曾云龍， 趙 敏， 張 敏， 易守軍， 唐春然， 夏曉東, 賀超才

(1. 湖南科技大學 化學化工學院， 理論有機和功能分子教育部重點實驗室， 湖南 湘潭 411201;2. 長沙職業(yè)技術學院， 湖南 長沙 410217)

1 引 言

植物的植株、種子和莖塊通常是中藥材的主要組成部分，是中醫(yī)治療疾病的物質(zhì)基礎。然而植物中藥材在生長、收獲、運輸、貯存等環(huán)節(jié)中極易受到霉菌污染[1-2]，藥材受到赭曲霉、純綠青霉和碳黑曲霉污染后，它們的代謝產(chǎn)物中存在高毒性赭曲霉毒素A(OTA)，致使中藥材中OTA污染普遍存在[3-7]。OTA具有致癌、致畸、致突變、腎毒性等毒性[8-9]。服用含有微量OTA的中藥，一般不會致病患者出現(xiàn)急性中毒現(xiàn)象，但它能在人體內(nèi)積蓄，對人造成慢性毒害，引發(fā)各種疾病。近年來，人們發(fā)現(xiàn)中藥對一些重大疾病和慢性病的療效較西藥更為顯著，且毒副作用較西藥低，因此，歐美等發(fā)達國家開始研究和使用中藥。但中藥(材)普遍受到真菌毒素污染，由此引發(fā)的安全性已受到國內(nèi)外的高度重視，歐盟規(guī)定辣椒、肉豆蔻、干姜、姜黃及其混合物中OTA的限量為15 μg·kg-1，甘草根的浸漬物中OTA 限量為20 μg·kg-1。我國是中草藥的發(fā)源地，目前大約有12 000種藥用植物，為了確保藥用安全并加速中藥國際化和現(xiàn)代化，對中藥材中OTA進行監(jiān)測具有重要意義。

目前，中藥材中痕量OTA檢測方法主要有色譜法和酶聯(lián)免疫法[10-12]等。酶聯(lián)免疫法存在抗原/抗體和酶的價格高、且易失活而失效的問題；色譜法及色-質(zhì)聯(lián)用法技術要求高、所需試劑純度高、儀器設備昂貴、分析成本高，不易普及。因此，非常有必要發(fā)展簡單、快速、靈敏、準確的中藥材真菌毒素檢測方法。碳量子點碳源豐富，制備方法簡單、環(huán)保，具有很好的光學特性和生物相容性，廣泛應用于活體成像、醫(yī)療診斷和化學生物傳感等領域[13-15]。通常碳量子點熒光發(fā)射在400～550 nm可見光范圍，以其作為探針，易受內(nèi)源性物質(zhì)熒光的干擾，如果以近紅外熒光量子點為探針則能有效地消除內(nèi)源性物質(zhì)熒光的干擾。核酸適體具有選擇性高、穩(wěn)定性好、價格低等優(yōu)勢，已廣泛應用于生命科學、環(huán)境監(jiān)測、疾病診斷和食品安全監(jiān)測分析[16-18]；然而，核酸適體用于檢測中藥材中痕量OTA的報道較少。本文利用核酸適體高選擇性、近紅外熒光碳量子點優(yōu)異的熒光特性，建立了簡單、快速、靈敏的中藥材中痕量OTA的生物傳感檢測新方法。

2 實 驗

2.1 主要試劑與儀器

巰基修飾的OTA核酸適體核酸(Apt)序列[16,19]:HS-AAAAAAGATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACA由生工生物工程(上海)股份有限公司提供；赭曲霉毒素A(OTA)、赭曲霉毒素B(OTB)、黃曲霉毒素B1(AFB1)、黃曲霉毒素B2(AFB2)、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)、伏馬毒素B1(FB1)、玉米赤霉烯酮(ZEN)等真菌毒素均由北京華安麥科生物技術有限公司提供；氯金酸、檸檬酸鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鉀、三(2-羧基乙基)膦鹽酸鹽(TCEP) 等購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；考馬斯亮藍、葡萄糖和乙二胺等購自國藥試劑有限公司；其他試劑均為分析純。實驗用水為二次蒸餾水。

