周芃來，馬葉婷，李潤麗，李 瑾，高文偉，劉 卿

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山西太谷 030801）

剛地弓形蟲（Toxoplasma gondii）幾乎能感染所有溫血動物，引起危害嚴(yán)重的，呈世界性流行的人獸共患弓形蟲病[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球約有33%的人口感染弓形蟲，我國人群弓形蟲感染率約為7.88%[2-3]。免疫功能正常的人感染弓形蟲后，一般無明顯臨床癥狀，但是免疫功能低下或缺陷者（如孕婦及HIV患者等）感染后，會遭受致命的傷害甚至死亡[4-5]。孕畜感染弓形蟲后，會發(fā)生流產(chǎn)，產(chǎn)死胎或畸胎等，給畜牧業(yè)帶來較大經(jīng)濟(jì)損失[6]。同時，弓形蟲病作為一種食源性人獸共患原蟲病，可通過污染的動物源性食品，隨人類消費(fèi)而傳播。

弓形蟲感染宿主細(xì)胞離不開三大分泌細(xì)胞器，分別為微線體、棒狀體和致密顆粒[7]。致密顆粒細(xì)胞器分泌的致密顆粒蛋白（Dense granule antigens，GRAs）目前已鑒定出約30種。其中，有些致密顆粒蛋白已被證實(shí)是較好的弓形蟲診斷抗原，更重要的是其中一些多態(tài)性蛋白可用于弓形蟲的血清學(xué)分型，例如GRA3、GRA6和GRA7蛋白[8-10]。弓形蟲GRA15蛋白也是多態(tài)性蛋白，但是目前沒有關(guān)于這方面的研究報(bào)道[11]。本研究通過表達(dá)純化弓形蟲GT1蟲株GRA15（GRA15GT1）蛋白，并對其免疫反應(yīng)原性進(jìn)行分析，以期為基于GRA15蛋白的弓形蟲診斷及血清學(xué)分型試劑的研制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 蟲株cDNA、菌種及質(zhì)粒

弓形蟲GT1蟲株的cDNA：由本實(shí)驗(yàn)室保存；原核表達(dá)載體pGEX-6p-1：購自山西賽奧生物科技有限公司；DH5ɑ及BL21大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞：購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 主要試劑

膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒及DAB顯色試劑盒：購自天根生化科技有限公司；限制性內(nèi)切酶、PrimeSTAR Max Premix（2×）及rTaq酶：購自大連Takara公司；Protein GST Resin：購自全式金生物科技有限公司；抗GST標(biāo)簽鼠單克隆抗體：購自康為世紀(jì)生物科技有限公司；IHA間接血凝試劑盒中的豬弓形蟲陽性血清：購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所；羊抗鼠HRP標(biāo)記二抗：購自北京奧博森生物技術(shù)有限公司；HRP標(biāo)記的羊抗豬二抗：購自美國Proteintech Group公司；PAGEMASTER Protein Standard蛋白Marker：購自南京金斯瑞生物科技有限公司；PageRuler Prestained Protein Ladder：購自美國Thermo Scientif i c公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)

依據(jù)ToxoDB數(shù)據(jù)庫（http://toxodb.org/toxo/）和NCBI數(shù)據(jù)庫基因信息，采用Primer 6.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物擴(kuò)增弓形蟲GT1蟲株的GRA15基因，上游引物P1序列為5'-GGGGGATCCATAATTCGGTGGCTTGGGTATCTTAC-3'，下游引物P2序列為5'-GGGGAATTCTCATGGAGTTACCGCTGATTGTGTG-3'。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.4 GRA15GT1基因擴(kuò)增

以弓形蟲GT1蟲株的cDNA為模板，用Prime STAR Max DNA Polymerase進(jìn)行PCR擴(kuò)增，25 μL反應(yīng)體系為：Prime STAR Max Premix（2×）12.5 μL，引物P1/P2各0.25 μL，模板 1 μL，滅菌水 11 μL。PCR反應(yīng)條件為：98 ℃ 10 s，55 ℃ 5 s，72 ℃ 10 s，共30個循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳后，用膠回收試劑盒回收切下目的片段。

