謝志勤，范 晴，謝芝勛，張民秀，謝麗基，黃嬌玲，張艷芳，曾婷婷，王 盛，羅思思，鄧顯文，李 孟，李 丹，劉加波

（廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所，廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點實驗室，廣西南寧， 530001）

牛 支 原 體（ Mycoplasma bovis，MB）和 牛病毒性腹瀉病毒（Bovine viral diarrhea virus，BVDV）都能引起牛呼吸系統(tǒng)疾病。MB屬支原體科、支原體屬，主要引起犢牛肺炎、乳腺炎、角膜炎和關(guān)節(jié)炎等病癥，以呼吸系統(tǒng)疾病最為常見[1]。2008年我國首次從患肺炎的犢牛肺臟中分離到MB，此后我國部分地區(qū)陸續(xù)報道發(fā)生了牛支原體肺炎疫情，給我國肉牛和奶牛養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴重經(jīng)濟損失[2]。由于MB具有在牛體內(nèi)持續(xù)存在和條件性致病等特點，長期以來由其引起的疾病一直缺乏有效的防控手段，既無有效疫苗，也無特效藥物，且隨著抗生素的不合理使用，耐藥株出現(xiàn)的頻率逐年增加，給該病防控增加了困難[3-4]。BVDV被認為是一種牛的“呼吸道病毒”，可在牛的下呼吸道和感染牛的肺泡巨噬細胞中分離到。所有的BVDV毒株都是免疫抑制的，從而使感染牛繼發(fā)細菌性或病毒性肺炎。一些BVDV毒株（1a和1b，生物非細胞致病基因）常在牛肺中分離到，且常與呼吸道性疾病發(fā)生有關(guān)；2型病毒會導(dǎo)致犢牛出現(xiàn)嚴重的間質(zhì)性肺炎，血小板減少，骨髓壞死和腹瀉，且持續(xù)感染BVDV的犢?；蚰概Ｒ坏┌l(fā)病會迅速形成細菌性肺炎[5-6]。兩種病原體均能引起牛呼吸道疾病，臨床癥狀相似，難以區(qū)分，且常以混合感染形式存在，感染后都會造成嚴重的經(jīng)濟損失，因此亟需建立MB和BVDV的快速檢測技術(shù)。

目前對這兩種牛病原體的診斷方法主要有病毒分離、ELISA、血清中和、PCR及熒光PCR等方法[2，7-11]。其中，PCR方法因操作簡便、快速、特異性強、敏感性高等優(yōu)點，已被廣泛應(yīng)用于牛群中的病原微生物檢測和診斷。多重PCR是一種高效的PCR，可在同一個PCR反應(yīng)管內(nèi)，同時鑒別檢測多種病原體，在多種病原混合感染的鑒別診斷上具有較高的優(yōu)勢和臨床實用價值。而二溫式PCR是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上發(fā)展而成的更簡便的PCR檢測技術(shù)。二溫式PCR將退火和延伸在同一溫度下完成，退化溫度要比常規(guī)三溫式PCR高，因此不僅提高了PCR的特異性，且二溫式PCR省略了反復(fù)升溫、降溫導(dǎo)致的時間消耗，節(jié)省了時間，因而提高了疾病診斷效率[12-13]。本研究綜合兩種PCR方法，建立了二重二溫式PCR，能同時檢測MB和BVDV，從而大大縮短了反應(yīng)時間。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

RNA/DNA共提試劑盒：購自北京全式金公司；PCR試劑（AMV、Taq Polymerase、MgCl2、dNTP等），pEASY-T1 載體，限制性內(nèi)切酶 SpeI，體外轉(zhuǎn)錄試劑盒（RiboMAXTM large-scale RNA production systerm-T7 kit）：購自大連寶生物公司。

NanoDrop 2000核酸測定儀：購自美國ThermoFisher Scientific公司；Tprofessional thermocycler PCR儀：購自美國Biometra公司。

1.2 毒株

BVDV參考毒株（Oregon CV24、NADL、AV68）：購自中國獸藥監(jiān)察所；MB廣西分離株（GL-1、BS-1、NN-1）：廣西獸醫(yī)研究所分離并保存。牛傳染性鼻氣管炎病毒（IBRV）、口蹄疫病毒（FMDV）、水泡性口炎病毒（VSV）、藍舌病病毒（BTV）、牛輪狀病毒（BRV）、小反芻獸疫病毒（PPRV）等其他牛病毒對照病原體來源見表1。

1.3 引物設(shè)計

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中發(fā)表的MB uvrC基因和BVDV的5'-UTR的保守區(qū)基因序列[14-15]，利用生物引物設(shè)計軟件Primer 5.0，分別設(shè)計了兩對特異性檢測引物（表2），并通過NCBI核酸數(shù)據(jù)庫進行同源性比對分析。引物由上海Invitrogen生物公司合成。合成的引物用滅菌超純水稀釋成25 pmol/μL，置-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 核酸提取及RNA反轉(zhuǎn)錄

