田嘉珉 徐將 盧瑤瑤 梁景巖

225000揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州

得益于中國經(jīng)濟(jì)的不斷發(fā)展，人們的生活質(zhì)量不斷提高，但同時心腦血管疾病、惡性腫瘤、糖尿病等慢性疾病對人們生命健康造成了日趨嚴(yán)重的威脅，在老齡化的社會結(jié)構(gòu)下，心腦血管疾病的發(fā)病率更不容忽視。動脈粥樣硬化是一種復(fù)雜的炎癥性血管病變，導(dǎo)致了心血管疾病的發(fā)生發(fā)展[1]。它的發(fā)病機(jī)制主要有內(nèi)皮細(xì)胞功能受損、脂質(zhì)在內(nèi)膜沉積、平滑肌細(xì)胞異常增殖等多種要素共同構(gòu)成。動脈粥樣硬化的臨床表現(xiàn)根據(jù)受影響動脈的不同而顯示出一定的特異性，如主動脈粥樣硬化可以引發(fā)主動脈瘤；冠狀動脈硬化可導(dǎo)致冠狀動脈粥樣硬化性心臟??；腦動脈粥樣硬化易造成腦栓塞、血管性癡呆；腎動脈粥樣硬化的患者有一定的概率會出現(xiàn)頑固性高血壓；下肢動脈受累引起的皮膚溫度下降、感覺麻痹和間歇性跛行亦屬常見。動脈粥樣硬化有血脂異常、高血壓、抽煙、糖尿病和糖耐量異常等多種危險因素，其中最為主要的病因是脂質(zhì)代謝失衡。當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞功能處于異常狀態(tài)時，該處的血管壁不再是血漿與外界之間的阻隔，大分子物質(zhì)如低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)等可以自由穿過內(nèi)皮細(xì)胞之間的縫隙，在管壁的最內(nèi)層聚集，其氧化后產(chǎn)生的ox-LDL-C對于內(nèi)皮細(xì)胞而言也是一種損傷因子；泡沫細(xì)胞在脂質(zhì)條紋中清晰可見，是單核細(xì)胞等吞噬ox-LDL-C后形成的一種特殊形態(tài)；生理情況下位于中膜的平滑肌細(xì)胞受各種生長因子的影響遷徙至內(nèi)膜，由收縮型向增殖型轉(zhuǎn)化，肌纖維數(shù)量減少，大量分泌細(xì)胞外基質(zhì)；進(jìn)入內(nèi)膜的T 細(xì)胞等分泌各種促炎介質(zhì)，包括腫瘤壞死因子、白介素、干擾素等，促進(jìn)血管炎癥的產(chǎn)生[2]。纖維粥樣斑塊在以上多種機(jī)制的共同作用下逐漸形成。對于粥樣硬化斑塊是如何形成的，學(xué)術(shù)界一直眾說紛紜，無論是脂質(zhì)浸潤學(xué)說，還是內(nèi)皮損傷后產(chǎn)生應(yīng)激，抑或是血小板聚集和血栓形成假說、平滑肌細(xì)胞克隆學(xué)說等，闡述的角度各異，但是對于不同機(jī)制之間是怎樣相互作用和調(diào)節(jié)的，我們尚不明確，最近十幾年中出現(xiàn)在我們關(guān)注范圍內(nèi)的微小核糖核酸(micRNA)為進(jìn)一步探索動脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制開創(chuàng)了新的角度。多項(xiàng)研究表明，miRNA 在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)，從而在血脂代謝、腫瘤細(xì)胞分化、血細(xì)胞生成調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮重要調(diào)控作用[3-5]。miRNA 是一類內(nèi)源性的，高度保守的非編碼單鏈RNA，普遍存在于動、植物體內(nèi)，長度為17～24 個核苷酸長度[6]。其通過結(jié)合于靶mRNA 的3'UTR，導(dǎo)致mRNA被直接抑制或者翻譯過程受阻。miRNA 作為調(diào)節(jié)控制體內(nèi)各種生理過程的“主力軍”，能夠影響血脂代謝、血管內(nèi)皮功能等多個環(huán)節(jié)，在動脈粥樣硬化的病理過程中起著不同的作用。