熒光測定在RF-5301PC熒光分光光度計(日本島津公司)上進行。

2.2 實驗方法

2.2.1 近紅外熒光碳量子點的制備

近紅外熒光碳量子點(NIRF-CQDs)按文獻[20] 方法并進行適當改進合成。簡言之，先將3%的葡萄糖水溶液置于200 ℃的水熱反應釜的恒溫鼓風干燥箱中加熱反應4 h，取出自然冷卻至室溫，過濾、離心除去大顆粒，制得最大熒光發(fā)射峰位于440 nm 左右的碳量子點預備溶液。取制備的碳量子點預備溶液2 mL, 加入1%考馬斯亮藍溶液5 mL、1%乙二胺溶液2 mL，超聲5 min，加入40 mL 水，轉(zhuǎn)至水熱反應釜中，在200 ℃下反應4 h，取出自然冷卻至室溫，10 000 r·min-1離心10 min，過濾，然后在經(jīng)透析洗滌后，將透析袋中溶液旋轉(zhuǎn)蒸干，即得到熒光發(fā)射為744 nm的近紅外碳量子點，置于陰涼處備用。

2.2.2 金納米粒子的制備

金納米粒子(AuNPs)按文獻[21]方法以檸檬酸鈉還原氯金酸制備，即：取250 mL 0.1 mmol·L-1HAuCl4溶液置于潔凈的燒杯中，在劇烈攪拌下加熱至沸騰，然后迅速加入5 mL 38.8 mmol·L-1檸檬酸鈉，溶液顏色由淺黃變?yōu)榫萍t色，繼續(xù)反應30 min后冷卻至室溫。AuNPs 的濃度按文獻[22]方法測定為2.7 nmol·L-1。

2.2.3 金納米粒子表面修飾核酸適體

巰基修飾的核酸適體在金納米粒子進行表面自組裝按文獻[23]方法進行。取巰基修飾的Apt與TCEP(Apt∶TCEP=1∶5)混勻反應1 h，即得活化的Apt；然后將活化的Apt與2.7 nmol·L-1AuNPs 混合，加入500 mmol·L-1酒石酸-HCl 緩沖溶液(pH=3.0)，在室溫下孵化30 min，轉(zhuǎn)至10 000 r·min-1離心25 min 除去未修飾到金納米粒子表面的Apt，再用pH=7.3的10 mmol·L-1磷酸鹽緩沖溶液(PBS)沖洗，如此3次，得到Apt修飾的金納米粒子(AuNPs/Apt)，將其分散于水中，4 ℃下儲存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.4 AuNPs/Apt/NIRF-CQDs復合物的制備

將NIRF-CQDs與AuNPs/Apt在10 mmol·L-1pH=7.3 的PBS溶液中混合均勻，靜置反應10 min，離心去除過量的NIRF-CQDs，沉淀再用二次蒸餾水洗滌，再離心，如此3次，得到AuNPs/Apt/NIRF-CQDs復合物，備用。

2.2.5 OTA測定

先將AuNPs/Apt/NIRF-CQDs復合物超聲分散至水中，測定其熒光強度；然后，向分散液中加入不同濃度的OTA(0～2.40 ng·mL-1)，混勻反應5 min，測定溶液的熒光強度。按同樣的方法，向復合物分散液中加入其他真菌毒素(AFB1、AFB2、DON、FB1、OTB和ZEN)，進行傳感器的選擇性試驗，OTA的濃度為1.0 ng·mL-1，其他真菌毒素的濃度均為10 ng·mmol-1，以615 nm為激發(fā)波長，測定熒光發(fā)射光譜(最大發(fā)射波長為744 nm)強度。光譜測定都在室溫下10 mmol·L-1PBS(pH=7.3)中進行。所得數(shù)據(jù)均為3次測定平均值。

2.2.6 中藥材中OTA測定

中藥樣品經(jīng)研碎，過三號篩，稱取其粉末 5 g，加入70%甲醇溶液 50 mL，超聲30 min,以4 000 r·min-1離心5 min,取上層清液10 mL，用水稀釋至 20 mL,搖勻,即得試樣溶液。

取試樣溶液適量置于AuNPs/Apt/NIRF-CQDs分散溶液中，混勻，再加入PBS緩沖溶液，搖勻，孵化5 min，測定溶液的熒光強度，確定中藥材中OTA含量。

