葉明皓，胡秀彩，呂愛軍，孫敬鋒，劉小雪，白杰

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草魚致病性腐敗希瓦氏菌的分離鑒定及藥敏特性研究

葉明皓，胡秀彩，呂愛軍通信作者，孫敬鋒，劉小雪，白杰

（天津農(nóng)學(xué)院 水產(chǎn)學(xué)院 天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300384）

從患病草魚（）體內(nèi)分離獲得1株革蘭氏陰性細(xì)菌，菌株編號(hào)為C0703，通過(guò)細(xì)菌形態(tài)學(xué)觀察、理化特性、16S rDNA序列分析以及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析等進(jìn)行鑒定研究。結(jié)果表明，該分離菌株氧化酶、七葉苷、硝酸鹽還原等為陽(yáng)性，賴氨酸脫羧酶、葡萄糖等為陰性；進(jìn)一步采用PCR方法擴(kuò)增16S rDNA序列測(cè)序獲得片段大小1 409 bp，與模式菌株ATCC 8071（NR 119141.1）序列相似性為98.23%；構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹分析顯示與（NR 119141.1）自然聚為一支，最終判定C0703菌株為腐敗希瓦氏菌（）。人工回歸感染草魚試驗(yàn)顯示，3 d累積死亡率為100%，并與自然感染臨床癥狀基本一致；藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，菌株C0703對(duì)阿莫西林、美羅培南、萘啶酸等藥物敏感，對(duì)氨芐西林、頭孢唑啉、萬(wàn)古霉素等不敏感。本研究結(jié)果為魚源腐敗希瓦氏菌的診斷及防治等提供了科學(xué)參考。

草魚；腐敗希瓦氏菌；16S rDNA；生理生化；藥敏試驗(yàn)

草魚是我國(guó)重要的養(yǎng)殖魚類，具有較高經(jīng)濟(jì)價(jià)值[1-2]。近年來(lái)，水產(chǎn)高密度養(yǎng)殖容易導(dǎo)致草魚疾病的發(fā)生，不僅嚴(yán)重影響其經(jīng)濟(jì)效益，而且也對(duì)人類健康造成潛在威脅[3]。近年來(lái)，關(guān)于草魚的疾病暴發(fā)頻繁，包括病毒、細(xì)菌、寄生蟲引起的疾病[4]，已報(bào)道水生呼腸孤病毒屬（）[5]、氣單胞菌屬（）[6]、車輪蟲（）[7]等均可導(dǎo)致草魚感染、發(fā)病、死亡。

腐敗希瓦氏菌（）為革蘭氏陰性桿菌，已證實(shí)為水生動(dòng)物和富含蛋白食品的典型腐敗菌之一[8]。腐敗希瓦氏菌最早被歸為無(wú)色桿菌屬（）[9]，后來(lái)被歸至假單胞菌屬（）[10]和交替單胞菌屬（）[11]等多個(gè)屬。目前根據(jù)16S rRNA序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，將其歸為希瓦氏菌屬（）[12]。希瓦氏菌屬?gòu)V泛分布于淡水、污水和海洋中[13]。研究表明，希瓦氏菌可以導(dǎo)致水產(chǎn)動(dòng)物感染發(fā)病，主要有廈門希瓦氏菌（）、海藻希瓦氏菌（）、腐敗希瓦氏菌、鮑魚希瓦氏菌（）等[14-15]。近幾年，國(guó)內(nèi)外陸續(xù)發(fā)現(xiàn)由腐敗希瓦氏菌引起的水產(chǎn)動(dòng)物病例，不僅引起金帶籃子魚（）、大菱鲆（）等海水魚類發(fā)病死亡[16-17]，而且也會(huì)導(dǎo)致鯉（）、異育銀鯽（）等淡水魚類死亡[18-19]。

本研究首次發(fā)現(xiàn)腐敗希瓦氏菌感染草魚導(dǎo)致死亡。2017年7月，河南省某養(yǎng)殖場(chǎng)草魚出現(xiàn)發(fā)病死亡現(xiàn)象，主要表現(xiàn)為鰓部充血、鰭條出血、鱗片脫落，解剖可見肝臟有出血點(diǎn)、腹水等癥狀。本研究從發(fā)病死亡的草魚體內(nèi)分離獲得1株細(xì)菌，并對(duì)其進(jìn)行細(xì)菌形態(tài)學(xué)觀察、16S rDNA測(cè)序、生理生化特性、藥敏試驗(yàn)及回歸感染試驗(yàn)等進(jìn)行系統(tǒng)研究，為草魚養(yǎng)殖過(guò)程中有效防治疾病提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

