胎移植；③自身染色體異常；④兩年內(nèi)有異體輸血史或移植手術(shù)史。

1.2 血清學(xué)篩查

所有孕婦于孕中期采集肘靜脈血離心取上清液，使用時(shí)間分辨免疫熒光法檢測血清AFP、β-hCG和uE3。儀器為Victor 1420免疫分析儀(芬蘭Wallac公司)，試劑盒由北京奧維亞生物技術(shù)有限公司提供，嚴(yán)格遵守說明書進(jìn)行相關(guān)操作。使用Multicalc軟件，并結(jié)合孕婦基本信息(年齡、體重、吸煙史、糖尿病史等)計(jì)算風(fēng)險(xiǎn)切割值，以1/270為分界線，≥1/270判定為陽性，<1/270判定為陰性[5]。

1.3 無創(chuàng)DNA產(chǎn)前檢測

所有孕婦于孕中期采集肘靜脈血取上清液置入PE離心管中，所有標(biāo)本用專用物流箱加干冰送至深圳華大基因公司進(jìn)行檢測。提取血漿中游離DNA，并在其末端添加接頭，建立DNA文庫。采用Illunfina HiSeq 2000測序平臺，分析DNA片段的序列，檢測染色體拷貝數(shù)，對比系統(tǒng)染色體序列計(jì)算樣本中染色體拷貝數(shù)，分析有無染色體非整倍體異常。判斷標(biāo)準(zhǔn)：若染色體拷貝數(shù)增多，且具有染色體非整倍體異常，則判為陽性；若拷貝數(shù)正常，則判為陰性[6]。

1.4 追蹤隨訪及最終確診

對血清學(xué)篩查和無創(chuàng)DNA產(chǎn)前檢測陽性結(jié)果孕婦行羊膜腔穿刺，行細(xì)胞培養(yǎng)+染色體核型分析，確診為陽性者建議終止妊娠，陰性者繼續(xù)隨訪；對陰性結(jié)果孕婦，自篩查之日起定期產(chǎn)檢復(fù)查B超，若B超提示死胎或發(fā)育異常建議引產(chǎn)，后行高通量測序最終確診，活產(chǎn)的新生兒常規(guī)體格檢查，隨訪至出生后42d。綜合上述所有結(jié)果作為本研究的最終參照。

1.5 觀察指標(biāo)及統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

評估血清學(xué)篩查與無創(chuàng)DNA產(chǎn)前檢測的陽性檢出率、假陽性率、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值、靈敏度、特異度和假陰性率，陽性檢出率=真陽性/(真陽性+假陰性)×100%，假陽性率=假陽性/(真陽性+假陽性)×100%，陽性預(yù)測值=真陽性/(真陽性+假陽性)×100%，陰性預(yù)測值=真陰性/(真陰性+假陰性)×100%，靈敏度=真陽性/(真陽性+假陰性)×100%，特異度=真陰性/(真陰性+假陽性)×100%，假陰性率=假陰性/(真陰性+假陰性)×100%。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。計(jì)數(shù)資料用率表示，各陽性率比較均采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同檢測方法檢出率與隨訪結(jié)果比較

2217例孕婦中，血清學(xué)篩查陽性41例(1.9%)，陰性2176例(98.1%)；無創(chuàng)DNA產(chǎn)前檢測陽性19例(0.9%)，陰性2198例(99.1%)。隨訪結(jié)果，染色體非整倍體異常21例(0.9%)，正常胎兒2196例(99.1%)。血清學(xué)篩查陽性率高于隨訪結(jié)果(χ2=6.543，P=0.011)，無創(chuàng)DNA產(chǎn)前檢測陽性率與隨訪結(jié)果無差異(χ2=0.101，P=0.751)。

2.2 血清學(xué)篩查對唐氏綜合征篩查臨床檢出效價(jià)

將追蹤隨訪結(jié)果作為最終參照，分析血清學(xué)篩查41例陽性結(jié)果的符合率以及2176例陰性結(jié)果的符合率。其中，真陽性17例，陽性檢出率為81.0%；假陽性24例，假陽性率為58.5%。陽性預(yù)測率為41.5%，陰性預(yù)測率為99.8%，靈敏度為81.0%，特異度為98.9%；假陰性4例，假陰性率為0.2%。

2.3 無創(chuàng)DNA產(chǎn)前檢測對唐氏綜合征篩查臨床檢出效價(jià)

將追蹤隨訪結(jié)果作為最終參照，分析無創(chuàng)DNA產(chǎn)前檢測中19例陽性結(jié)果的符合率以及2196例陰性結(jié)果的符合率。其中，真陽性19例，陽性檢出率為90.5%；假陽性0例，假陽性率為0，陽性預(yù)測率100.0%，陰性預(yù)測率99.9%，靈敏度為90.5%，特異度為100.0%。假陰性2例，假陰性率為0.1%。