miRNA簡介

miRNA 的歷史最早可以追溯到1993年，由Lee RC 等人在研究線蟲時發(fā)現(xiàn)[7]，許多研究團(tuán)隊(duì)在果蠅、線蟲和人體中發(fā)現(xiàn)了數(shù)百個miRNAs。到目前為止，我們在動植物及病毒中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了28 645 個miRNA分子。

在真核細(xì)胞生物中，成熟的miRNA是由多種核糖核酸酶處理pri-miRNA 后形 成的[8]，miRNAs 通過RNA 誘導(dǎo)沉默復(fù)合體接近mRNA 并依據(jù)Watson-Crick 堿基配對原則與靶mRNA 分子的3'UTR 相互結(jié)合并產(chǎn)生作用，從而起到影響體內(nèi)各種細(xì)胞的分化、發(fā)育、增殖的作用，miRNAs 也能調(diào)節(jié)細(xì)胞的凋亡過程[9]。miRNA 與靶mRNA 的互補(bǔ)程度決定了miRNA 的作用方向，假如兩者完全互補(bǔ)，則可誘發(fā)靶mRNA 被直接降解，即所謂的RNA 干擾，若miRNA 只與靶mRNA 的一部分形成互補(bǔ)關(guān)系，它只能阻斷這一部分靶mRNA 上的信息向肽鏈的合成過程。

參與動脈粥樣硬化病理過程的miRNAs

miRNAs 調(diào)節(jié)脂代謝：2003年，Xu等發(fā)現(xiàn)敲除或抑制miRNA-14的表達(dá)使果蠅的甘油三酯和甘油二酯含量增高[10]，相應(yīng)的，如果增加其miR-14的表達(dá)，果蠅的血脂水平恢復(fù)正常，這一發(fā)現(xiàn)首次肯定了miRNA 在血脂代謝中的調(diào)節(jié)作用，并由此走上了研究miRNA 與血脂代謝關(guān)系的新征程。近幾年間，miRNA-27、miRNA-33、miRNA-122、miRNA-126、miRNA-155 等的調(diào)節(jié)血脂作用陸續(xù)出現(xiàn)。miRNA-122是肝臟中所占比重最大的miRNA，在肝臟內(nèi)所有miRNA 中大約占70%[11]，其調(diào)脂作用是依靠對肝臟內(nèi)膽固醇的合成和極低密度脂蛋白的分泌調(diào)節(jié)完成的。Lanford 等人研究發(fā)現(xiàn)，低表達(dá)miRNA-122 可以降低HMG-CoA 等膽固醇合成相關(guān)酶的含量[12]，從而限制膽固醇的合成速率，另有團(tuán)隊(duì)證明抑制miRNA-122 表達(dá)后，血漿內(nèi)總膽固醇、LDL、ApoA1 及ApoB 的水平均下降[13]。細(xì)胞內(nèi)的膽固醇被ApoA1 和ATP 結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1(ABCA1)吸引并再次合成為成熟的HDL 顆粒，從外周轉(zhuǎn)運(yùn)回肝臟，在肝臟內(nèi)完成向膽汁酸的轉(zhuǎn)化或直接隨膽汁排泌，稱之為膽固醇的逆向轉(zhuǎn)運(yùn)，也被認(rèn)為是人體中降低血脂水平的重要環(huán)節(jié)。miRNA-33a、miRNA-33b、miRNA-19b、miRNA-144-3p 下 調(diào) 組 織內(nèi)ABCA1 的活性和表達(dá)水平，抑制膽固醇的流出和高密度脂蛋白(HDL)的形成，削弱血漿內(nèi)HDL轉(zhuǎn)運(yùn)膽固醇的能力，并增加低密度脂蛋白(LDL)的含量[14]。miRNAs通過調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞內(nèi)信號蛋白和轉(zhuǎn)錄因子等，影響脂肪細(xì)胞的分化[15]。Ling等人在研究中發(fā)現(xiàn)[16]，小鼠胚胎中分離出的3T3-L1前脂肪細(xì)胞向成熟脂肪細(xì)胞分化的過程中，miRNA-375 高表達(dá)，使細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的信使蛋白表達(dá)增多，促進(jìn)脂質(zhì)積聚，高水平的miRNA-375 也可以磷酸化細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)，有利于脂肪細(xì)胞的分化。過表達(dá)miRNA-363 通過阻滯轉(zhuǎn)錄因子E2F，使細(xì)胞周期無法進(jìn)入S 期，miRNA-363 抑制脂肪細(xì)胞分化的另外一種途徑是抑制細(xì)胞內(nèi)的信使蛋白[17]。3T3-L1 前脂肪細(xì)胞的成脂分化過程中，用miRNA 芯片分析可以顯示出表達(dá)下調(diào)最為明顯的是miRNA-24，脂肪相關(guān)性miRNA 轉(zhuǎn)染前脂肪細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，miRNA-24 可以通過直接抑制AFABP 蛋白來抑制脂肪細(xì)胞的分化和成熟[18]。

