寇曉晶，高 峰，謝 春

（1. 甘肅省動物疫病預(yù)防控制中心，甘肅蘭州 730000；2. 鹽城出入境檢驗檢疫局，江蘇鹽城 224002；3. 南京農(nóng)業(yè)大學，江蘇南京 210014）

食源性疾病是指病原物質(zhì)通過食物進入機體引發(fā)的中毒性或感染性疾病，常見的食源性疾病包括食物中毒、腸道傳染病、人獸共患病、寄生蟲病等[1]。據(jù)報道，在發(fā)達國家，每年罹患食源性疾病的人口比例高達30%[2]。在我國，2011年的食源性疾病監(jiān)測顯示，全國平均6.5人中就有1人次罹患食源性疾病。據(jù)世界衛(wèi)生組織估計，在發(fā)達國家，食源性疾病的漏報率在90%以上，而在發(fā)展中國家，這個數(shù)字則要上升到95%以上，所以食源性疾病是當前世界上突出的食品安全問題之一。98.5%的食源性疾病由微生物污染引起，發(fā)病率居各類疾病總發(fā)病率前列，對人類健康、社會經(jīng)濟都會造成極大影響[3]。

沙門氏菌、單核細胞增生李斯特菌和金黃色葡萄球菌是食品中常見的致病菌，在國內(nèi)外常常引起食源性疾病。如：2011年由單核細胞增生李斯特菌污染香瓜所引起的美國多州大型食源性疾病暴發(fā)，造成146種嚴重侵襲性疾病，30人死亡和1名孕婦流產(chǎn)，是美國近90年來致死性最強的一次食源性疾病暴發(fā)[4]；Mihaiu等[5]報道羅馬尼亞生鮮豬肉和雞肉平均污染率為22.9%；李孝權(quán)等[6]參考《食品衛(wèi)生微生物檢驗國家標準》（GB/T 4789），利用全自動熒光酶標免疫測試儀及全自動微生物分析儀，對可疑食品中食源性致病菌進行檢測，在面包樣品中檢出了金黃色葡萄球菌和葡萄球菌腸毒素。近年來，全球一體化發(fā)展加速，受國際人口遷徙、貿(mào)易以及食物加工方式改變等因素的影響，食源性致病菌的傳播速度不斷加快，對人類健康造成的威脅逐漸加大，急切需要一種快速檢測方法。

本研究將免疫磁珠技術(shù)和ATP發(fā)光技術(shù)聯(lián)合用于食品微生物檢測，選擇沙門氏菌、單核細胞增生李斯特菌病和金黃色葡萄球菌3種最常見的食源性病原菌作為檢測對象，建立了快速檢測這3種食源性病原菌的富集及檢測新方法。該方法不僅可大大縮短檢測周期，還可提高檢測的敏感性和特異性，具有推廣應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 實驗菌株

鼠傷寒沙門氏菌（ATCC14028）、單核細胞增生李斯特菌（ATCC19115-1）、金黃色葡萄球菌（ATCC6538-1）：由鹽城檢驗檢疫局檢測中心實驗室提供。

1.2 主要試劑

SS培養(yǎng)基、SC增菌液、LB培養(yǎng)基以及腦心浸液培養(yǎng)基（BHI）：購自北京陸橋公司；胰蛋白胨：中國醫(yī)藥（集團）上?；瘜W試劑公司生產(chǎn)；酵母粉：浙江省富陽市杭富生物制品廠生產(chǎn)；瓊脂粉：國藥集團化學試劑有限公司生產(chǎn)；Bac Titer-Glo發(fā)光檢測劑 ：Promega公司生產(chǎn)。

1.3 主要儀器和設(shè)備

免疫磁分離機：浙江大學生工食品學院研制；601型攪拌式電極架：海三信儀表廠生產(chǎn)；PHS-3BW微機型酸度計：上海理達儀器廠生產(chǎn)。

經(jīng)預(yù)實驗，免疫磁分離機的轉(zhuǎn)速設(shè)置為6 r/min。因為在此轉(zhuǎn)速下，離心管底部氣泡和殘留液少，因而更能準確反映試驗結(jié)果。

