王 軍, 代蕾穎, 楊 忠, 趙丙鋒, 李 正, 王會如

(北京市醫(yī)療器械檢驗所體外診斷檢驗室, 北京 101111)

1 引 言

自動化的發(fā)光免疫分析儀越來越廣泛地應(yīng)用于醫(yī)學(xué)檢驗[1-3]。全自動發(fā)光免疫分析儀研發(fā)制造技術(shù)門檻高，涉及光、機、電、軟、液路、溫控、免疫分析等多方面的綜合技術(shù)，系統(tǒng)結(jié)構(gòu)復(fù)雜、控制時序要求嚴(yán)格、運行可靠性和精度要求高[4-5]。由于儀器結(jié)構(gòu)復(fù)雜，相應(yīng)地對其進(jìn)行性能評價和質(zhì)量檢測也有相當(dāng)?shù)碾y度，主要體現(xiàn)在：不同廠家的儀器，原理、結(jié)構(gòu)不一樣，很難建立統(tǒng)一的評價標(biāo)準(zhǔn)；儀器全封閉、自動化，從工程學(xué)上進(jìn)行操作和干預(yù)比較困難；核心評價技術(shù)，例如標(biāo)準(zhǔn)光源、發(fā)光劑等，被少數(shù)國外大企業(yè)掌握。基于以上原因，目前企業(yè)、監(jiān)管部門、使用單位基本采用儀器配套用發(fā)光免疫試劑盒來評價檢測系統(tǒng)(儀器+試劑盒)的整體性能[6-10]。這種評價方法過度依賴配套試劑盒，不能準(zhǔn)確反映儀器本身的性能，并且各個儀器所配試劑不同(激素、血藥、腫瘤標(biāo)志物、病原體……)，得出的指標(biāo)也缺乏可比性。

全自動發(fā)光免疫分析儀的關(guān)鍵模塊包括加樣系統(tǒng)、孵育系統(tǒng)、清洗系統(tǒng)和檢測系統(tǒng)，本研究對各個模塊分別建立了可行的、標(biāo)準(zhǔn)化的評價方法。本研究建立的評價方法適用于化學(xué)發(fā)光、電化學(xué)發(fā)光、熒光等不同發(fā)光原理的儀器，也適用于酶促發(fā)光和非酶促發(fā)光不同反應(yīng)類型的儀器。

2 材 料

2.1 主要儀器

全自動發(fā)光免疫分析儀：西門子Centaur XP、Centaur XPT、Centaur CP、Centaur Atellica、IMMULITE1000、IMMULITE2000、Dimension EXL；雅培ARCHITECT i2000sr；羅氏cobas e411、cobas e601、cobas e801；貝克曼庫爾特 DxI、Access 2；希森美康 HISCL-800、HISCL-5000；賽默飛世爾Phadia 250；生物梅里埃 VIDAS 3；邁克IS 1200、i3000；利德曼CI1000；邁瑞CL-1000i、CL-2000i；迪瑞CM-180；博奧ChemLiteTM 1200；新產(chǎn)業(yè)Maglumi 800、Maglumi 4000；安圖AUTOLUMO A2000、AUTOLUMO A2000 Plus；科美LiCA 500、CHEMCLIN 1500。

福祿克f50d或其他分辨率不低于0.1 ℃的溫度測量儀。

梅特勒bs210s或其他分度值為0.01 mg的電子天平。

日立U-3010型紫外分光光度計。

MilliQ Advantage超純水機。

2.2 參考光源

參考光源為發(fā)光二級管(LED)，通過調(diào)節(jié)LED驅(qū)動電流的DA值，可獲得不同光強的光。

2.3 試劑

橙黃G(Orange G)：CAS號1936-15-8。

發(fā)光劑：分為酶促和非酶促兩種，酶促發(fā)光劑由游離酶液和底物液組成，非酶促發(fā)光劑主要成分為發(fā)光標(biāo)記物和緩沖液。

空白樣品：待測物為零濃度的樣品液。

人絨毛膜促性腺激素(β-HCG)試劑盒及配套校準(zhǔn)品。

高濃度β-HCG臨床樣品：濃度超過105mIU/mL。

3 測試方法

3.1 反應(yīng)區(qū)溫度控制的正確度和波動度

將全自動發(fā)光免疫分析儀反應(yīng)區(qū)溫度設(shè)置為37 ℃，待穩(wěn)定后，使用溫度測量儀進(jìn)行測量，每隔30 s測定一次溫度值，測定時間為10 min。計算溫度測量值的算術(shù)平均值，算術(shù)平均值與設(shè)定值之差為測量偏倚，測量最大值與最小值之差的一半為溫度波動度。