1.5 pGEX-6p-1-GRA15GT1載體構(gòu)建

對回收的GRA15GT1基因加A尾，25 μL的反應(yīng)體系和條件如下：GRA15GT1基因回收產(chǎn)物19.5 μL，rTaq酶0.5 μL，LA Buffer 2.5 μL，dNTP Mix 2.5 μL，72 ℃ 30 min，經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳后回收目的條帶。將加A尾的GRA15GT1基因連接至T Vector pMD19（Simple）載體中，轉(zhuǎn)化DH5ɑ感受態(tài)細(xì)胞，菌液PCR鑒定為陽性的提取質(zhì)粒，并送上海生工生物工程有限公司測序，將測序正確的質(zhì)粒命名為pMD19T-GRA15GT1。

對pMD19T-GRA15GT1載體用BamHI和EcoRI進(jìn)行雙酶切，回收目的條帶。將目的基因連接至經(jīng)同樣酶切處理的pGEX-6p-1載體，并轉(zhuǎn)化入DH5ɑ感受態(tài)細(xì)胞。菌液PCR鑒定為陽性的提取質(zhì)粒，并進(jìn)行雙酶切和測序鑒定，將鑒定正確的質(zhì)粒命名為pGEX-6p-1-GRA15GT1。

1.6 GRA15GT1融合蛋白表達(dá)及純化

將pGEX-6p-1-GRA15GT1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21，將菌液PCR鑒定正確的菌液按1:50的比例接種到8 mL含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37 ℃ 220 r/min，培養(yǎng)至菌液OD600達(dá)到0.6時，吸出2 mL菌液作為對照，剩余菌液加入IPTG至終濃度為1 mmol/L，37 ℃ 220 r/min，誘導(dǎo)6 h；分別將2 mL對照組菌液和誘導(dǎo)表達(dá)的菌液進(jìn)行超聲破碎，離心收集破碎后的上清和沉淀，分別加入蛋白上樣緩沖液后100 ℃煮沸5 min。然后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍(lán)染色后觀察蛋白是否表達(dá)及分析可溶性。

小量誘導(dǎo)驗(yàn)證GRA15GT1融合蛋白為可溶性表達(dá)后，收集500 mL誘導(dǎo)菌液，8 000 r/min離心3 min，收集菌體，用PBS清洗3次，加入適量PBS重懸后進(jìn)行超聲破碎，然后離心收集破碎后的上清；采用全式金的Protein GST Resin試劑盒純化GRA15GT1融合蛋白。

1.7 Western blot分析

將純化后的GRA15GT1融合蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上（共兩張膜，每張膜均轉(zhuǎn)有GRA15GT1融合蛋白），用2.5%的脫脂奶粉封閉液37 ℃封閉2 h。用PBST洗膜后，第1張膜加入1: 3 000稀釋的抗GST標(biāo)簽蛋白的鼠單克隆抗體，37 ℃孵育2 h，用PBST洗膜后再加入1: 6 000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗，37 ℃孵育1 h；第2張膜加入1: 300稀釋的豬抗弓形蟲陽性血清，用PBST洗膜后再加入1: 5 000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗豬二抗，37 ℃孵育1 h。用PBST洗膜后加入DAB顯色液，避光顯色5～10 min后用蒸餾水終止反應(yīng)，觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 GRA15GT1基因擴(kuò)增

以弓形蟲GT1蟲株的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得與預(yù)期一致的1 755 bp的片段（圖1）。

圖1 GRA15GT1基因擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果

2.2 pGEX-6p-1-GRA15GT1酶切及測序鑒定

用BamHⅠ 和EcoRⅠ 對pGEX-6p-1-GRA15GT1質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定。由圖2可見：一條大小為4 984 bp，與pGEX-6p-1的線性片段大小一致；另一條大小為1 755 bp，與弓形蟲GRA15GT1基因大小相符。測序結(jié)果與理論序列的比對結(jié)果一致。

圖2 pGEX-6p-1-GRA15GT1質(zhì)粒酶切鑒定

2.3 GRA15GT1融合蛋白表達(dá)及純化

誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)后的表達(dá)菌經(jīng)超聲破碎后離心，分別收集上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。結(jié)果顯示，誘導(dǎo)表達(dá)菌破碎離心后的上清與對照組相比，在80～120 kDa處有特異性條帶。誘導(dǎo)表達(dá)菌破碎離心的上清經(jīng)純化后，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，發(fā)現(xiàn)在100 kDa處有單一條帶，比理論值87 kDa稍大（圖3-a）。純化蛋白利用小鼠抗GST標(biāo)簽抗體作為一抗進(jìn)行免疫印跡反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)有特異性條帶，且大小與SDS-PAGE電泳結(jié)果一致（圖3-b）。