發(fā)病草魚為河南省某養(yǎng)殖場(chǎng)送檢病例樣品，健康草魚購(gòu)自天津市西青區(qū)某養(yǎng)殖場(chǎng)，體長(zhǎng)約7 cm，實(shí)驗(yàn)室暫養(yǎng)2周，確認(rèn)健康無(wú)病后用于人工回歸感染實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 試劑

LB培養(yǎng)基、細(xì)菌生化鑒定管和藥敏紙片均購(gòu)自杭州濱和微生物試劑有限公司，PCR Master Mix試劑購(gòu)自北京天根生化科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌的分離與純化

參照苗淼等[14]的方法，無(wú)菌操作取病魚肝、腎等適量組織均勻涂布于LB固體培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)18 h。挑取優(yōu)勢(shì)單菌落接種純化，經(jīng)過(guò)3次純化后得到純菌種，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 細(xì)菌生理生化試驗(yàn)

將分離菌株28 ℃培養(yǎng)18 h，進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢。將菌株無(wú)菌操作接種于細(xì)菌生化鑒定管中，進(jìn)行氧化酶、硝酸鹽還原、糖（醇、苷）類代謝等52種生理生化特性測(cè)定，參照Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology方法進(jìn)行[20]。

1.2.3 細(xì)菌基因組DNA提取及16S rDNA基因序列的擴(kuò)增

采用水煮法提取C0703菌株的基因組DNA[21]，進(jìn)行PCR擴(kuò)增16S rDNA序列。采用通用引物27F: 5＇-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3＇，1492R: 5＇-GGTTACCTTGTTACGACTT-3＇，引物由上海生工合成。采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)目的基因，并將PCR產(chǎn)物送金唯智生物科技有限公司進(jìn)行基因測(cè)序。

1.2.4 細(xì)菌16S rDNA基因序列及系統(tǒng)發(fā)育樹分析

將16S rDNA測(cè)序結(jié)果通過(guò)NCBI的Blast檢索系統(tǒng)進(jìn)行序列同源性分析，同時(shí)在NCBI下載已公布的希瓦氏菌屬的16S rDNA基因序列進(jìn)行相似性比較，采用MEGA 5.2軟件鄰接法（neighbor- joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并通過(guò)1 000次的自舉分析（bootstrap）進(jìn)行置信度檢測(cè)。

1.2.5 藥敏試驗(yàn)

藥敏試驗(yàn)采用K-B紙片法對(duì)分離菌株進(jìn)行39種常用藥物的敏感性檢測(cè)，并測(cè)量抑菌圈直徑大小，判定其對(duì)藥物的敏感性。

1.2.6 動(dòng)物感染試驗(yàn)

隨機(jī)選取20尾健康草魚作為試驗(yàn)動(dòng)物，感染組草魚采用腹腔注射100 μL/尾、菌液濃度為1.35×108cfu/mL，對(duì)照組注射等量無(wú)菌生理鹽水；飼養(yǎng)溫度為（26±2）℃，連續(xù)觀察7 d，每天記錄魚體發(fā)病死亡情況。

2 結(jié)果

2.1 草魚病原菌的分離及理化特性

從發(fā)病草魚體內(nèi)分離獲得1株革蘭氏陰性細(xì)菌，菌株編號(hào)為C0703。該菌在LB培養(yǎng)基28 ℃培養(yǎng)18 h，呈現(xiàn)為圓形、邊緣整齊、表面濕潤(rùn)、光滑、不透明的較小菌落，革蘭氏染色鏡檢為陰性短桿狀細(xì)菌（圖1）。細(xì)菌生理生化試驗(yàn)結(jié)果表明該菌株氧化酶、七葉苷、硝酸鹽還原試驗(yàn)等為陽(yáng)性，賴氨酸脫羧酶、葡萄糖、氰化鉀試驗(yàn)等為陰性（表1），該菌株的形態(tài)學(xué)和理化特性，基本符合希瓦氏菌屬（）的特征。

圖1 菌株C0703革蘭氏染色

表1 菌株C0703的生理生化特性

注：＋表示陽(yáng)性，-表示陰性

2.2 分離菌的16S rDNA序列及系統(tǒng)發(fā)育樹分析

以分離菌C0703基因組DNA為模板，采用PCR方法擴(kuò)增16S rDNA序列，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)大小約為1 500 bp的目的條帶（圖2），PCR產(chǎn)物測(cè)序獲得16S rDNA片段大小為1 409 bp。Blast比對(duì)表明與模式菌株ATCC 8071（NR 119141.1）的16S rDNA序列相似性為98.23%，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹分析顯示分離菌C0703與（NR 119141.1）親緣關(guān)系最近，自然聚為一支（圖3），最終判定C0703菌株為腐敗希瓦氏菌。