miRNAs調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能：盡管存在對動脈粥樣硬化機(jī)制的諸多探討，但內(nèi)皮損傷和內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂長期以來被公認(rèn)為是動脈粥樣硬化發(fā)生的先決條件。內(nèi)皮細(xì)胞是一種扁平的鱗狀上皮細(xì)胞，單層覆蓋于血管內(nèi)側(cè)，阻礙血管外大分子物質(zhì)進(jìn)入血液，同時具備一定的內(nèi)分泌功能。當(dāng)血管內(nèi)皮的完整性遭到破壞時，一些大分子物質(zhì)如LDL就可以透過內(nèi)皮進(jìn)入血管，啟動動脈粥樣硬化的病理改變；內(nèi)皮細(xì)胞可以分泌許多血管活性因子，如NO、內(nèi)皮素等，生理情況下，血管活性因子之間維持平衡，能有效地調(diào)節(jié)血管張力、防止血栓的構(gòu)成。Zhang 等將高表達(dá)miRNA-24 的質(zhì)粒引入人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖明顯下降，胞內(nèi)內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)和特異性蛋白1(Sp1)的含量均顯著減少，由此推斷內(nèi)皮細(xì)胞增殖和eNOS合成受miRNA-24抑制，NO的合成和釋放減少，血管舒張功能被破壞[19]。此外 ，miRNA-155、miRNA-222/221、miRNA-24 等miRNAs 過表達(dá)也會抑制eNOS 的表達(dá)[20-22]。動脈粥樣硬化是一種在多種炎癥介質(zhì)相互影響下形成的病變。Chen 等在ox-LDL 刺激的單核/巨噬細(xì)胞中找到了變化最為明顯的miRNA-125a-5p[23]，并通過使用相應(yīng)抑制劑證實(shí)miRNA-125a-5p可以降低單核/巨噬細(xì)胞對脂質(zhì)的吞噬，另一方面還能顯著增加TGF-β、IL-2等細(xì)胞炎性因子的分泌。該項(xiàng)目組的研究還證實(shí)miRNA-125a-5p的靶基因就是ORP9，抗miRNA-125a-5p 轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中ORP9 蛋白顯著高于正常細(xì)胞，表明miRNA-125a-5p 抑制了ORP9 蛋白的表達(dá)。張紅娜用oxLDL 刺激人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞測得細(xì)胞內(nèi)miRNA-142-3p 含量顯著高于正常細(xì)胞[24]，且呈現(xiàn)出一定的時間依賴性，而在相同時間間隔內(nèi)測定的正常細(xì)胞中miRNA-142-3p 含量沒有顯著性差異。韓沛然的研究表明miRNA-365 過表達(dá)對內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡起到了促進(jìn)作用[25]。高脂血癥患者的miRNA-365 的表達(dá)水平明顯高于正常個體，且與血脂水平有一定關(guān)系；在一個周期的調(diào)脂藥物規(guī)范化治療后，患者的血漿膽固醇減少，miRNA-365 表達(dá)水平也出現(xiàn)了明顯下降，兩者的減少程度呈現(xiàn)出一定的正相關(guān)性。這一結(jié)果可能表明，當(dāng)人體無法將血脂保持在正常范疇內(nèi)，LDL在血管壁內(nèi)膜下聚積時，ox-LDL加重了內(nèi)皮細(xì)胞的損害，miRNA-365 通過諸如凋亡小體一類的轉(zhuǎn)運(yùn)體從內(nèi)皮細(xì)胞中釋放到血漿中，可以檢測到的miRNA-365 表達(dá)水平因此升高。黎健的研究表明miRNA-34a 通過SIRT1-FoxO1信號通路介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞衰老和新生血管形成[26]。在已知老年小鼠心肌和脾臟中miRNA-34a 表達(dá)較年輕小鼠有明顯增高的基礎(chǔ)上，他的實(shí)驗(yàn)證明高表達(dá)miRNA-34a 的內(nèi)皮祖細(xì)胞的衰老細(xì)胞比例增加，血管新生能力明顯減弱，過表達(dá)miRNA-34a 或者阻礙SIRT1-FoxO1 信號通路都能介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的老化，減少新生血管形成。進(jìn)一步研究表明，miRNA-34a 的表達(dá)水平對SIRT1 的影響與年齡有一定關(guān)系，過表達(dá)miRNA-34a老年小鼠內(nèi)皮祖細(xì)胞中SIRT1 表達(dá)水平增加，而年輕小鼠的表現(xiàn)正好相反，因此，miRNA-34a 與血管內(nèi)皮細(xì)胞衰老和新生血管形成之間的關(guān)系還有待進(jìn)一步探查。miRNA-129-1 和miRNA-133 直接靶向血管內(nèi)皮生長因子并抑制其表達(dá)，miRNA-107 則通過影響血管內(nèi)皮生長因子的信號通路，間接促進(jìn)新生血管的形成[27]。翁春華等人的研究表明[28]，miRNA-196、miRNA-296、miRNA-409-3p、miRNA-641可以直接結(jié)合血管生成素的3'UTR，通過抑制血管內(nèi)皮的細(xì)胞增殖或管腔形成而抑制血管增生。戴運(yùn)等人發(fā)現(xiàn)miRNA-372 靶向抑制血管生成因子AGGF1 基因并抑制新生血管[29]。