1.4 免疫磁珠清洗

免疫磁珠（IMB）使用前，先取出小瓶裝（2 mL/瓶，5×103個/mL）IMB，用手上下顛倒搖勻，然后取出0.3～0.9 mL IMB于1.5 mL離心管內(nèi)，加入PBS緩沖液至1.0 mL；接著置于免疫磁分離機混勻，轉(zhuǎn)速6 r/min，轉(zhuǎn)時8 min，磁分離2 min；棄去上清液，再加入1.0 mL PBS清洗IMB 1 min；去磁，混勻，轉(zhuǎn)速6 r/min，轉(zhuǎn)時5 min，磁分離2 min；棄去上清液，重復(fù)1次；最后用PBS懸浮磁珠至0.3～0.9 mL，即回到初始容積量。

1.5 細菌懸液制備

取出0.5 mL用甘油保存的金黃色葡萄球菌菌種菌液，在生物安全柜中無菌接種在50 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃ 150 r/min振蕩培養(yǎng)8 h。培養(yǎng)完成后，將菌液25 ℃ 3 000 r/min離心5 min；棄去上清液，在沉淀中加PBS緩沖液重新懸浮混勻。取出0.5 mL用甘油保存的單核細胞增生李斯特菌菌種菌液，在生物安全柜中無菌接種在50 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃ 150 r/min振蕩培養(yǎng)8 h；培養(yǎng)完成后將菌液25 ℃ 3 000 r/min離心5 min；棄去上清液，加PBS緩沖液重新懸浮沉淀，用蝸旋振蕩器混勻。取出0.5 mL甘油保存的沙門氏菌菌種菌液，在生物安全柜中無菌接種在50 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃ 150 r/min振蕩培養(yǎng)8 h；培養(yǎng)完成后將菌液25 ℃ 3 000 r/min離心5 min；棄去上清液，加PBS緩沖液重新懸浮沉淀，用蝸旋振蕩器混勻。

1.6 不同菌液免疫磁珠密度配比（平板計數(shù)法）

將免疫磁珠清洗后備用，將上述制備好的3種細菌懸液分別用PBS按10-1～10-6進行10倍梯度稀釋，取10-4、10-5、10-63個稀釋度菌液進行平板計數(shù)，每個稀釋度做3個平行試驗，同時設(shè)立空白對照。根據(jù)表1的比例在無菌EP管中加入各試劑。

表1 不同配比的免疫磁珠和細菌懸液組成 單位：mL

調(diào)節(jié)磁分離機的參數(shù)為：轉(zhuǎn)速6 r/min，轉(zhuǎn)時20 min，混勻和磁分離5 min；吸走上清液，分別作好標記（waste，簡稱W）；取1 mL PBS沖洗離心管中的菌體-免疫磁珠復(fù)合物，然后再次進行磁分離，轉(zhuǎn)速6 r/min，轉(zhuǎn)時15 min，磁分離2 min；棄去上清液，分別加入0.8 mL（8號離心管）、0.6 mL（6號離心管）、0.4 mL（4號離心管）、0.3 mL（3號離心管）PBS懸浮菌體-免疫磁珠復(fù)合物（result，簡稱R），去磁即可。

對于各個上清液W，10倍比梯度稀釋至10-1～10-5，取10-4和10-52個密度進行平板計數(shù)，每個稀釋度做3個平行試驗。

對于各個菌體-免疫磁珠復(fù)合物，10倍比梯度稀釋至10-1～10-5，取10-4和10-52個梯度進行鋪平板。每個梯度3個平行。全部培養(yǎng)皿于37 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20～24 h后菌落計數(shù)，接種量100 μL。

將所有接觸過活菌的試驗材料煮沸滅活30 h，將桌面等其它物品用75%酒精擦拭消毒，之后清洗試管等器皿，103 ℃烘箱中干燥30 min。

1.7 免疫磁分離技術(shù)特異性捕獲（平板計數(shù)法）

將免疫磁珠清洗后備用，將上述制備好的3種細菌懸液分別用PBS按10-1～10-6進行10倍梯度稀釋（Test，簡稱T），取10-4、10-5、10-63個稀釋度菌液進行平板計數(shù)，每個稀釋度做3個平行試驗；取出37 ℃ 50 mL LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)16 h的枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis，簡稱BS），用手晃動搖勻后，10倍比梯度稀釋至10-1～10-6，取10-3、10-4、10-53個稀釋度菌液鋪平板，每個稀釋度做3次平行試驗，同時設(shè)立空白對照。

按表2中的要求，分別把3種菌液和BS懸菌液加入至滅菌并裝有清洗好IMB的1.5 mL離心管中，6 r/min 20 min，磁分離5 min；倒掉上清液，取1 mL PBS沖洗離心管內(nèi)的菌體-免疫磁珠復(fù)合物，6 r/min離心15 min，磁分離2 min；吸走上清液，加入0.3 mL（3E）、0.2 mL（2E）、0.1 mL（1E）PBS懸浮菌體-免疫磁珠復(fù)合物（Result，簡稱R），去磁即可。