3.2 加樣正確度與精密度

準(zhǔn)備可防水分揮發(fā)的適當(dāng)容器，在電子天平上調(diào)零后放到合適位置，控制全自動發(fā)光免疫分析儀的試劑針或樣品針，向該容器中加入規(guī)定量除氣超純水，再在電子天平上稱量其增加質(zhì)量，以該質(zhì)量除以當(dāng)時溫度下純水的密度得到實際加入的體積。每種規(guī)定加入量重復(fù)測量20次，超純水需提前置于恒溫、恒濕的實驗室內(nèi)平衡數(shù)小時。以加樣體積的變異系數(shù)表征加樣精密度，以加樣體積的相對偏倚表征加樣正確度。

3.3 光檢測裝置部分

3.3.1 儀器噪聲

3.3.2 發(fā)光值的線性

測試發(fā)光值的線性有下列兩種方法：

(1)發(fā)光劑法。將光源檢測專用高值發(fā)光劑用稀釋液按比例稀釋成至少5個樣品，混合均勻后用分析儀檢測發(fā)光值，每個樣品重復(fù)測定3次。計算各樣品3次測量值的算術(shù)平均值，以稀釋比例為自變量，以測定結(jié)果均值為因變量進(jìn)行線性擬合，并計算線性回歸的相關(guān)系數(shù)(r)。

(2)參考光源法。在分析儀上測試參考光源，通過調(diào)節(jié)LED驅(qū)動電流的DA值，可獲得不同光強的光，以標(biāo)定值為自變量，以分析儀實際測量所得的發(fā)光值為因變量進(jìn)行線性擬合，并計算線性回歸的相關(guān)系數(shù)。

3.3.3 發(fā)光值的精密度

可選用發(fā)光劑法或參考光源法進(jìn)行試驗。用分析儀對在線性范圍內(nèi)的高、低2個水平的參考光源或發(fā)光劑進(jìn)行測試，連續(xù)測試10次，記錄發(fā)光值，計算發(fā)光值的變異系數(shù)，用變異系數(shù)表征發(fā)光值的精密度。

3.3.4 發(fā)光值的穩(wěn)定性

可選用發(fā)光劑法或參考光源法進(jìn)行試驗。待分析儀開機處于穩(wěn)定工作狀態(tài)后，用在線性范圍內(nèi)的高、低2個水平的參考光源或發(fā)光劑進(jìn)行測試，重復(fù)測試3次，記錄發(fā)光值，計算測定結(jié)果的算術(shù)平均值I0。過4 h和8 h再分別上機重復(fù)測試3次，計算測定結(jié)果的算術(shù)平均值I1和I2，以I0作為基準(zhǔn)值，計算4 h和8 h的相對偏倚(a，%)，用相對偏倚表征發(fā)光值的穩(wěn)定性。

3.4 攜帶污染

4 結(jié) 果

4.1 反應(yīng)區(qū)溫度控制的正確度和波動度

免疫反應(yīng)的完成需要在一定溫度下進(jìn)行，因此儀器要對反應(yīng)區(qū)溫度進(jìn)行精密控制，該項考察的是儀器孵育系統(tǒng)的性能。使用溫度測量儀對8個型號的儀器進(jìn)行了溫度采集，溫度控制準(zhǔn)確度和波動度結(jié)果見表1?？梢钥闯?，溫度控制正確度均在(37±0.5) ℃，波動度均不超過0.5 ℃。參考全自動生化分析儀行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[11]，全自動生化分析儀溫度控制正確度要求不超過0.3 ℃，波動度不超過0.2 ℃。免疫反應(yīng)對溫度要求沒有生化反應(yīng)嚴(yán)苛，溫度控制正確度不超過0.5 ℃、波動度不超過0.5 ℃應(yīng)能滿足臨床要求，因此初步判定這8款全自動發(fā)光免疫分析儀溫度控制合格。

表1全自動發(fā)光免疫分析儀反應(yīng)區(qū)溫度控制結(jié)果

Tab.1 Testing result of temperature control of automatic luminescence immunoassay analyzers

儀器序號溫度控制正確度/℃溫度控制波動度/℃10.300.1420.430.163-0.050.044-0.030.0550.500.0060.300.1070.000.4080.370.20