3 結(jié)果與討論

3.1 碳量子點熒光特性

圖1是碳量子點的熒光發(fā)射光譜。所制備的碳量子點具有很好的近紅外熒光發(fā)射特性，激發(fā)波長位于615 nm時, 所制備的碳量子點的熒光發(fā)射最強，其發(fā)射峰位于744 nm。以所合成的近紅外熒光碳量子點為探針檢測OTA，可以很好地避開內(nèi)源性物質(zhì)在可見光區(qū)的熒光發(fā)射，因此能有效地消除內(nèi)源性物質(zhì)的干擾。

圖1 碳量子點的熒光光譜。a:激發(fā)光譜，b:發(fā)射光譜。

Fig.1 Fluorescence spectra of CQDs. a: Excitation spectrum. b: Emission spectra.

3.2 方法原理

金納米粒子具有強烈的熒光猝滅功能[24]。本工作以金納米粒子為熒光猝滅劑，以近紅外熒光碳量子點為熒光探針，構(gòu)建OTA傳感監(jiān)測平臺。先將巰基-OTA核酸適體與金納米粒子自組裝，形成AuNPs/Apt；再向AuNPs/Apt體系中加入NIRF-CQDs，通過靜電作用[25]，NIRF-CQDs與AuNPs/Apt自組裝生成AuNPs/Apt/NIRF-CQDs復合物，NIRF-CQDs熒光猝滅。向AuNPs/Apt/NIRF-CQDs復合物分散液體系中加入OTA時，Apt選擇性地與OTA反應生成Apt-OTA復合物，同時釋放出NIRF-CQDs，體系熒光恢復(如圖2所示)。根據(jù)OTA的濃度與體系的熒光恢復程度之間的關系，實現(xiàn)樣品中OTA的檢測。

圖2 金納米粒子/核酸適體/NIRF-CQDs+赭曲霉毒素A體系的熒光光譜

Fig.2 Fluorescence spectra of AuNPs/Aptamer/NIRF-CQDs+OTA

3.3 條件優(yōu)化

3.3.1 核酸適體用量的影響

研究了AuNPs/Apt復合物中Apt與AuNPs的量比對NIRF-CQDs熒光猝滅和恢復的影響，其猝滅程度如圖3所示。圖3顯示，Apt為AuNPs的50～150倍時，NIRF-CQDs的熒光猝滅隨Apt的比例增大而迅速增強；達到175～225倍時，體系熒光強度基本穩(wěn)定。185倍時，熒光猝滅達到最大值。

圖3 核酸適體與金納米粒子的量比對體系熒光猝滅的影響

Fig.3 Influence of aptamer and AuNPs in mole ratio on fluorescent quenching

向已發(fā)生熒光猝滅的體系中加入OTA樣品，體系熒光強度恢復情況與熒光猝滅的變化類似，與Apt的量有關。Apt用量較低時，熒光恢復程度隨Apt的用量增大而增大；Apt的用量為AuNPs的185倍時，體系熒光恢復程度達到最大，之后，熒光恢復測定Apt隨用量增大而降低。故在后續(xù)試驗中選擇Apt的用量為AuNPs的185倍(量的比)。

3.3.2 pH值對體系熒光強度恢復的影響

由于NIRF-CQDs表面氨基對H+離子敏感，在酸性環(huán)境中NIRF-CQDs接受質(zhì)子，使熒光猝滅；同樣，在較高pH值(堿性)環(huán)境中，其表面氨基可以形成氫鍵，引起碳量子點的團聚，也使熒光猝滅。因此，研究了弱酸性至弱堿性范圍(pH=4.0～9.0)體系熒光強度變化，結(jié)果見圖4。從圖4可知，在pH=4.0～6.5時，體系熒光強度隨pH升高而呈線性增大，這是由于隨體系pH增大，碳量子點表面接受質(zhì)子能力減弱所致；在pH=6.5～7.5范圍，體系熒光強度變化緩慢，且在pH=7.0～7.5時出現(xiàn)一穩(wěn)定的最大值平臺；之后又呈線性減弱變化，這是碳量子點團聚所導致的熒光猝滅現(xiàn)象。在pH=7.0～7.5范圍內(nèi)，體系熒光變化對pH不敏感，因此， pH控制在該范圍內(nèi)，體系熒光強度有很好的重現(xiàn)性，并不受pH變化的影響，故在后續(xù)試驗中，控制體系pH=7.3。