表2 不同配比的菌懸液和BS菌懸液 單位：mL

對于各個上清液W，10倍比梯度稀釋至10-1～10-5，取10-4、10-52個梯度，用顯色培養(yǎng)基進行鋪平板，每個梯度3個平行。

對于沙門氏菌菌體-免疫磁珠復(fù)合物懸浮液（3R、2R、1R），10倍比梯度稀釋至10-1～10-6（107～ 102CFU/mL），取10-4～10-6（104～102CFU/mL）3個梯度，用SS固體培養(yǎng)基進行鋪平板，每個梯度3個平行。

對于單核細胞增生李斯特菌菌體-免疫磁珠復(fù)合物懸浮液（3R、2R、1R），10倍比梯度稀釋至10-1～10-6（107～102CFU/mL）， 取10-4～10-6（104～ 102CFU/mL）3個梯度，用BHI固體培養(yǎng)基進行鋪平板，每個梯度3個平行。

對于金黃色葡萄球菌菌體-免疫磁珠復(fù)合物懸浮液（3R、2R、1R），10倍比梯度稀釋至10-1～10-6（107～ 102CFU/mL），取10-4～10-6（104～102CFU/mL）3個梯度，用LB固體培養(yǎng)基進行鋪平板，每個梯度3個平行。全部培養(yǎng)皿于37 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20～24 h后進行菌落計數(shù)，接種量100 μL。

1.8 ATP生物發(fā)光技術(shù)與免疫磁分離技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用

將調(diào)整好菌落數(shù)的3種細菌懸液（OD600=0.100，108CFU/mL）稀釋10倍后作為待檢菌液（T）備用；將免疫磁珠清洗，將待檢菌液與免疫磁珠按體積比1:3分別加入10個EP管中，使管內(nèi)待檢菌液體積為0.3 mL，免疫磁珠IMB 為0.9 mL。該體系中，由于免疫磁珠過量，此時可看作捕獲率為100%。分別對10個管進行磁分離，將獲得的懸浮菌體-免疫磁珠復(fù)合物收集到一個EP管中，棄上清液，用0.3 mL Tris-HCI緩沖液重懸復(fù)合物，然后加入BacTiter-Glo發(fā)光檢測劑0.3 mL進行磁分離，6 r/min 離心2 min，磁分離1 min；迅速對該上清液10倍比梯度稀釋至10-1～10-5（107～103CFU/mL），各取每個稀釋度菌液100 μL檢測菌液光源計數(shù)值，每個菌液重復(fù)檢測3次，同時設(shè)置空白對照（50 μL Tris-HCI緩沖液+50 μL BacTiter-GIo發(fā)光檢測劑）。

1.9 模擬添加樣品中磁珠吸附率研究

按照 GB/T 4789. 38—2012 中提供的方法，稱取 25 g市售嬰兒奶粉，放入盛有 225 mL生理鹽水的無菌均質(zhì)袋內(nèi)，10 000 r/min 均質(zhì)2 min，制成 1:10 樣品勻液，121 ℃ 高壓滅菌 20 min 備用；將沙門氏菌、單核細胞增生李斯特菌、金黃色葡萄球菌株過夜培養(yǎng)，用1:10 樣品勻液，分別調(diào)整菌液菌落數(shù)至終菌落數(shù)為107～102CFU/mL，再用勻漿機徹底混勻，制備成107～102CFU/mL的上述3種食源性致病菌人工污染模擬樣品。

1.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用方差分析的新復(fù)極差法（Duncan法），對各試驗組數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同菌液-免疫磁珠密度配比

所有平板37 ℃培養(yǎng)24 h。合適的梯度計算公式為：（同一梯度下3個培養(yǎng)皿的菌落數(shù)之和/3）×10×該計數(shù)培養(yǎng)皿的稀釋倍數(shù)（CFU/mL）

根據(jù)公式計算的免疫磁分離前后不同菌液、免疫磁珠配比下的菌落密度見表3。而IMB濃度為5.0×108個/mL，根據(jù)公式，捕獲率= 磁分離后的菌落數(shù)/磁分離前的菌落數(shù)×100%。 計算出不同菌液、免疫磁珠配比下的捕獲率見表4。