注：表中儀器序號與條款2.1不對應(yīng)，也與下面各表不對應(yīng)。下表同。

4.2 加樣正確度與精密度

全自動儀器的樣本處理、試劑處理均為批量化操作，加樣模塊的精確設(shè)計和加工制造對于提高操作效率、加強實驗精度非常關(guān)鍵。經(jīng)調(diào)查，由于市面上各型號儀器的試劑針、樣品針的加樣量程差別很大，無法設(shè)定統(tǒng)一的加樣考核點，因此本研究對儀器標(biāo)稱的樣品最小加注量和最大加注量、試劑最小加注量和最大加注量都進(jìn)行了測試。

采用稱量法對27個型號的加樣模塊進(jìn)行了測試，結(jié)果見表2。表2可印證，各型號儀器的樣品針和試劑針加樣量程差別大，樣品針最小加注量從5 μL到40 μL，最大加注量從20 μL到300 μL，試劑針最小加注量從5 μL到50 μL，最大加注量從47 μL到450 μL。無論是樣品針還是試劑針，當(dāng)加注量>10 μL時，大部分儀器能滿足偏倚不超過10%，CV不超過3%；當(dāng)加注量>50 μL時，大部分儀器能滿足偏倚不超過5%，CV不超過2%。從表2可看出，加樣量越小，偏倚和CV越大，這是因為加樣量越小，對儀器要求越高，技術(shù)實現(xiàn)難度越大。綜合起來，建議7號、15號、22號、27號儀器應(yīng)對加注裝置進(jìn)一步改進(jìn)，以達(dá)到其聲稱的加樣量要求。

表2 全自動發(fā)光免疫分析儀加樣模塊測試結(jié)果

由于全自動發(fā)光免疫分析儀為全封閉儀器，在采用稱量法測試加樣模塊精度時，有的儀器不能實現(xiàn)儀器開蓋、加純水作為待測樣品或試劑、中斷加樣操作等干預(yù)步驟，實施稱量法較為困難。在此情況下，本研究開發(fā)了第二種方法即比色法。比色法的原理是色素溶液的稀釋比例與吸光度成線性關(guān)系。本研究采用橙黃G色素液，將其作為樣品或試劑，控制儀器按設(shè)置的加注量加注到反應(yīng)杯中，然后將杯中橙黃G全部回收，在分光光度計波長478 nm下測試其吸光度，與理論吸光度進(jìn)行比較，通過計算，得出儀器加樣的精度。與稱量法相比，色素法操作相對繁瑣，但其具有受環(huán)境影響小的優(yōu)點，尤其適用于加注量小的情況。

4.3 光檢測裝置部分

4.3.1 儀器噪聲

儀器噪聲大小直接關(guān)系到儀器的檢測靈敏度，噪聲越大，檢測的靈敏度就越低。免疫檢測為超微量分析，因此要求儀器的噪聲越小越好。表3為檢測器噪聲檢測結(jié)果，結(jié)果顯示，化學(xué)發(fā)光儀、電化學(xué)發(fā)光儀、熒光免疫儀檢測的發(fā)光信號是不同的，并且發(fā)光強度是一個相對值，儀器可以進(jìn)行調(diào)整。各個廠家對儀器噪聲規(guī)定值不同，實際測試值也不同，但均能滿足各自規(guī)定。

表3全自動發(fā)光免疫分析儀噪聲測試結(jié)果

Tab.3 Testing result of noise of automatic luminescence immunoassay analyzers

儀器序號測量單位企業(yè)規(guī)定測試結(jié)果噪聲1相對光子強度(Relative light unit,RLU)3001502RLU6001143RLU1 5004054RLU1 0003325RLU500996RLU100317Counts4503008RLU300329RLU60015010RLU1 50029211RFV500438

4.3.2 發(fā)光值的線性

發(fā)光值的線性大小直接反映儀器的測量范圍。由于儀器原理、結(jié)構(gòu)、操作可行性等因素，本研究對發(fā)光值線性的測試采用了2種方法，參考光源法和發(fā)光劑法。

目前，發(fā)光儀所使用的參考光源大多采用發(fā)光二級管(LED)，通過調(diào)節(jié)LED驅(qū)動電流的DA值，可獲得不同光強的光。參考光源在制作、標(biāo)定上有一定技術(shù)難度，所以采用參考光源進(jìn)行發(fā)光儀光學(xué)系統(tǒng)檢測的廠家還較少[12]。大多數(shù)廠家采用發(fā)光劑法[13]。發(fā)光劑分為酶促和非酶促兩種，酶促發(fā)光劑由游離酶液(如堿性磷酸酶)和底物液組成，不同體積量的游離酶液與固定體積量的底物液充分混合后，將會發(fā)出不同強度的光強。非酶促發(fā)光劑主要成分為發(fā)光標(biāo)記物(如異魯米諾)和緩沖液。使用時，用稀釋液將酶液或標(biāo)記物稀釋成不同濃度梯度，再與底物液混合，發(fā)出不同強度的光強，用來測試發(fā)光儀的性能。

