胡波 魏后軍 范志宇

摘要：為獲得可溶性表達(dá)的兔NF-κB p50蛋白，本研究對(duì)兔p50基因進(jìn)行大腸桿菌密碼子優(yōu)化及合成，并連接于原核表達(dá)載體pGEX-4T-1中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Origami B（DE3）菌株，經(jīng)異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)表達(dá)，獲得GST-p50融合蛋白。聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）結(jié)果顯示，GST-p50蛋白主要以可溶形式高效表達(dá)。經(jīng)谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶（GST）磁珠純化及蛋白免疫印跡（western blot）鑒定，所表達(dá)的GST-p50蛋白具有良好的反應(yīng)原性。研究結(jié)果為進(jìn)一步開展兔NF-κB互作蛋白及信號(hào)通路的研究奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：NF-κB;p50蛋白;原核表達(dá);鑒定;兔

中圖分類號(hào)： S858.291 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號(hào)：1002-1302（2019）22-0223-03

NF-κB家族是細(xì)胞中一類重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，包含RelA（p65）、RelB、C-Rel、NF-κB1（p50）和NF-κB2（p52）5個(gè)成員。該蛋白家族成員以同源或異源二聚體形式存在，包括p50同源二聚體、p65同源二聚體和p50/p65異源二聚體等，其中p50/p65異源二聚體是NF-κB最廣泛的形式[1]。NF-κB在免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖和凋亡中均發(fā)揮重要的調(diào)控作用[2-4]，對(duì)其的研究一直是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和免疫學(xué)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。

p50蛋白含有大小為24 ku的NF-κB同源結(jié)構(gòu)域Rel homology domain（RHD），具有DNA結(jié)合、二聚化及核轉(zhuǎn)位等功能，在NF-κB介導(dǎo)的調(diào)控作用中發(fā)揮重要作用[5]。研究發(fā)現(xiàn)，p50同源二聚體對(duì)機(jī)體的炎癥反應(yīng)有抑制作用，且HDAC1與p50的相互作用能抑制炎癥相關(guān)基因的表達(dá)[6]。此外，p50在腎細(xì)胞癌及膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中也發(fā)揮重要的調(diào)控作用，p50的缺失可降低腫瘤生長(zhǎng)并延長(zhǎng)生存期[7-9]。

兔作為一種重要的試驗(yàn)動(dòng)物，其NF-κB分子及其調(diào)控機(jī)制的研究尚未展開，在各種病理狀態(tài)下其NF-κB通路的激活/抑制及其關(guān)鍵分子的作用研究均缺乏相應(yīng)的基礎(chǔ)和手段。本研究通過表達(dá)NF-κB p50亞基，以期為研究兔NF-κB通路調(diào)控機(jī)制及在相關(guān)疾病中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒和菌株

序列優(yōu)化的NF-κB p50基因由南京金斯瑞生物科技有限公司合成并連接于pGEX-4T-1載體;E.coli Origami B（DE3）感受態(tài)細(xì)胞購自上海唯地生物技術(shù)有限公司。

1.2 主要試劑和工具酶

Blue Plus Ⅱ Protein Marker（蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，北京全式金生物技術(shù)有限公司）;SDS-PAGE凝膠快速配制試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）;兔抗人NF-κB p50蛋白多克隆抗體（南京善本生物科技有限公司）;酶標(biāo)山羊抗兔IgG（HRP-IgG）購自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司;GST磁珠購自南京金斯瑞生物科技有限公司;氯化鈉、磷酸氫二鈉、氯化鉀等試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 兔NF-κB p50蛋白的序列分析

以DNAStar軟件對(duì)p50蛋白序列進(jìn)行氨基酸比對(duì)及功能區(qū)分析，并采用Disulfind在線工具（http：//disulfind.dsi.unifi.it/）進(jìn)行二硫鍵預(yù)測(cè)及分析。

1.4 重組表達(dá)載體pGEX-4T-1-p50的獲得

采用OptimumGeneTM軟件對(duì)兔p50基因序列（GenBank No.XM017347386）進(jìn)行大腸桿菌密碼子優(yōu)化，優(yōu)化序列經(jīng)合成后連接至pGEX-4T-1載體中，獲得重組表達(dá)載體 pGEX-4T-1-p50。

1.5 GST-p50融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

將重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-p50轉(zhuǎn)化大腸桿菌Origami B（DE3）菌株，挑取單菌落接種到含氨芐青霉素（100 μg/mL）、卡那霉素（50 μg/mL）和四環(huán)素（20 μg/mL）的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)過夜，按1 ∶ 100體積比將培養(yǎng)物接種于含以上3種抗生素的新鮮LB液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至D600 nm值為0.6時(shí)，加入終濃度為0.5 mmol/L的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），16 ℃誘導(dǎo)表達(dá)過夜，12 000 r/min 離心收集菌體，磷酸鹽緩沖液（PBS）重懸后冰浴超聲破碎，分別收集上清和沉淀，進(jìn)行12% SDS-PAGE電泳分析。