圖4 pH對體系熒光強度恢復的影響

Fig.4 Influence of pH on fluorescence intensity recovery in the system

3.3.3 孵化時間的影響

研究顯示，復合物中Apt能迅速地與OTA結(jié)合并釋放出NIRF-CQDs。室溫環(huán)境中，當樣品與復合物混合，體系熒光強度迅速恢復，孵化5 min后，體系熒光強度不再增大，并在40 min 保持穩(wěn)定。后續(xù)試驗中孵化時間定為5 min。

3.3.4 其他真菌毒素物的影響

圖5是OTA核酸適體傳感對OTA與其他真菌毒素的選擇性試驗。結(jié)果顯示，其他真菌毒素無干擾。因此，OTA核酸適體傳感可用于中藥材復雜體系中的OTA測定。

圖5 核酸適體傳感分析的選擇性，OTA為1.0 ng·mL-1，其余真菌毒素濃度為10 ng·mL-1。

Fig.5 Selectivity of the aptasensor assay, concentration of OTA: 1.0 ng·mL-1, others: 10.0 ng·mL-1.

3.3.5 標準曲線和檢出限

取AuNPs/Apt/NIRF-CQDs分散液0.1 mL用10 mmol·L-1PBS(pH=7.3)稀釋至2 mL，測定體系的熒光強度，記為F0；再分別依次向上述方法制備的溶液中加入不同濃度的OTA標準溶液，孵化5 min，測定體系熒光，記為F；其熒光強度差值為體系熒光恢復程度y=F-F0。試驗結(jié)果如圖6所示，體系的熒光強度隨著OTA的濃度增大而增強，并且，體系的熒光恢復程度y與OTA濃度在0.015～1.5 ng·mL-1范圍內(nèi)呈現(xiàn)出良好的線性關系，其線性回歸方程為y=1.816+123.4C(C為OTA的濃度，單位：ng·mL-1)，相關系數(shù)R2=0.998 3，方法檢出限(3σ/k)為8 pg·mL-1。

圖6 體系的熒光強度隨OTA濃度(0,0.015,0.030,0.050,0.10,0.20,0.30,0.50,0.75,1.00,1.50 ng·mL-1)的變化情況。插圖：F-F0與OTA的濃度在0.015～1.5 ng·L-1范圍內(nèi)成良好的線性關系。

Fig.6 Dependence of fluorescent intensity on the concentration of OTA(0, 0.015, 0.030, 0.050, 0.10, 0.20, 0.30, 0.50, 0.75, 1.00， 1.50 ng·mL-1). Inset shows the linear relationship between theF-F0and OTA concentration within the range of 0.015-1.50 ng·mL-1.

3.4 分析應用

將所構(gòu)建的核酸適體傳感體系應用于中藥材樣品中的 OTA 檢測，結(jié)果如表1所示。

從表1 可知，所測樣品均不同程度地受到OTA污染，其中麥芽和甘草污染較為嚴重，表明麥芽和甘草易受OTA污染，應加強對它們的質(zhì)量監(jiān)控。另外，回收率和 RSD 的結(jié)果表明，該傳感體系適用于中藥材中殘留真菌毒素檢測。

表1 幾種中藥材樣品中 OTA的檢測

4 結(jié) 論

核酸適體、金納米粒子和NIRF-CQDs通過自組裝形成AuNPs/Apt/NIRF-CQDs核酸適體納米復合物，使復合物中近紅外熒光碳量子點的熒光猝滅，復合物中Apt與OTA特異性結(jié)合，釋放出NIRF-CQDs，使其熒光恢復，據(jù)此，建立了近紅外熒光測定OTA的新方法；而以近紅外熒光量子點為探針能有效地消除內(nèi)源性物質(zhì)的干擾，提高了檢測的選擇性。對連翹、麥芽、甘草等中藥材中的OTA進行測定，顯示麥芽、甘草受OTA污染較為嚴重。該方法在實際樣品分析中的回收率在96.8%～104.2%，相對標準差小于5%，能滿足中藥材中微量OTA的檢測要求。