季禾茗，孔德佳，莫蒙武，雷華軍，陳 露，趙瑞琪，王 威，何裕建，封祿田?，吳 麗?

(1 沈陽化工大學(xué)應(yīng)用化學(xué)學(xué)院， 沈陽 110142； 2 中國科學(xué)院大學(xué)化學(xué)科學(xué)學(xué)院， 北京 100049； 3 江西科技師范大學(xué)藥學(xué)院， 南昌 330013)(2017年11月17日收稿； 2018年3月6日收修改稿)

人工操縱特定的生命過程或基因功能一直是生命科學(xué)的前沿研究方向[1-3]。以往的報(bào)道是利用小分子抑制劑來抑制特定酶的活性從而調(diào)控生命過程，即在生命體中引入外源小分子，但外源小分子在一進(jìn)入生命體后就會立即開始發(fā)揮作用，因此很難在時(shí)間和空間上實(shí)現(xiàn)選擇性調(diào)控[4]。近些年來，科研工作者曾嘗試多種方法以實(shí)現(xiàn)對生命過程的多維度調(diào)控，例如改變溫度、改變pH、改變電場、施加磁場、給予光照等。與傳統(tǒng)的外界刺激相比，光作為刺激手段具有獨(dú)特的優(yōu)勢[5]。首先光是一種清潔的、非入侵式的外界刺激，已廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的光學(xué)照明和熒光成像。其次，光可以精確地從時(shí)間和空間上進(jìn)行宏觀調(diào)控，在光敏物質(zhì)抵達(dá)特定位置后，通過特定波長的光照控制藥物的釋放。最后，光控釋放的效率較高，特定波長的光可激發(fā)某些功能基團(tuán)并發(fā)生各種光化學(xué)反應(yīng)(化學(xué)鍵的斷裂和異構(gòu)化等)。

使用光反應(yīng)變色分子調(diào)控生物過程具有極好的發(fā)展?jié)摿Γ诨瘜W(xué)生物學(xué)、藥物研究和醫(yī)學(xué)具有深遠(yuǎn)的意義。我們和其他研究組曾使用光籠的化合物修飾的核酸，實(shí)現(xiàn)生物體內(nèi)基因表達(dá)的光控制[6-9]。但是這種方法只能單次地增加或降低核酸的活性，不能可逆地控制核酸的功能。偶氮苯是光異構(gòu)化分子的典型代表[10-11]， 化學(xué)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，光照后異構(gòu)化迅速。母體的反式構(gòu)型(trans)幾乎是平面結(jié)構(gòu)且熱力學(xué)相對穩(wěn)定，紫外光(UV<366 nm)照后形成穩(wěn)定性較低的具有彎曲構(gòu)象的順式形態(tài)(cis)，而在可見光(>400 nm)光照刺激下又可實(shí)現(xiàn)cis構(gòu)象向trans構(gòu)象的轉(zhuǎn)變[12-14]?；谶@一特性，偶氮苯類化合物近年來被廣泛地應(yīng)用在各種材料領(lǐng)域，例如，光控DNA自組裝[15-16]、光制動納米機(jī)械[17]、納米藥物輸送材料[18]等。

近年來，隨著偶氮類化合物光控DNA動力學(xué)的基礎(chǔ)研究得到迅速的發(fā)展[19-21]，進(jìn)一步增加了人們使用這一工具調(diào)控功能生物大分子(核酸和蛋白質(zhì))的信心[22-23]。這種光響應(yīng)分子通常被引入到核酸不同的結(jié)構(gòu)位置上，例如，磷酸骨架、堿基和核糖體部分等，改變核酸的結(jié)構(gòu)和結(jié)合性能，從而將其應(yīng)用于光開關(guān)RNA沉默、基因轉(zhuǎn)錄的可逆控制、適配體的可逆識別、核糖核酸酶的可逆控制等[24-28]。