發(fā)光值線性測試，共測試了11個不同型號的儀器，其中1個型號的儀器采用參考光源進(jìn)行測試，8個型號的儀器采用發(fā)光劑進(jìn)行測試，還有2個型號的儀器同時采用兩種方法進(jìn)行測試，結(jié)果見表4。從表中可以看出，儀器的線性范圍均不小于3個發(fā)光值數(shù)量級，有的甚至達(dá)到6個數(shù)量級，線性相關(guān)系數(shù)都達(dá)到0.99以上。2個型號的儀器同時采用兩種方法進(jìn)行測試，結(jié)果接近，基本說明兩者方法是等效的。

表4全自動發(fā)光免疫分析儀發(fā)光值線性結(jié)果

Tab.4 Testing result of luminescence linear of automatic luminescence immunoassay analyzers

儀器序號測試方法線性范圍(RLU)r1參考光源法103～1060.999 992發(fā)光劑法102～1050.999 9963發(fā)光劑法102～1050.9984發(fā)光劑法103～1050.999 65發(fā)光劑法102～1060.999 86發(fā)光劑法102～1050.999 97發(fā)光劑法102～1050.999 88發(fā)光劑法103～1060.999 19發(fā)光劑法103～1070.99810參考光源法103～1060.999 9發(fā)光劑法103～1060.997 511參考光源法102～1070.999 2發(fā)光劑法102～1070.999 2

4.3.3 發(fā)光值的精密度

對發(fā)光值的精密度測試，選取了接近廠家標(biāo)稱的測量范圍的上限和下限兩個點，具體結(jié)果見表5。測量范圍下限點的CV要高于測量范圍上限點的精密度，最大值達(dá)到3.8%。目前行業(yè)內(nèi)對發(fā)光儀檢測模塊的精密度要求是CV不超過3%，因此建議1號、3號儀器要進(jìn)一步改進(jìn)。

表5全自動發(fā)光免疫分析儀發(fā)光值精密度結(jié)果

Tab.5 Testing result of luminescence precision of automatic luminescence immunoassay analyzers

儀器序號測試方法測量范圍下限的精密度CV/%測量范圍上限的精密度CV/%1參考光源法3.10.22參考光源法2.90.13發(fā)光劑法3.80.54發(fā)光劑法1.71.35發(fā)光劑法2.41.66發(fā)光劑法1.41.27發(fā)光劑法2.40.68發(fā)光劑法1.30.59發(fā)光劑法1.00.510發(fā)光劑法1.61.511參考光源法0.80.05發(fā)光劑法0.80.7

4.3.4 發(fā)光值的穩(wěn)定性

對發(fā)光值的穩(wěn)定性測試，同樣選取了接近廠家標(biāo)稱的測量范圍上限和下限兩個點，具體結(jié)果見表6。測量范圍下限點的偏倚要高于測量范圍上限點的偏倚，最大值達(dá)到8.0%。目前行業(yè)內(nèi)對發(fā)光儀檢測模塊的穩(wěn)定性要求是偏倚不超過5%，因此建議1號、5號儀器要進(jìn)一步改進(jìn)。

4.4 攜帶污染

攜帶污染主要表現(xiàn)為不同濃度樣品間連續(xù)測試的相互影響，特別是含量高的樣品對含量低的樣品所產(chǎn)生的影響，考察的是儀器清洗系統(tǒng)的性能。本研究對6個不同型號的儀器進(jìn)行了攜帶污染測試，結(jié)果見表7。攜帶污染率差別較大，從0.8×10-6～54×10-6。對于部分線性范圍不太寬的項目，攜帶污染對檢測系統(tǒng)引入的總誤差貢獻(xiàn)很小，但是對于乙肝表面抗原(HBsAg)、HCG這類測量范圍較寬的項目，如果攜帶污染大，就很容易對低值的陰性樣品造成干擾，可能造成樣品檢測成假陽性[14]。本研究中將攜帶污染率設(shè)置為10×10-6，10×10-6可認(rèn)為是一個門檻，滿足該要求后95%的臨床檢測項目都可滿足臨床要求。按照該要求，建議5號、6號儀器要進(jìn)行進(jìn)一步改進(jìn)。