3 討論

臨床DS檢查(羊膜穿刺、絨毛取樣等)以有創(chuàng)方法為主，孕中期血清學(xué)篩查與無創(chuàng)DNA產(chǎn)前檢測均為無創(chuàng)檢查，本研究血清學(xué)篩查的陽性率高于隨訪結(jié)果，而無創(chuàng)DNA產(chǎn)前檢測陽性率與追蹤隨訪結(jié)果相符，說明后者的準(zhǔn)確性更高。

目前，絕大多數(shù)醫(yī)院都開展了孕中期血清學(xué)篩查，通過對AFP、β-hCG和uE3檢測判斷DS患兒出生風(fēng)險(xiǎn)率。研究已知孕婦血清AFP下降與胎兒基因非整倍體異常相關(guān)[7]。孕婦血清β-hCG水平升高與DS有相關(guān)性[8]。孕婦血清uE3水平降低與DS胎兒肝臟、腎上腺發(fā)育不良有關(guān)[9]。采用三聯(lián)標(biāo)記方案(AFP+HCG+uE3)，DS檢出率為67%[10]。本研究血清學(xué)篩查DS檢出率(81.0%)較文獻(xiàn)數(shù)據(jù)高，可能與樣本例數(shù)較少有關(guān)。較多文獻(xiàn)也報(bào)道血清學(xué)篩查假陽性率較高[11]，本研究的假陽性率與文獻(xiàn)相符，可能與孕婦年齡、體重、孕周、吸煙史、糖尿病史等多方面因素干擾有關(guān)。由于較高的假陽性率，采用血清學(xué)篩查仍會迫使部分孕婦接受有創(chuàng)檢查，加上DS檢出率僅為60%～80%，部分非DS胎兒會被誤流產(chǎn)。因此，臨床上需要更為高效的產(chǎn)前檢測手段。本研究孕中期血清學(xué)篩查中出現(xiàn)4例假陰性，假陰性率為0.2%。鄭文吉[12]認(rèn)為，造成孕中期血清學(xué)篩查假陰性最主要的原因是實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制不夠，特別是中位數(shù)方程檢測系統(tǒng)漂移，因此加強(qiáng)質(zhì)量控制是關(guān)鍵。

孕婦血漿中游離胎兒DNA的特點(diǎn)有：①DNA片段的長度只有約150個(gè)堿基對；②妊娠早期即可出現(xiàn)在孕婦血漿中，半衰期短，分娩后1d即可從孕婦血漿中消失；③約占孕婦血漿中總DNA的20%[13]，因此被認(rèn)為是用于產(chǎn)前篩查的理想胎兒物質(zhì)。近年來，高通量測序技術(shù)得以應(yīng)用，被提取的胎兒DNA片段可以被擴(kuò)增和計(jì)數(shù)，無創(chuàng)DNA檢測技術(shù)開始正式應(yīng)用于臨床。采用高通量測序技術(shù)中大規(guī)模平行測序技術(shù)檢測胎兒DNA片段是否為非整倍體性，將DNA序列測序與正常人染色體基因組比較分析，可準(zhǔn)確發(fā)現(xiàn)變異后的染色體[14]。因此，將這項(xiàng)技術(shù)用于DS篩查，實(shí)現(xiàn)了檢測過程的無創(chuàng)性、快速性和高準(zhǔn)確性。Benn對6339例高危孕婦的DS篩查中，最終確診DS胎兒594例，而無創(chuàng)DNA檢測技術(shù)檢測590例，陽性檢出率達(dá)到99.3%，假陽性率僅為0.16%[15]。比血清學(xué)篩查大大提高了陽性檢出率。本研究中，采用無創(chuàng)DNA產(chǎn)前檢測的陽性檢出率低于上述文獻(xiàn)報(bào)道，但高于血清學(xué)篩查，可能與本次樣本量太少有關(guān)。任明保認(rèn)為[16]，造成無創(chuàng)DNA檢測假陰性最主要的原因可能是母血中提取的胎兒游離DNA量不夠多，因此影響了最終的檢測結(jié)果。本次無創(chuàng)DNA產(chǎn)前檢測的陽性預(yù)測率、陰性預(yù)測率、靈敏度、特異度均優(yōu)于血清學(xué)篩查。

綜上所述，在DS胎兒的篩查中，無創(chuàng)產(chǎn)前DNA檢測技術(shù)較血清學(xué)篩查的準(zhǔn)確性和特異度更高，具有更高的陽性檢出率，減少了侵入性產(chǎn)前檢查和誤引產(chǎn)的概率。