新穎的或改進(jìn)的偶氮苯衍生物的設(shè)計(jì)對于核酸的化學(xué)修飾也是許多化學(xué)工作者爭相研究的熱點(diǎn)[29-30]。在前期研究中，我們已經(jīng)設(shè)計(jì)合成4，4′-二羥甲基偶氮苯的發(fā)夾DNA開關(guān)，發(fā)現(xiàn)4，4′-二羥甲基偶氮苯的光異構(gòu)化使得發(fā)夾DNA的穩(wěn)定性發(fā)生巨大改變(ΔTm=24 ℃)[31-32]，并將其置于反義核酸的兩端形成啞鈴型核酸，成功地光控制靶向RNA在RNase H酶作用的降解[33]。從時(shí)間和空間上光控制復(fù)制[34-36]、轉(zhuǎn)錄[37-38]和翻譯[3, 33, 39-40]過程使得核酸工具分子的發(fā)展越來越引起人們的關(guān)注。這里，我們研究DNA引物延伸相關(guān)的聚合酶鏈反應(yīng)的光調(diào)控。聚合酶鏈反應(yīng)用于特定DNA序列的試管分離和指數(shù)擴(kuò)增，引物和模板能否形成適當(dāng)穩(wěn)定的雙鏈?zhǔn)欠磻?yīng)的關(guān)鍵因素。如示意圖1，我們在DNA模板與引物的結(jié)合區(qū)通過4，4′-二羥甲基偶氮苯的連接加入一段保護(hù)鏈，由于反式的偶氮苯與鄰近的堿基對之間堆積作用，DNA模板自身形成穩(wěn)定的發(fā)夾結(jié)構(gòu)而使得其與引物不能夠互補(bǔ)結(jié)合，從而引物延伸不能發(fā)生。反之，通過紫外光照偶氮苯分子從反式轉(zhuǎn)變?yōu)轫樖?，這種異構(gòu)化作用所產(chǎn)生的扭轉(zhuǎn)力使得DNA模板的保護(hù)鏈離去，從而DNA模板可以結(jié)合引物，在聚合酶的作用下能夠使得引物延伸進(jìn)行。對比骨架楔入型偶氮苯的設(shè)計(jì)[34]，通過偶氮苯共價(jià)鍵連接模板的保護(hù)鏈具有可逆性，并且單一位點(diǎn)的修飾不影響正常的生理活動?？紤]到發(fā)夾DNA的模板與引物和莖短鏈之間存在結(jié)合的競爭，我們使用25 mer長度的DNA模板和不同長度的保護(hù)鏈組成的發(fā)夾DNA，通過篩選發(fā)夾DNA的長度分別為5、6、7和8個堿基長度的保護(hù)鏈，以及長度為12，15和17 mer的引物，發(fā)現(xiàn)能夠高效調(diào)控引物延伸的發(fā)夾DNA和引物組合，為從時(shí)間和空間上動力學(xué)控制生理?xiàng)l件下生物活性分子提供非常有用的工具，也將為分子水平上研究基因功能、基因表達(dá)網(wǎng)絡(luò)以及疾病的發(fā)生和發(fā)展提供一種新的策略和研究手段。

圖1 偶氮苯亞磷酰胺單體的合成Fig.1 Synthetic procedure of azobenzene phosphoramidite

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)所用的藥品是分析純。所有溶液用超純水配制。對硝基苯甲醇，4，4′-二甲氧基三苯基氯甲烷，四氮唑，雙(二異丙基氨基)(2-氰基乙氧基)膦均購自偶合公司；鋅粉，冰醋酸，四氫呋喃購自Macklin公司；色譜級乙腈購自阿拉丁公司；4種脫氧核苷購自蕪湖華仁科技有限公司。引物訂購自生工公司；DNA聚合酶訂購自NEB。

1.2 主要儀器設(shè)備

儀器使用AVANCE的III型400 M核磁共振儀；Applied Biosystems的ABI 394型DNA合成儀；安捷倫1260高效液相色譜系統(tǒng)；島津UV1800紫外分光光度計(jì)和BIO-RAD的ChemiDoc XRS高靈敏化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)。

1.3 偶氮苯衍生物的合成

1.3.1 合成4，4′-二羥甲基偶氮苯

參考前期的工作[31]。稱取6.0 g(26 mmol)對硝基苯甲醇，配制并加入70 mL(5.7 mol/L)的氫氧化鈉水溶液，升溫至100 ℃，再緩慢投入7.0 g(100 mmol)鋅粉，回流攪拌1 h，過濾得到橙色濾渣。再用甲醇溶解濾渣，在空氣下加熱至回流反應(yīng)8 h。最后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去甲醇，得到3.4 g橙色固體，收率為56.6%。

