郭春莉，付 強，高 穎

（1. 中國中醫(yī)科學院西苑醫(yī)院 北京 100091；2. 中國標準化研究院 北京 100191；3. 北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院 北京 100700）

中風病是嚴重危害人類健康的常見病，具有高發(fā)病率、高致殘率、高死亡率和高復發(fā)率的特點，已成為第一位致殘和死亡的原因[1]。雖然超早期溶栓和急性期神經(jīng)元保護取得了重要進展，但對于大多數(shù)腦缺血患者而言，神經(jīng)元死亡不可避免[2]，患者多需要他人幫助才能完成日常生活活動，給社會和家庭帶來沉重負擔?；|(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）是降解細胞外基質(zhì)的蛋白酶類之一，在大腦的血管內(nèi)皮細胞、星形細胞和小膠質(zhì)細胞中都存在許多種類的MMPs，在出現(xiàn)腦缺血或者缺血的灌注損傷時，MMPs 被激活開始破壞基質(zhì)和開放血腦屏障，導致腦水腫，促進急性腦梗死發(fā)病[3]?；|(zhì)金屬蛋白酶家族在人的動脈斑塊損傷部位表達。激活的MMPs 降解纖維帽的結構基質(zhì)組成，包括膠原纖維和彈力纖維，削弱纖維帽，成為斑塊不穩(wěn)定的主要因素。在外在觸發(fā)條件下，斑塊破裂，釋放大量組織因子、激活血小板和凝血系統(tǒng)，形成血栓，導致腦血管疾病[4]。MMP-1是基質(zhì)金屬蛋白酶家族中表達量最高的間質(zhì)膠原酶，動脈粥樣硬化斑塊脂質(zhì)核心強烈表達MMP-1，局部血壓增高，血流剪切力增強，可使血管壁合成MMP-1 增加，所以MMP-1 的表達與斑塊破裂存在正相關，MMP-1 含量越高之處，斑塊越易破裂[5]。Carrell 把動脈硬化損傷分成兩類:①血管壁膠原數(shù)量增加致使血管腔變窄；②動脈瘤的出現(xiàn)使管腔體積變小，管腔發(fā)生破裂。目前研究表明，兩種管壁損傷中都出現(xiàn)了MMP-1水平增高[6]，表明MMP-1 可能和動脈粥樣硬化過程存在重要的關系。MMP-3 也是在動脈粥樣斑塊中表達的MMPs 家族的主要成員，它廣泛存在于動脈粥樣病變處，在斑塊破裂中起重要作用，如果頸動脈B 超發(fā)現(xiàn)軟斑塊結合臨床血漿MMP-3 升高，可進一步反應斑塊的不穩(wěn)定性，要積極地抗炎治療，以預防及控制動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展，并預防和控制TIA進一步發(fā)展為腦梗死[7]。Henney等運用原位雜交技術檢測到冠狀動脈粥樣硬化斑塊中MMP-3 的轉(zhuǎn)錄物與巨噬細胞共同存在于斑塊的肩部[8]。Silence Y 等[9]的研究也證實MMP-3 可通過降解基質(zhì)成分而與斑塊的不穩(wěn)定性有關，從而認為，MMP-3 血清水平與頸動脈斑塊穩(wěn)定性有關，可能是反映動脈粥樣硬化斑塊不穩(wěn)定性的新的指標。臨床證據(jù)表明，中藥對缺血性卒中治療有效，其主要是通過干預證候達到改善或治療疾病，臨床研究提示，中風急性期約有40%-50%的病人表現(xiàn)出痰熱證，中醫(yī)藥對中風病急性期痰熱證的治療也突顯優(yōu)勢，之前的研究顯示MMP-2 與中風病急性期痰熱證存在相關性，可以成為微觀辨證的依據(jù)，MMP-1 和MMP-3 亞型與腦梗塞的分型目前有一些相關性研究，MMP-1 和MMP-3與中風病急性期痰熱證是否存在相關性，其相關性研究能否形成微觀辨證的依據(jù)，以及能否成為證候診斷及療效評價的依據(jù)對中醫(yī)藥治療中風病具有重要的意義，目前未發(fā)現(xiàn)相關報道。