按照RNA/DNA共提試劑盒說明書，提取參試毒 株BVDV、IBRV、FMDV、VSV、BTV、BRV、PPRV的總RNA，同時提取MB的總DNA，提取的總RNA用于反轉(zhuǎn)錄成cDNA。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為10 μL：5×RT buffer 2 μL，50 μmol/L Random 9 mer 0.5 μL，5 U AMV反轉(zhuǎn)錄酶 0.5 μL，RNA 抑制劑 0.5 μL，10 μmol/L dNTPs 0.5 μL，RNA模板 2 μL，DePC水 4 μL?；靹蛩矔r離心，然后置PCR儀進行反轉(zhuǎn)錄，程序為 42 ℃ 60 mim，85 ℃ 5 mim，12 ℃ 5 mim。轉(zhuǎn)錄完成后，將反轉(zhuǎn)錄的cDNA及提取的DNA直接用于二重二溫式PCR擴增或保存在-30 ℃?zhèn)溆谩?/p>

表1 毒株和菌株來源

表2 設(shè)計引物序列信息

1.5 二重二溫式PCR擴增條件優(yōu)化

優(yōu)化反應(yīng)體系為25μL：2×PCR Mix（含Taq Polymerase、dNTPs、MgCl2等）12.5 μL，MB和BVDV的上、下游引物（25 pmol/μL）各0.5～2 μL，cDNA或DNA 1～2 μL，用超純水補足至25 μL。每次檢測時，設(shè)置陰陽性對照。反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性 5 min，95 ℃ 變性30 s，設(shè)置10個退火延伸溫度，從61～70 ℃，共進行 35 個循環(huán)。擴增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠進行電泳并拍照。在陰陽性對照均成立時，整個試驗有效，可判定結(jié)果。

1.6 特異性試驗

用優(yōu)化的二重二溫式PCR方法進行特異性檢測，將抽提的MB DNA及BVDV、IBRV、FMDV、VSV、BTV、PPRV、BRV的cDNA加入到已建立的二重二溫式PCR反應(yīng)體系中進行擴增，驗證MB和BVDV二重二溫式PCR方法的特異性。

1.7 敏感性試驗

將PCR擴增的MB和BVDV目的片斷克隆到 pEASY-T1 載體，經(jīng)鑒定提取陽性重組質(zhì)粒。用限制性內(nèi)切酶 SpeI，將BVDV重組質(zhì)粒線性化，按體外轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書（RiboMAXTM large-scale RNA production systerm-T7 kit）將線性化DNA轉(zhuǎn)錄為RNA，同時加入脫氧核糖核酸酶（DNase）消除多余的DNA。用分光光度計測定轉(zhuǎn)錄RNA及重組MB質(zhì)粒DNA濃度，根據(jù)阿弗加德羅常數(shù)，將RNA濃度轉(zhuǎn)換為拷貝數(shù)[16]。用滅菌超純水將測定的拷貝數(shù)依次倍比稀釋成1×108～1×100copies/μL，將相同濃度的兩種體積混合，制備成標準品。每個標準品取1 μL為模板，用建立的二重二溫式PCR方法檢測，驗證其敏感性。

1.8 干擾性試驗

將測定的不同濃度的MB和BVDV模板混合，人工制備不同混合樣品。樣品組合如下：樣品A：MB（105copies/μL）+ BVDV（107copies/μL）；樣品B：MB（107copies/μL）+ BVDV （105copies/μL）；樣品C：MB（108copies/μL）+ BVDV（104copies/μL）；樣 品D：MB（104copies/μL）+ BVDV（108copies/μL）； 樣 品E：MB（104copies/μL）+ BVDV（105copies/μL）。用建立的二重二溫式PCR進行檢測，確定不同模板濃度相差較大時，各模板間是否存在干擾現(xiàn)象。

1.9 臨床應(yīng)用試驗

利用本研究建立的二重二溫式PCR方法，對保存在-70 ℃的38份牛鼻黏液棉拭子和12份牛陰道棉拭子進行檢測。這些樣品采自廣西某牛場（該牛場 2016年曾發(fā)生過牛支原體病），采集時牛沒有表現(xiàn)臨床癥狀。檢測時以MB廣西分離株和BVDV Oregon CV24株為標準對照，驗證本方法對臨床樣品檢測的準確性。