miRNAs影響血管平滑肌功能：位于血管壁中層的平滑肌細(xì)胞大多為收縮型，通過肌纖維的收縮來改變管腔的大小、調(diào)節(jié)血管的血流。在動脈粥樣硬化的病程中，泡沫細(xì)胞合成并分泌血小板源生長因子(PDGF)、成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)、腫瘤壞死因子(TNF)-α、白介素(IL)-1 等物質(zhì)，平滑肌細(xì)胞受PDGF、FGF 的影響遷徙至內(nèi)膜并增殖，一部分細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞，攝取oxLDL-C，另一部分則發(fā)生顯著增殖，合成和分泌斑塊纖維帽中的常見基質(zhì)成分，粥樣斑塊的形成致使管腔直徑變小，一旦纖維帽發(fā)生破潰，它可能會引起心血管常見急癥的發(fā)生，如不穩(wěn)定性心絞痛和心肌梗死。平滑肌細(xì)胞的異常增殖被認(rèn)為是動脈粥樣硬化、冠心病和再狹窄的治療靶點(diǎn)之一，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多個miRNA 參與了平滑肌細(xì)胞分型轉(zhuǎn)換和凋亡過程的調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)，在球囊損傷頸動脈動物模型中，miRNA-146a 顯著高表達(dá)[30]，且miRNA-146a 可能與動脈粥樣硬化的發(fā)生有關(guān)[31]。在熊瑋的研究中發(fā)現(xiàn)[32]，miRNA-146a的表達(dá)水平在血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)的增殖過程中顯著增加，而加入anti-miRNA-146a 的平滑肌細(xì)胞凋亡比率上升，證明miRNA-146a 能促進(jìn)平滑肌細(xì)胞的增殖，p53信號通路中的細(xì)胞周期蛋白cyclinD1 是其作用的關(guān)鍵點(diǎn)，cyclinD1的基因和蛋白表達(dá)水平上調(diào)，促進(jìn)了VSMC 從G1 期向S 期的轉(zhuǎn)化，使平滑肌細(xì)胞發(fā)生異常增殖，凋亡減少。PDGF在平滑肌細(xì)胞從中膜向內(nèi)膜的遷移過程之中，起到了相對主要的調(diào)節(jié)作用。徐宏鑫發(fā)現(xiàn)[33]，Anti-miRNA-92a 能夠明顯抑制人主動脈平滑肌細(xì)胞在PDGF刺激下的偽足伸出數(shù)量，抑制平滑肌細(xì)胞的遷移，而miRNA-92a 可以作為哺乳動物轉(zhuǎn)錄因子4(KLF4)的抑制劑，使KLF4表達(dá)減少，平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移增強(qiáng)。進(jìn)一步研究表明，Rho 激酶通過miRNA-92a調(diào)控KLF4，促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞的類型轉(zhuǎn)換[34]。除此以外，多項(xiàng)研究表明過表達(dá) miRNA-29a[35]、miRNA-31、miRNA-424/322 均可促進(jìn)平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移[36]，而miRNA-133、miRNA-365、miRNA-663等抑制這一現(xiàn)象[37]。