根據(jù)表4中的捕獲率結(jié)果，繪制圖1。由圖1可以看出，沙門氏菌和單核細胞增生李斯特菌待檢菌體濃度與IMB濃度之間體積比下降，則免疫磁珠的捕獲率越高，即待檢菌液中的細菌個體分配到的IMB越多，捕獲率越高。當一個菌株能分配到38個免疫磁珠時，其捕獲率分別可達到98.75%、99.49%和98.57%，近似全部的菌體能被IMB捕獲到。金黃色葡萄菌菌液具有同樣的趨勢，但捕獲率最高的條件為一個菌株分配到25個免疫磁珠。

表3 免疫磁分離前后不同菌液、免疫磁珠配比下的菌落數(shù)

表4 不同菌液、免疫磁珠配比下的捕獲率

圖1 不同菌體、免疫磁珠配比下的捕獲率比較

2.2 免疫磁分離技術(shù)特異性捕獲

所有的平板在37 ℃培養(yǎng)24 h后，經(jīng)2.1所述公式計算得到沙門氏菌、單核細胞增生李斯特菌、金黃色葡萄球菌和枯草煙包桿菌的菌落數(shù)分別為0.93×108、1.2×108、1.25×108和1.55×106CFU/mL（表5）。3個離心管中，磁分離后各菌的捕獲率見表6。

根據(jù)表6和圖2的結(jié)果可以看出在控制總體積、IMB加入量以及待檢菌和BS菌密度不變的情況下，當細菌體積減小，BS菌體積增加，其捕獲率先下降后上升，出現(xiàn)下降可能是因為免疫磁珠的特異性受到了枯草芽孢桿菌的影響，因此對靶標菌的富集效率降低，當待檢菌體積繼續(xù)下降，使得免疫磁珠的與待檢菌的比例大大過量，這可能是捕獲率上升的原因。

2.3 ATP生物發(fā)光法與免疫磁分離技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用

免疫磁分離后．各個稀釋梯度下菌液的光源計數(shù)值（減去空白后）所得結(jié)果，繪制成相關(guān)性曲線見圖3。由圖3可知，沙門氏菌、單核細胞增生李斯特菌以及金黃色葡萄球菌的ATP生物發(fā)光技術(shù)與免疫磁珠聯(lián)合應(yīng)用的檢測結(jié)果與傳統(tǒng)的平板計數(shù)法具有良好的線性關(guān)系，3個待檢菌的相關(guān)系數(shù)分別為R2=0.976 2，P＜0.000 1； R2=0.986 6，P＜0.000 1；R2=0.991 1，P＜0.000 1。從結(jié)果來看，當菌液菌落數(shù)較高時（105～108CFU/mL）兩種檢測方法的結(jié)果幾乎一致；當菌液菌落數(shù)較低時（103～ 105CFU/mL）兩種方法存在一定差異，但是從總體來看，相關(guān)性良好。

從圖3中可以看出，初始菌落數(shù)為107CFU/mL的待測菌液，經(jīng)免疫磁分離技術(shù)濃縮后，待檢菌液密度上升為108CFU/mL；ATP生物發(fā)光技術(shù)的最低檢測限為103CFU/mL，因此當ATP生物發(fā)光技術(shù)與免疫磁珠分離技術(shù)結(jié)合后，可大大降低檢測極限，使得最低檢測限下降至102CFU/mL，因此ATP生物發(fā)光技術(shù)與免疫磁珠分離技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用檢測效率更高。

表5 各個離心管中的菌落數(shù) 單位：CFU/mL

表6 不同待測細菌和枯草芽孢桿菌配比下的捕獲率

圖2 不同的菌液配比的捕獲率比較

圖3 各菌落數(shù)下待捕獲細菌的光源計數(shù)值與各菌落數(shù)之間的關(guān)系

2.4 模擬樣本中3種細菌檢測

模擬樣本中的待捕獲細菌的ATP發(fā)光檢測結(jié)果見表7。表7數(shù)據(jù)顯示，3種細菌由于使用了免疫磁珠的捕獲，菌落數(shù)被濃縮了近1個梯度，原來為107～102CFU/mL的模擬樣本，ATP發(fā)光檢測分別接近108～103CFU/mL（表7）。