圖2 菌株C0703的16S rDNA基因PCR擴(kuò)增

圖3 菌株C0703系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析

2.3 菌株C0703藥敏特性

藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，C0703菌株對(duì)阿莫西林、美羅培南、亞胺培南、鏈霉素、萘啶酸等藥物高度敏感，對(duì)頭孢噻肟、四環(huán)素、克林霉素等中度敏感；對(duì)氨芐西林、頭孢唑啉、萬(wàn)古霉素等耐藥（表2）。

表2 菌株C0703藥敏特性

2.4 人工感染臨床癥狀

草魚發(fā)病臨床癥狀主要表現(xiàn)為鱗片脫落、腐皮，尾部顏色變淺（圖4A），解剖可見腹水，肝臟淤血，腸道出血，初步診斷為細(xì)菌性感染疾病。用C0703菌株人工腹腔注射草魚感染12 h后，其出現(xiàn)發(fā)病、死亡現(xiàn)象，3 d累積死亡率達(dá)100%，感染草魚臨床癥狀主要表現(xiàn)為游動(dòng)遲緩，鱗片脫落，停止攝食，尾部顏色變淺，腹部膨大、出血（圖4B），解剖可見腹腔積水，肝淤血，腸壁出血（圖4C）。人工感染發(fā)病死亡草魚與自然發(fā)病癥狀基本相同，并且從發(fā)病死亡草魚體內(nèi)分離到與C0703菌株特征一致細(xì)菌。對(duì)照組草魚觀察7 d無(wú)發(fā)病死亡現(xiàn)象。

圖4 菌株C0703感染草魚臨床癥狀

注：A為發(fā)病草魚鱗片脫落、腐皮；B為腹部膨大、出血；C為肝淤血，腸壁出血

3 討論

3.1 腐敗希瓦氏菌的致病性

希瓦氏菌是水環(huán)境中常見的細(xì)菌，目前關(guān)于希瓦氏菌感染魚類的報(bào)道較多[14]。許振偉等[22]將腐敗希瓦氏菌接種于大黃魚、大菱鲆無(wú)菌魚塊上，表明低溫有氧條件下具有很強(qiáng)的腐敗能力，對(duì)人類健康構(gòu)成潛在的威脅。但是，針對(duì)致病性腐敗希瓦氏菌分離鑒定鮮有報(bào)道[22-25]。研究表明，腐敗希瓦氏菌是一種人獸共患病的病原菌，能夠引起人類軟組織感染[25]、心膜炎[26]等。近年來(lái)，腐皮病在水產(chǎn)動(dòng)物養(yǎng)殖過(guò)程中頻繁發(fā)生，給水產(chǎn)業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失[23-24]。本研究從患病草魚體內(nèi)分離到1株致病性腐敗希瓦氏菌，人工感染試驗(yàn)顯示，分離菌株C0703能夠引起草魚腐皮病。P?kala等[27]發(fā)現(xiàn)感染腐敗希瓦氏菌的淡水魚中，大多數(shù)臨床癥狀為鰓部壞死、皮膚潰瘍，解剖發(fā)現(xiàn)內(nèi)臟出血、水腫。本文首次報(bào)道腐敗希瓦氏菌感染草魚病例，病魚皮膚腐爛，解剖可見腹水，肝臟、腸道出血等，這與已有文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果基本一致[27]。目前，關(guān)于草魚腐皮病的病因及其致病機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