2 結(jié)果

2.1 反應(yīng)體系和反應(yīng)條件

對二重二溫式PCR反應(yīng)條件優(yōu)化的最佳退火延伸溫度為67 ℃，最佳濃度組合為：25 pmol/μL的MB上、下游引物各2 μL，25 pmol/μL的BVDV上、下游引物各2 μL。最佳反應(yīng)體系為：2×PCR Mix（含Taq Polymerase、dNTPs、MgCl2等）12.5 μL，cDNA或DNA 1 μL，超純水補足25 μL。最佳反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性 5 min，95 ℃ 變性30 s，67 ℃延伸30 s，共進行 35 個循環(huán)，12 ℃結(jié)束反應(yīng)。

2.2 特異性試驗

所建立的二重二溫式PCR擴增出兩條目的片斷（MB 412 bp，BVDV 170 bp），與設(shè)計相符合。用該方法檢測參試的口蹄疫、水泡性口炎、藍舌病、牛傳染性鼻氣管炎、牛輪狀病毒、小反芻獸疫等病原，無擴增條帶，為陰性，表明該方法特異性好（表1和圖1）。

圖1 二重二溫式PCR方法特異性

2.3 敏感性試驗

將已經(jīng)制備好的不同稀釋倍數(shù)（1×108～1×100copies/μL）的RNA/DNA標準品（含等濃度的3種體外轉(zhuǎn)錄RNA/DNA）各1 μL為模板，用優(yōu)化好的二重二溫式PCR方法檢測。結(jié)果顯示，建立的二重二溫式PCR檢測方法最低能檢測到MB、BVDV各104拷貝的病原DNA/RNA（圖2），表明該檢測方法靈敏度較高。

2.4 干擾性試驗

將不同濃度的MB 和 BVDV體外轉(zhuǎn)錄RNA/DNA模板混合進行干擾試驗，發(fā)現(xiàn)當一個模板濃度較高，而另一個較低時，所建立的方法依然可以同時檢測到兩種模板，不影響擴增效率，相互不受干擾（圖3）。

圖3 二重二溫式PCR檢測方法干擾性試驗結(jié)果

2.5 臨床樣品檢測

用建立的方法對38份牛鼻粘液棉拭子和12份牛陰道棉拭子進行檢測，結(jié)果17份為MB陽性，3份為BVDV陽性，無兩種病毒的混合感染。將PCR陽性樣品，送大連寶生物公司進行序列測定，經(jīng)序列比對均為對應(yīng)的病毒序列，擴增結(jié)果正確，無假陽性擴增。

3 討論

近幾年我國養(yǎng)牛業(yè)規(guī)模不斷擴大，從而使疫病防治工作面臨著前所未有的壓力，迫切需要簡便、快速的檢測技術(shù)，以保障養(yǎng)牛業(yè)健康發(fā)展。牛MB和BVDV感染的臨床癥狀相似，難以區(qū)分。本研究在多重PCR和二溫式PCR基礎(chǔ)上，建立了MB和BVDV二重二溫式PCR檢測方法。通過將退火和延伸溫度設(shè)為同一溫度，設(shè)定的溫度比退火溫度高，比延伸溫度低，這樣在擴增時不僅提高了二溫式PCR的特異性，而且縮短了擴增時間。

本試驗根據(jù)MB和BVDV保守基因序列，設(shè)計合成兩對分別擴增MB和BVDV的特異性引物，經(jīng)特異性試驗，發(fā)現(xiàn)所建立的二重二溫式PCR只擴增出MB（412 bp）和BVDV（170 bp）兩條目的片段，而對參試的其他毒株無擴增條帶出現(xiàn)，說明所建立的方法具有很好的特異性。敏感性試驗發(fā)現(xiàn)，所建立的二重二溫式PCR，最低均可檢測到104拷貝的MB和BVDV病原DNA/RNA。干擾性試驗表明，所建立的方法對不同模板濃度都能分別擴增，干擾性小，可以滿足MB和BVDV感染的臨床鑒別要求。

本研究使用RNA/DNA共提試劑盒進行待檢病料核酸提取，將提取的核酸用于反轉(zhuǎn)錄cDNA，反轉(zhuǎn)錄不影響提取的DNA，然后直接進行二重二溫式PCR擴增。全程只需一次抽提，一次反轉(zhuǎn)錄，一次PCR，一次電泳即可檢測兩種病原，非常適合混合感染樣品的檢測，省時省力。

4 結(jié)論

本研究通過分析比對MB的uvrC基因和BVDV的5'端非編碼區(qū)（5'-UTR）保守基因序列，并根據(jù)各自序列特征分別設(shè)計了兩對特異性引物，將三溫式PCR擴增程序簡化為二個溫度擴增，建立了二重二溫式MB和BVDV PCR檢測方法。經(jīng)特異性試驗、敏感性試驗、干擾性試驗和臨床樣品檢測試驗，證明該方法特異、敏感、無干擾，臨床檢測結(jié)果準確，表明本研究建立的方法可以用于MB和BVDV的鑒別檢測和流行病學(xué)調(diào)查。