表6全自動發(fā)光免疫分析儀發(fā)光值穩(wěn)定性結(jié)果

Tab.6 Testing result of luminescence stability of automatic luminescence immunoassay analyzers

儀器序號測試方法測量范圍下限的穩(wěn)定性a/%測量范圍上限的穩(wěn)定性a/%1參考光源法6.70.42參考光源法1.2/3發(fā)光劑法 2.70.14發(fā)光劑法4.02.85發(fā)光劑法8.03.76發(fā)光劑法3.81.47發(fā)光劑法1.71.08發(fā)光劑法2.00.99發(fā)光劑法 /2.110發(fā)光劑法 2.70.911參考光源法1.50.1發(fā)光劑法1.41.2

表7全自動發(fā)光免疫分析儀攜帶污染結(jié)果

Tab.7 Testing result of carry-over of automatic luminescence immunoassay analyzers

儀器序號攜帶污染率K/10-610.8243645521654

5 討 論

全自動發(fā)光免疫分析儀的關(guān)鍵模塊包括加樣系統(tǒng)、孵育系統(tǒng)、清洗系統(tǒng)和檢測系統(tǒng)，本研究從全自動發(fā)光免疫分析儀的結(jié)構(gòu)和特點出發(fā)，建立了統(tǒng)一的評價方法。采用本研究建立的方法，完成了對市面上主流的15家生產(chǎn)企業(yè)生產(chǎn)的30個不同型號的全自動發(fā)光免疫分析儀的性能評價，基本證明了該方法的適用性和可操作性。本研究主要貢獻(xiàn)體現(xiàn)在：

(1)建立了全自動發(fā)光免疫分析儀可行的、統(tǒng)一的、標(biāo)準(zhǔn)化的評價方法。

本研究對加樣系統(tǒng)、孵育系統(tǒng)、清洗系統(tǒng)和檢測系統(tǒng)(噪聲、線性、精密度、穩(wěn)定性)分別建立了檢測方法，結(jié)合全自動發(fā)光免疫分析儀的特點，對加樣系統(tǒng)同時建立了稱量法和比色法兩種方法，對檢測系統(tǒng)同時建立了參考光源法和發(fā)光劑法兩種方法。本研究建立的檢測技術(shù)適用性強，能適用于化學(xué)發(fā)光、電化學(xué)發(fā)光、熒光免疫等不同發(fā)光原理的儀器，也適用于酶促發(fā)光和非酶促發(fā)光不同反應(yīng)類型的儀器。

(2)完成了對市面上主流的全自動發(fā)光免疫分析儀的摸底測試。

用本研究建立的方法，對市面上主流的15家生產(chǎn)企業(yè)生產(chǎn)的30個不同型號的全自動發(fā)光免疫分析儀進(jìn)行了性能評價，基本結(jié)論為：孵育系統(tǒng)，所有儀器均能滿足要求；加樣系統(tǒng)，少數(shù)儀器不能達(dá)到其聲稱的最小加注量；檢測系統(tǒng)，所有儀器均能滿足噪聲和線性要求，少數(shù)儀器不能達(dá)到精密度和穩(wěn)定性要求；清洗系統(tǒng)，某些儀器的攜帶污染率不能達(dá)到要求。數(shù)據(jù)顯示，全自動發(fā)光免疫分析儀還有一定的質(zhì)量提升空間。

(3)促進(jìn)企業(yè)開發(fā)參考光源、發(fā)光劑等檢測工裝。

本研究開展前，只有少數(shù)企業(yè)具備參考光源或發(fā)光劑。在建立全自動發(fā)光免疫分析儀檢測方法過程中，國內(nèi)外企業(yè)積極參與。通過對方法的反復(fù)討論和驗證，拓寬了思路，促使企業(yè)去開發(fā)檢測設(shè)備和工裝，特別是參考光源、發(fā)光劑等重要工裝的開發(fā)，解決了全自動發(fā)光免疫分析儀評價的核心技術(shù)障礙，從而也促進(jìn)了產(chǎn)品的質(zhì)量提升。

目前各廠家用參考光源和發(fā)光劑尚不能實現(xiàn)標(biāo)定和計量學(xué)溯源，因此本研究后續(xù)工作設(shè)想是與計量部門合作，開發(fā)參考光源和發(fā)光劑的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，從而進(jìn)一步完善發(fā)光免疫分析儀的檢測方法，促進(jìn)免疫診斷結(jié)果的溯源和量值準(zhǔn)確傳遞。