1.3.2 合成4-羥甲基-4′-羥甲基-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-偶氮苯

稱取4，4′-二羥甲基偶氮苯1.5 g(6.5 mmol)溶解在40 mL無水四氫呋喃中，分3批次，按每次投料間隔3 h的方法共加入4，4′-二甲氧基三苯基氯甲烷(DMT-Cl)2.1 g(6.5 mmol)，反應(yīng)全程通氮?dú)獗Ｗo(hù)，TLC板監(jiān)測進(jìn)程。最后得到原料，DMT一取代，DMT二取代的混合粗產(chǎn)品。濕法上樣過柱層析分離，最后得到4-羥甲基-4′羥甲基-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-偶氮苯2.0 g，收率為55.5%。

1.3.3 合成4-羥甲基-(β-氰乙基-N,N′-二異丙基亞磷酰胺)-4′-羥甲基-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-偶氮苯

稱取上一步得到的產(chǎn)物0.160 g(0.290 mmol)，加入四氮唑0.021 g(0.30 mmol)，干燥過夜。抽真空后氮?dú)獗Ｗo(hù)，加入磷試劑0.120 g，最后用針筒打入2 mL重蒸后的乙腈使產(chǎn)物的濃度為0.15 mmol/mL左右，隨后冰浴下攪拌反應(yīng)30 min，TLC板監(jiān)測，反應(yīng)完成后，用0.22 μm有機(jī)系濾膜過濾，待下一步DNA合成使用。

1.4 偶氮苯衍生物修飾DNA的固相合成

用DNA固相合成儀按照常規(guī)合成的方法經(jīng)過脫DMT、ETT活化、偶聯(lián)、蓋帽，氧化的步驟將DNA核苷亞磷酰胺單體由3’端向5’端連接到固相。其中普通DNA單體的偶聯(lián)時(shí)間為120 s，偶氮苯衍生物單體的偶聯(lián)時(shí)間增加到600 s。直到所有的亞磷酰胺單體依次偶聯(lián)到CPG的寡聚核酸上，即可得到目標(biāo)序列的固相。

1.5 純化偶氮苯衍生物修飾的DNA

將得到的固相加入1 mL的濃氨水，50 ℃下氨解8 h后離心，取上清液濃縮后過濾，HPLC提純制備。液相色譜條件：紫外檢測波長260 nm，流動性A為TEAA，B為乙腈；梯度洗脫程序：0～40 min，0～40% B；40～45 min，40%～100% B；45～50 min，100% B；50～55 min，100%～0 B；55～60 min，0 B；流速1.0 mL/min；柱溫：40 ℃。最后取得目標(biāo)峰溶液加乙酸做脫DMT處理，濃縮旋干后加25 μL NaCl溶液(3 mol/L)，渦旋溶解，最后加入1 mL無水乙醇溶液。置于-20 ℃冰箱過夜，然后離心(1 000～13 000 rpm)，固體保存標(biāo)記，上清液移至另外的EP管中，取400 pmol DNA的量做ESI-MS質(zhì)譜鑒定。

1.6 偶氮苯修飾DNA的光異構(gòu)化

將C1到C4序列溶解在1×PBS中配成2.5 μmol/L的溶液，退火后轉(zhuǎn)移至石英比色皿先用紫外燈(365 nm, 7mW/cm2,反式到順式)照射，用島津UV 1800紫外分光光度計(jì)每間隔20 s測一次吸光度，120 s后再用白光燈(>400 nm，11 W，順式到反式)照射，每間隔20 s測一次吸光度，記錄并用軟件Origin 8.0作圖分析。

1.7 Tm值測定

將樣品溶解在1×PBS樣品溶解標(biāo)準(zhǔn)緩沖液中退火后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，測定梯度溫度下的260 nm紫外吸收(Beckman DU 800 Nucleic Acid/Protein Analyzer程序升溫1 ℃/min)得到熔解曲線，根據(jù)dA/dT作圖得知Tm值。同樣，我們將樣品紫外光照光照10 min(365 nm，11 mW/cm2)再測定熔解溫度曲線。記錄并用軟件Origin 8.0作圖分析。