3.2 腐敗希瓦氏菌的藥敏特性

抗生素藥物在水產(chǎn)養(yǎng)殖和疾病防控中應(yīng)用廣泛，且濫用藥物現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生，從而使魚類疾病防治面臨著新的挑戰(zhàn)。本研究對(duì)魚源腐敗希瓦氏菌C0703菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果表明其對(duì)美羅培南、亞胺培南、鏈霉素、卡那霉素、諾氟沙星等藥物敏感，對(duì)氨芐西林、復(fù)方新諾明、磺胺異惡唑等耐藥。秦蕾等[19]對(duì)腐敗希瓦氏菌的藥敏結(jié)果顯示，其對(duì)萘啶酸、恩諾沙星、左氟沙星等藥物敏感，對(duì)萬(wàn)古霉素、磺胺異惡唑等藥物耐藥。苗淼等[14]對(duì)廈門希瓦氏菌的藥敏結(jié)果顯示，其對(duì)頭孢哌酮、美羅培南、亞胺培南、阿奇霉素、卡那霉素等藥物敏感，對(duì)氨芐西林、磺胺異惡唑、甲氧嘧啶等藥物耐藥。賈春紅等[28]從方斑東風(fēng)螺（）中分離得到3株希瓦氏菌，進(jìn)行藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，鮑魚希瓦氏菌對(duì)米諾環(huán)素、慶大霉素等敏感，對(duì)四環(huán)素、復(fù)方新諾明等藥物耐藥；海藻希瓦氏菌對(duì)左氟沙星、環(huán)丙沙星、氯霉素、鏈霉素、復(fù)方新諾明等藥物敏感，對(duì)氨芐西林、克林霉素等藥物耐藥。以上希瓦氏菌屬與本試驗(yàn)魚源腐敗希瓦氏菌的藥敏結(jié)果基本一致。也有報(bào)道腐敗希瓦氏菌對(duì)氯霉素、諾氟沙星、鏈霉素、復(fù)方新諾明等藥物敏感，對(duì)阿米卡星、頭孢哌酮、氨芐西林等藥物耐藥[28]，這與魚源腐敗希瓦氏菌的藥敏結(jié)果存在差異，可能與菌株來(lái)源、地域分布和臨床藥物使用等有關(guān)。以上研究報(bào)道腐敗希瓦氏菌的藥敏特性，為水產(chǎn)動(dòng)物疾病防治提供了科學(xué)參考。

4 結(jié)論

本研究從患病草魚體內(nèi)分離到1株致病性腐敗希瓦氏菌，藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示對(duì)美羅培南、亞胺培南、鏈霉素、卡那霉素、諾氟沙星等藥物敏感。該結(jié)果為草魚細(xì)菌性疾病防治提供科學(xué)依據(jù)。

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責(zé)任編輯：張愛婷

Isolation, identification and antibiotic sensitivity of the pathogenic Shewanella putrefaciens from the grass carp

YE Ming-hao, HU Xiu-cai, Lü Ai-junCorresponding Author, SUN Jing-feng, LIU Xiao-xue, BAI Jie

（Tianjin Key Lab of Aqua-Ecology and Aquaculture, College of Fisheries, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China）

A bacterial strain was isolated from the grass carp（）, and named C0703. The morphological observation, physiological and biochemical characteristics, sequencing of 16S rDNA and phylogenetic tree analysis were carried out in this study. Results showed that the C0703 strain was a rod-shaped, gram-negative bacillus; The isolated strain was positive for oxidase, esculin and nitrate reduction, and negative reaction for lysine decarboxylase and glucose etc. Furthermore, the 16S rDNA sequences were amplified by PCR method, to get fragment size of sequencing 1 409 bp. It had a 98.23% similarity with 16S rDNA sequence ofATCC 8071（NR 119141.1）, and clustered into one group with（NR 119141.1）, thus the C0703 strain was identified as. Animal experiment showed that the isolated strain has pathogenic to grass carp and causeddeath with a 100% rate, which were consistent with the natural symptoms of diseased fishes. The antibiotic susceptibility testing showed that it was sensitive to amoxicillin, meropenem and nalidixic acid etc, but resistant to ampicillin, cefazolin and vancomycin etc. This study firstly reported the isolation and identification offrom grass carp, which will provide a scientific reference for prevention and treatment in fishes.

grass carp;; 16S rDNA; physiological and biochemical; antibiotic sensitivity test

1008-5394（2018）04-0052-06

10.19640/j.cnki.jtau.2018.04.012

S917.1

A

2018-08-10

國(guó)家大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201810061036）；天津市自然科學(xué)基金項(xiàng)目（16JCZDJC33500，18JCYBJC29900）；天津市水產(chǎn)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)（ITTFRS2017009）；天津農(nóng)學(xué)院綜投平臺(tái)項(xiàng)目（J01009030638）；天津市高等學(xué)?！皠?chuàng)新團(tuán)隊(duì)培養(yǎng)計(jì)劃”現(xiàn)代水產(chǎn)生態(tài)健康養(yǎng)殖項(xiàng)目（TD13-5089）

葉明皓（1995-），男，碩士在讀，主要從事水產(chǎn)動(dòng)物微生物與免疫學(xué)的研究。E-mail: 1084395663@qq.com。

呂愛軍（1973-），男，教授，博士，主要從事水產(chǎn)動(dòng)物微生物與免疫學(xué)的研究。E-mail: lajand@126.com。