1 研究資料和方法

1.1 臨床資料

本研究數(shù)據(jù)來源于2013 年8 月-2015 年5 月發(fā)病7 天內(nèi)就診于中國中醫(yī)科學院西苑醫(yī)院的缺血性中風痰熱證患者45 名，非痰熱證44 名，發(fā)病年齡均為35-85歲。

1.2 篩選中風病急性期受試者

1.2.1 疾病診斷

疾病診斷標準參照2005年衛(wèi)生部疾病控制司、中華醫(yī)學會神經(jīng)病學分會頒布的《中國腦血管病防治指南（試行版）》的腦梗塞診斷部分。

1.2.2 證候診斷

證候診斷標準參照973 計劃“缺血性中風病證結合的診斷標準與療效評價體系研究”課題組制定的《缺血性中風證候要素診斷量表》。

1.2.3 納入標準

符合疾病診斷標準；起病7 天以內(nèi)；年齡≥35 歲且≤85歲者。

1.2.4 排除標準

蛛網(wǎng)膜下腔出血者；既往有腫瘤、造血系統(tǒng)疾病者；有精神性疾病患者；不配合者。

1.3 臨床信息采集

所有入選受試者均填寫統(tǒng)一表格，表格內(nèi)容主要是人口學資料、病史調(diào)查，中風病急性期受試者并填寫病例觀察表、中風病證候要素診斷量表，分為痰熱組和非痰熱組，均于入院后第1 d 清晨空腹取血，采用酶聯(lián)免疫吸附法測定血清MMP1和MMP-3水平。

1.4 研究方法

1.4.1 證候量化評定

經(jīng)過統(tǒng)一組織的量表使用培訓后，由納入之日由腦病科醫(yī)師使用《缺血性中風證候要素診斷量表》，對每例患者分別作出內(nèi)風證、內(nèi)火證、痰濕證、血瘀證、氣虛證和陰虛證的量化診斷（得分≥10分診斷成立）。

1.4.2 受試者血清MMP1和MMP3的測定

在缺血性中風病起病第7 d 采肘靜脈血10 mL，留取標本后盡快注入EDTA 抗凝管內(nèi)，4℃、3000 r·min-1離心10 min，吸取上清液，-20℃至-80℃保存待測。采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法檢測血清中MMP1 和MMP-3的含量（ng·mL-1）。

1.5 實施過程及結果

1.5.1 試驗儀器

酶標儀：芬蘭（LabsystemsMultiskan MS），儀器型號：352 型；洗板機：（芬蘭）Thermo Labsystems，儀器型號：AC8；離心機：微量高速離心機（國產(chǎn)），儀器型號：TG16W；培養(yǎng)箱：隔水式恒溫培養(yǎng)箱（國產(chǎn)），儀器型號：GNP-9080型。

1.5.2 操作步驟

標準品的稀釋與加樣：標準品按照說明書稀釋好五個梯度，各個梯度每孔加樣量都為50 μl，

加樣：分別設空白孔、待測樣品孔。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40 μl，然后再加待測樣品10 μl。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。

溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30 min。

配液洗滌：將30（48T 的20 倍）倍濃縮洗滌液用蒸餾水30（48T 的20 倍）倍稀釋后備用；小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 秒后棄去，如此重復5次，拍干。

加酶：每孔加入酶標試劑50 μl，空白孔除外。

溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30 min。

洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 s后棄去，如此重復5次，拍干。

顯色：每孔先加入顯色劑A50 μl，再加入顯色劑B50 μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15 min.

終止：每孔加終止液50 μl，終止反應

測定：以空白空調(diào)零，450 nm 波長依序測量各孔的吸光度（OD 值）。測定應在加終止液后15 min 以內(nèi)進行。（主波長450，輔助波長630）

1.5.3 計算

以標準物的濃度為橫坐標，OD 值為縱坐標，在坐標紙上繪出標準曲線，根據(jù)樣品的OD 值由標準曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標準物的濃度與OD 值計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD 值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。

1.6 統(tǒng)計學方法

應用SPSS 17.0版本，組內(nèi)數(shù)據(jù)分析采取獨立樣本t檢驗，組間分析采取單向方差分析的方法.