人們飲食習(xí)慣的改變和生活水平的不斷提高，帶來了不容忽視的問題，心腦血管疾病的患病率逐年增加，患病的初始年齡也日趨減小，從長遠(yuǎn)來看，它將對所有人的健康和社會的發(fā)展產(chǎn)生一定的不利影響。作為循環(huán)系統(tǒng)疾病中的一種常見慢性病，粥樣斑塊的形成甚至可以從兒童期開始，目前的治療方法主要是早期注意危險因素，防范動脈硬化的發(fā)生，合理調(diào)整營養(yǎng)結(jié)構(gòu)，適度開展鍛煉活動，主動戒煙，限制酒精攝入量等；若是已經(jīng)出現(xiàn)了粥樣斑塊，就需要積極開展藥物和手術(shù)治療，用藥方案主要以調(diào)整血脂、防止血小板積聚、減少血栓形成、改善心肌預(yù)后為多見，但是還沒有確切有效的方法阻斷粥樣硬化斑塊的形成。miRNAs的出現(xiàn)為我們探究動脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制和研發(fā)靶向治療方法提供了新的思路。越來越多的研究證明，miRNAs能調(diào)控血脂代謝、內(nèi)皮細(xì)胞功能調(diào)節(jié)、血管平滑肌細(xì)胞的分化增殖、血管炎癥等，涉及動脈粥樣硬化的多個方面。然而，關(guān)于miRNAs還有許多未解之謎，更多與動脈粥樣硬化相關(guān)的miRNAs 的作用機(jī)制是怎樣的，miRNAs之間存在怎樣的相互調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，能否通過過表達(dá)或抑制某一種或幾種miRNA 阻斷信號通路，抑制或減緩粥樣硬化斑塊的產(chǎn)生，這些問題都將是我們下一步的研究目標(biāo)。