3 討論

在食源性疾病中因微生物引起的比例最高。陳夏威等[7]用描述流行病學方法，對珠三角某市2001—2015年食源性疾病暴發(fā)事件進行統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)：共報告食源性疾病暴發(fā)事件181起，發(fā)病4 493例，主要場所為集體食堂（占59.1%，107/181）和餐飲單位（占29.8%，54/181）；由微生物引起的事件和涉及人數(shù)最多，事件數(shù)和發(fā)病數(shù)分別占總數(shù)的55.8%（101/181）和60.0%（2 696/4 493）。吳雨晨等[8]通過調(diào)查江蘇省2016年食源性疾病，分析發(fā)現(xiàn) 2016年江蘇省共發(fā)生食源性疾病暴發(fā)事件143起，由食源性致病菌引發(fā)的占63.64%。所以，加強食源性疾病監(jiān)測、預(yù)警和系統(tǒng)建設(shè)，提升食源性疾病暴發(fā)事件現(xiàn)場流行病學調(diào)查處置能力具有重要意義。

目前國內(nèi)外市場雖然也有多款微生物快速檢測儀可供選擇，但是這些快速檢測儀多為國外進口產(chǎn)品，價格昂貴，如果再配上儀器所需要的配件、試劑、耗材及常規(guī)維護檢修會大大增加檢測成本。因此，建立一種快速檢測食品微生物技術(shù)是我國食品安全領(lǐng)域科研工作者急需解決的問題。

ATP 生物發(fā)光法的優(yōu)點是快速、簡便、重現(xiàn)性好，但是該技術(shù)對于細菌樣品的最低檢測限為1 000個/mL，因此該技術(shù)的靈敏度可能會達不到衛(wèi)生學要求[9]。為了提高微生物檢測的靈敏度，將免疫磁珠分離法與ATP 生物發(fā)光技術(shù)聯(lián)合使用，通過免疫磁珠分離技術(shù)對待檢樣品進行一定程度的濃縮，再通過ATP 生物發(fā)光技術(shù)進行檢測，這樣就大大提高了ATP 生物發(fā)光技術(shù)的靈敏度。同時免疫磁珠分離技術(shù)可以特異性結(jié)合待檢樣品，從而彌補了ATP生物發(fā)光技術(shù)無法區(qū)分不同微生物的缺陷。因此，兩種技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用在微生物檢測、細胞分離、免疫吸附等方面的應(yīng)用越來越廣泛[10]。該技術(shù)在醫(yī)學衛(wèi)生領(lǐng)域已發(fā)揮了很大作用，主要用于分離純化和檢測微生物[11]，比如環(huán)境水及飲用水中微生物檢測，食品樣品中微生物檢測[12]，生物樣品中細菌檢測，人體內(nèi)T、B淋巴細胞及多種腫瘤細胞檢測[13]。本研究通過免疫磁珠的富集，使樣品微生物濃度增加了10倍，原本為107～102CFU/mL的模擬樣本，ATP發(fā)光檢測后分別接近108～103CFU/mL，大大提高了樣本檢出率。這一結(jié)果與Yuxiao等[14]所做出的結(jié)果類似，進一步說明本研究發(fā)明的免疫磁珠富集后聯(lián)合ATP發(fā)光技術(shù)檢測食品中的沙門氏菌、單核細胞增生李斯特菌以及金黃色葡萄球菌的方法可行，并且具有快速、高敏感、高特異性以及價格低廉的特點。

表7 模擬樣本中3種食源性致病菌免疫磁珠吸附后的ATP生物發(fā)光檢測 單位：CFU/mL

4 小結(jié)

本研究比較了不同的菌體-免疫磁珠濃度配比下，免疫磁分離技術(shù)的捕獲率，發(fā)現(xiàn)當菌體-IMB濃度配比為1:30時，沙門氏菌和單核細胞增生李斯特菌捕獲率可達近100%，所有細菌可被免疫磁珠捕獲。當菌體-IMB濃度配比為1:25時，金黃色葡萄球菌捕獲率可達近100%，所有菌可被免疫磁珠捕獲。在總體積0.4 mL不變、IMB加入量不變的情況下，比較了3種待測細菌和枯草芽孢桿菌不同體積比下的捕獲率，均出現(xiàn)捕獲率先下降后上升情況。免疫磁分離技術(shù)與ATP生物發(fā)光法聯(lián)用技術(shù)與傳統(tǒng)的細菌培養(yǎng)方法有良好的線性相關(guān)性，檢測限可低達102CFU/mL。模擬樣本中的待捕獲細菌ATP發(fā)光檢測發(fā)現(xiàn)，3種細菌由于使用了免疫磁珠捕獲，濃度被濃縮了近10倍。