表1 痰熱組和非痰熱組MMP1（ng·mL-1）含量測定參數(shù)

表2 痰熱組和非痰熱組MMP3（ng·mL-1）含量測定參數(shù)

2 研究結果

研究結果如下圖所示：

研究共納入缺血性中風患者89名，研究人員經(jīng)過統(tǒng)一組織的量表使用培訓后，由腦病科醫(yī)師使用《缺血性中風證候要素診斷量表》，對每例患者分別作出內(nèi)風證、內(nèi)火證、痰濕證、血瘀證、氣虛證和陰虛證的量化診斷（得分≥10 分診斷成立）。痰熱證患者45名，非痰熱證44名，所有入選受試者均填寫統(tǒng)一表格，表格內(nèi)容主要是人口學資料（指調(diào)查患者的個人信息，包括患者姓名、性別、出生日期、家庭住址、聯(lián)系電話等）、病史調(diào)查（既往史、家族史、過敏史、生命體征、一般內(nèi)科情況、神經(jīng)系統(tǒng)檢查等），中風病急性期受試者并填寫病例觀察表、中風病證候要素診斷量表。結果顯示，發(fā)病7天內(nèi)中風病痰熱組MMP-1和MMP-3的表達較非痰熱組比較，P＞0.05，統(tǒng)計學無明顯差異。

3 討論

中藥對缺血性卒中治療有效，其主要是通過干預證候達到改善或治療疾病，因此證候的規(guī)范化研究一直是中風病診療研究的重點和難點。

“辨證論治”被認為是中醫(yī)學術思想的精髓，已經(jīng)成為指導中醫(yī)臨床診斷和治療的基礎。“辨證”就是對病人四診所收集的臨床信息進行概括、判斷為某種證候，是論治的前提和依據(jù)，“論治”是根據(jù)辨的證候來確定治法和處方譴藥，因此“證候”是連接中醫(yī)學理論和臨床研究的核心與關鍵問題。傳統(tǒng)中醫(yī)只能依靠望、聞、問、切來獲取患者的臨床信息等病情資料，臨床信息分辨率低、信息量小，模糊性大，信息收集過程中主觀性很大，而且受到個人師承、臨床經(jīng)驗、認知水平和方法及不同時代的不同，導致辨出的證候差別很大，使得辨證的精確性和重復性較差，影響了研究結論的真實性和可靠性，而且證候的概念模糊不清，表現(xiàn)出對證候名稱及其內(nèi)涵描述的經(jīng)驗化和隨意性。所以，目前的中醫(yī)證候描述存在不確定性、中醫(yī)病名描述缺乏規(guī)范性，隨意性較大，缺乏統(tǒng)一的標準，不利于中醫(yī)、西醫(yī)理論的滲透和溝通，不利于自身的學術交流與對外交流，急需對證候規(guī)范化提出新的要求。

宏觀辨證是指以中醫(yī)基礎理論為指導，根據(jù)四診所取得的信息，判斷出因、位、病、勢的辨證方法。微觀辨證是運用現(xiàn)代科技方法對中醫(yī)證候內(nèi)在的病理、生化等方面的客觀指標進行分析，目的是深入探討證候的內(nèi)在機理，揭示其發(fā)生的物質(zhì)基礎，從而用客觀指標補充中醫(yī)病證診斷標準。宏觀辨證客觀化，微觀指標整體化，宏觀辨證與微觀辨證有機地結合有利于證候診斷與評價的客觀化，有利于中西醫(yī)結合工作的推動。