1.6 GST-p50蛋白的純化及蛋白免疫印跡（western blot）鑒定

按“1.5”節(jié)的方法大量誘導(dǎo)表達(dá)GST-p50蛋白，經(jīng)超聲破碎后，12 000 r/min離心收集上清液，采用GST磁珠純化目的蛋白，具體操作按GST磁珠說明書進(jìn)行。將純化后的GST-p50蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，采用半干轉(zhuǎn)印法將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，以針對(duì)p50的多克隆抗體（1 ∶ 1 000 稀釋）為一抗，HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG（1 ∶ 5 000稀釋）為二抗進(jìn)行反應(yīng)，ECL（增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法）顯色觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 兔p50序列分析

以DNAStar軟件對(duì)p50序列進(jìn)行分析，結(jié)果表明，兔p50基因全長(zhǎng)1 299 bp，編碼432個(gè)氨基酸。參照已報(bào)道的人p50蛋白NTD、DD、Linker和Flexible region等區(qū)域劃分，通過氨基酸序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)兔p50蛋白同樣存在相同的功能區(qū)（圖1）。對(duì)兔p50基因編碼蛋白的進(jìn)一步分析顯示，兔p50蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量為47 404.83，等電點(diǎn)（pI）為7.46，序列中共含有7個(gè)半胱氨酸（Cys）。通過Disulfind在線工具進(jìn)行二硫鍵預(yù)測(cè)，結(jié)果表明，p50蛋白單體共可形成3對(duì)二硫鍵，分別位于NTD區(qū)和Linker區(qū)（表1）。

2.3 GST-p50蛋白的表達(dá)及純化

將重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-p50轉(zhuǎn)化E.coli Origami B（DE3）菌株，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，超聲破碎后，上清和沉淀的SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示，在約76 ku處有1條明顯的蛋白條帶，與預(yù)期大小一致（圖2），表明重組GST-p50蛋白主要以可溶形式表達(dá)。經(jīng)Image J軟件分析，上清中GST-p50蛋白量是包涵體的3.07倍（圖3）。

2.4 GST-p50蛋白的純化及鑒定

采用GST磁珠對(duì)表達(dá)上清中GST-p50蛋白進(jìn)行純化，SDS-PAGE電泳表明，獲得了純化的GST-p50蛋白，Western Blot鑒定結(jié)果顯示，所表達(dá)純化的融合蛋白能被p50抗體特異性識(shí)別（圖4），表明p50蛋白表達(dá)正確。

3 討論

獲得大量純化的蛋白質(zhì)是蛋白質(zhì)理化性質(zhì)和功能研究的基礎(chǔ)，迄今大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)由于其遺傳背景清楚、表達(dá)高效、經(jīng)濟(jì)方便等特點(diǎn)仍然是最常用的蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)。大腸桿菌表達(dá)外源蛋白可分為胞外分泌、周質(zhì)表達(dá)和胞質(zhì)表達(dá)3種形式。胞質(zhì)表達(dá)方式的蛋白質(zhì)表達(dá)量最高，但易形成無活性的包涵體，須經(jīng)過復(fù)雜的變性復(fù)性過程才能得到有活性的目的蛋白[10]，因此提高蛋白的可溶性表達(dá)是原核表達(dá)中須要重點(diǎn)考慮的因素之一。

已有研究表明，人源和豬源NF-κB p50蛋白質(zhì)在大腸桿菌中均以包涵體形式表達(dá)，須進(jìn)行變性、復(fù)性、純化等一系列處理才能用于后續(xù)研究[1，11]，且蛋白復(fù)性的效率并不高。目前普遍認(rèn)為包涵體的形成是因?yàn)槎蜴I錯(cuò)配導(dǎo)致錯(cuò)誤折疊的結(jié)果，且優(yōu)化密碼子、降低表達(dá)溫度、分子伴侶、融合表達(dá)可溶性多肽等方法是提高蛋白質(zhì)可溶性表達(dá)的主要策略[12-15]。因此本研究中，首先對(duì)p50蛋白質(zhì)序列及二硫鍵形成進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)p50序列含有7個(gè)半胱氨酸，其中6個(gè)可形成3對(duì)二硫鍵，分別位于NTD和Linker區(qū)域。這些二硫鍵在表達(dá)過程中能否正確折疊和配對(duì)可能對(duì)所表達(dá)的p50蛋白質(zhì)的可溶性及活性十分關(guān)鍵。因此本研究選擇了可高效促進(jìn)蛋白二硫鍵正確折疊的Origami B（DE3）大腸桿菌作為表達(dá)宿主菌。此外，優(yōu)化p50基因序列密碼子、采用GST融合表達(dá)載體及16 ℃低溫誘導(dǎo)等方法，成功表達(dá)了p50蛋白質(zhì)。經(jīng)分析，其可溶性蛋白表達(dá)量是包涵體的3倍以上，實(shí)現(xiàn)了p50蛋白質(zhì)的高效可溶表達(dá)，為后續(xù)p50相互作用蛋白質(zhì)及NF-κB信號(hào)通路的研究奠定了基礎(chǔ)。

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