圖3 純化的GRA15GT1融合蛋白表達(dá)分析

2.4 GRA15GT1融合蛋白反應(yīng)原性的Western blot分析

對純化蛋白利用豬弓形蟲陽性血清作為一抗進(jìn)行免疫印跡反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)有特異性條帶，且大小與SDS-PAGE電泳結(jié)果及利用小鼠抗GST 標(biāo)簽抗體作為一抗進(jìn)行的免疫印跡反應(yīng)結(jié)果一致（圖4）。

圖4 Western blot分析GRA15GT1融合蛋白反應(yīng)原性

3 討論

弓形蟲病是危害嚴(yán)重的人獸共患原蟲病，做好弓形蟲病診斷及掌握其流行病學(xué)資料對于該病防控具有重要意義。弓形蟲病診斷方法主要有臨床診斷、病原學(xué)診斷、PCR診斷及血清學(xué)診斷等[12-13]。弓形蟲病的臨床癥狀與某些傳染病相似，單靠臨床癥狀難以診斷[5，14]。病原學(xué)診斷依賴于顯微鏡檢查，然而，僅基于光鏡的蟲體辨別是不敏感、不可靠的。電鏡也用于檢測小鼠腦組織囊腫和感染貓小腸卵囊，但難以常規(guī)使用[15-16]。PCR技術(shù)因具有特異、敏感、快速等優(yōu)點(diǎn)，已普遍應(yīng)用于弓形蟲病診斷和流行病學(xué)調(diào)查[17]，更重要的是PCR可用于弓形蟲不同蟲株的分型[12]，但PCR技術(shù)在進(jìn)行非卵囊樣品的流行病學(xué)調(diào)查時存在缺陷，如需要活體動物組織等。

血清學(xué)診斷是進(jìn)行弓形蟲流行病學(xué)調(diào)查的重要手段，適合大規(guī)模樣品檢測，方法包括改良凝集試驗(yàn)（MAT）、間接血凝實(shí)驗(yàn)（IHA）及ELISA等[2，18-20]。其中，ELISA方法可用抗原（速殖子裂解抗原或重組表達(dá)抗原）或抗體對弓形蟲感染情況進(jìn)行檢測，例如SAG1、MIC1、MIC3及GRA3等重組表達(dá)抗原[21-23]。致密顆粒蛋白在弓形蟲入侵過程中不發(fā)揮作用，其在蟲體侵入宿主細(xì)胞形成納蟲泡后才開始分泌。弓形蟲入侵宿主細(xì)胞時分泌的蛋白雖然可引起機(jī)體免疫反應(yīng)產(chǎn)生抗體，但最終可能被滅殺而未在宿主細(xì)胞內(nèi)增殖。鑒于此，使用致密顆粒蛋白而不是入侵相關(guān)蛋白（如微線蛋白）作為診斷抗原，可能檢測結(jié)果更準(zhǔn)確。但是目前未有關(guān)于弓形蟲GRA15GT1蛋白免疫反應(yīng)原性的報(bào)道。本研究表明，GRA15GT1蛋白能夠成功地與豬弓形蟲陽性血清反應(yīng)，從而豐富了診斷弓形蟲感染的可用抗原。

基于弓形蟲多態(tài)性蛋白的ELISA方法可用于弓形蟲的血清學(xué)分型，例如GRA3，GRA6和GRA7蛋白等[12]。但是目前沒有關(guān)于弓形蟲多態(tài)性GRA15蛋白血清學(xué)分型方面的研究。GT1蟲株GRA15蛋白與PRU蟲株及RH蟲株的GRA15蛋白相比，均存在共有肽段，因此本研究表達(dá)和分析了GRA15GT1蛋白的免疫反應(yīng)原性[11]。該研究是評價GRA15GT1蛋白在GT1蟲株、PRU蟲株及RH蟲株血清學(xué)分型中應(yīng)用的前提。

4 結(jié)論

本研究成功表達(dá)了弓形蟲GT1蟲株GRA15蛋白，經(jīng)Western blot分析顯示，該蛋白能夠與豬弓形蟲陽性血清反應(yīng)，表明表達(dá)的GRA15GT1蛋白具有較好的反應(yīng)原性。這為下一步分段表達(dá)GRA15GT1蛋白，研究其在弓形蟲血清學(xué)分型中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。