王永炎院士對于證候的生物學基礎研究方面，提出了重要的“證候概念及其屬性”理論[10]：即證候是一個非線性的“內(nèi)實外虛”、“動態(tài)時空”和“多維界面”的復雜系統(tǒng)，所謂“實”是指最能反映證候病機的權重最大的關鍵內(nèi)容，是群體在某一特定病變過程中所具有的共性癥狀信息，是治則干預的依據(jù)?！疤摗笔侵改骋换颊咚憩F(xiàn)的一系列個性化癥狀信息，對干預原則和方法具有一定影響作用。其中“內(nèi)實外虛”是證候最重要的特性，這對于證候的基礎研究有著重要的指導意義。基于證候概念的新詮釋，生物學指標與中醫(yī)證候是否相關，或者說中醫(yī)證候微觀指標的研究成為了難點、熱點。證候與生物學指標的相關性研究也取得了豐碩成果，主要表現(xiàn)在以下方面：①篩查某一證候可能發(fā)生變化的指標；②某一疾病的西醫(yī)診斷指標和其中醫(yī)證型之間相關性的研究；③不同疾病同一證候微觀指標異同的研究；④證候主要癥狀特征的現(xiàn)代醫(yī)學闡釋[11]。例如近些年對血瘀證的研究報道較多，在實驗研究中發(fā)現(xiàn)了許多與血瘀證相關的指標，并將微循環(huán)障礙、血流變異常、血液凝固性增高或纖溶活性降低等6 項指標補充到了血瘀證的診斷標準中[12]。危氏等[13]通過對多種疾病的證候與實驗室指標相關性的分析，臨床觀察了慢性胃炎和潰瘍病患者102例，脾胃虛弱證組與脾胃濕熱證相比，脾胃濕熱證的幽門彎曲桿菌陽性率明顯高于脾胃虛弱證，說明幽門彎曲桿菌感染與中醫(yī)證候有一定相關性。

以高穎教授牽頭的國家科技重大專項“重大新藥創(chuàng)制”課題組（No.2009ZX09502-028），國家重點基礎研究發(fā)展計劃（973 計劃）課題組（No.2003CB517102）既往動態(tài)采集175 例急性缺血性中風病患者四診信息，并判斷其證候要素，應用數(shù)據(jù)挖掘手段探討缺血性中風急性期證候與生物學指標的關系，發(fā)現(xiàn)HSP70、ICAM-1、MMP9 可能是缺血性中風急性期血瘀證的微觀指標，HSP70 可能為氣虛證的微觀指標。以上研究結果均為本課題的實施提供研究基礎。

臨床研究提示，中風急性期約有40%-50%的病人表現(xiàn)出痰熱證，痰為氣血津液代謝紊亂的產(chǎn)物，為有形之邪，具有黏稠重濁之性，易與火熱相結，二者交結難解，不易變化。便秘便干、舌苔黃膩、脈弦滑構成中風病急性期痰熱證的基本證候特征及辨證要點[14]。王永炎院士指出中風病急性期病機錯綜復雜，證候變化多端，病勢發(fā)展迅猛，難以駕馭，且變證壞證頻見，極易產(chǎn)生神昏、竅閉、厥脫等，為難治重證，提出了“毒損腦絡”中風病機理論的觀點。中醫(yī)藥對中風病急性期痰熱證的治療也突顯優(yōu)勢。

大量臨床實踐證明痰熱證是中風病急性期的常見證候，痰熱證的證候演變特點及其與神經(jīng)功能缺損程度密切相關，中醫(yī)藥主要是通過干預中風病痰熱證證候因素以改善癥狀或治療疾病。本研究結合前期研究的基礎上，以王永炎院士提出的“證候概念及其屬性”理論為依據(jù)，以痰熱證與基質(zhì)金屬蛋白酶相關亞型的關系為切入點，發(fā)現(xiàn)中風病急性期痰熱證的MMP-1 和MMP-3 的表達較非痰熱組無明顯差異，其原因解釋為：①雖然此次試驗的結果為陰性，但是可能因受試者基礎疾病比較復雜，比如高血壓、糖尿病、高脂血癥、高同型半胱氨酸血癥以及吸煙、飲酒等生活習慣均可能影響MMP1、和MMP3，可以通過擴大樣本量，避免其它諸多因素對試驗結果的干擾，來發(fā)現(xiàn)更為可靠的試驗結果；②雖然本次研究顯示中風病急性期痰熱證與MMP1、MMP3 無明顯相關性，試驗結果為陰性，但中風病急性期的痰熱證預后差，病情兇險確實與基質(zhì)金屬蛋白酶的某些亞型可能存在相關性，今后的試驗可以通過多檢測基質(zhì)金屬蛋白酶亞型來確定中風病急性期與基質(zhì)金屬蛋白酶表達的相關性，進一步對中風病痰熱證證候診斷及療效評價提供更加客觀支持。