1.8 修飾后的DNA引導(dǎo)引物延伸

將引物和模板等比例的溶解于2 μL 10×Thermopol反應(yīng)溶液(20 mmol/L Tris-HCl, 10 mmol/L KCl, 10 mmol/L (NH4)2SO4, 2 mmol/L MgSO4, pH 8.8)中，再加入過量的dNTP，95 ℃下高溫退火5 min，降溫至室溫后，進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)，一組不光照，一組用紫外燈(365 nm)照射5 min，然后在黑暗條件下分別孵育10 min使引物和模板鏈充分結(jié)合。最后均加入1 U的DNA聚合酶37 ℃下分別孵育1 h。終反應(yīng)體積為20 μL。通過20%的變性聚丙烯酰胺凝膠在150 V電壓條件下電泳2 h，最后應(yīng)用化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行表征，條帶分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 偶氮苯修飾DNA的合成

參照我們以前的報(bào)道[33]，以對硝基苯甲醇為原料，在濃NaOH水溶液中，Zn作催化劑合成4，4′-二羥甲基偶氮苯。偶氮苯一端羥基與4，4′-二甲氧基三苯基氯甲烷(DMT-Cl)反應(yīng)進(jìn)行保護(hù)，另一端羥基與2-氰乙基-N，N，N′，N′-四異丙基亞磷酰二胺(磷試劑)反應(yīng)合成偶氮苯的亞磷酰胺單體(圖1)。值得注意的是最后一步與磷試劑反應(yīng)，偶氮苯衍生物的投料比例較少有利于DNA的偶聯(lián)，否則可能剩余部分的磷試劑首先與固相上裸露的羥基反應(yīng)，從而導(dǎo)致偶氮苯偶聯(lián)效率下降。這里，直接以重蒸的乙腈為溶劑，4，4′-二羥甲基偶氮苯: 四氮唑: 磷試劑的投料比例為1∶0.8∶0.8，通過薄層層析硅膠色譜監(jiān)控偶氮苯原料不再減少，反應(yīng)30 min以上，使得磷試劑反應(yīng)完全，然后將反應(yīng)液過濾，待用于DNA偶聯(lián)。

偶氮苯修飾DNA合成使用ABI 394 DNA合成儀按照常規(guī)的亞磷酰胺固相合成的方法進(jìn)行。在偶聯(lián)偶氮苯的亞磷酰胺單體時(shí)，將DNA核苷亞磷酰胺單體偶聯(lián)時(shí)間從通常的120 s增加到1 200 s，偶聯(lián)效率幾乎與標(biāo)準(zhǔn)的DNA亞磷酰胺單體相當(dāng)。取下裝有固載相的柱子，再用濃氨水將寡核苷酸從固相上切除并脫保護(hù)，最后進(jìn)行HPLC分離。制備提純后的樣品進(jìn)行ESI-MS質(zhì)譜鑒定，結(jié)果如表1，其實(shí)際測得的分子量和理論值相符。

表1 偶氮苯修飾的DNA的ESI-MS鑒定Table 1 ESI-MS spectra of azobenzene linked DNA

2.2 偶氮苯修飾DNA的光異構(gòu)化

將偶氮苯修飾的DNA(C1、C2、C3和C4)溶解在1×PBS中配成2.5 μmol/L的溶液，95 ℃下退火形成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。反式是偶氮苯的熱穩(wěn)定形式，其紫外光譜在335 nm (π-π*)處呈現(xiàn)明顯的肩峰。對于C1溶液，通過365 nm紫外燈照，可以明顯觀察到335 nm處的峰強(qiáng)隨著光照時(shí)間增加而降低，直到照射80 s，此肩峰基本消失，而430 nm(n-π*)處的峰強(qiáng)略有升高(圖2(a))。此外，再用白光光照，335 nm處的峰強(qiáng)隨著光照時(shí)間增加而增強(qiáng)，430 nm處峰強(qiáng)略有下降(圖2(b))。同樣，C2、C3和C4的溶液通過紫外和可見光照均呈現(xiàn)335 nm和430 nm處峰強(qiáng)的類似變化(圖2(c)、2(d)，圖2(e)、2(f)和圖2(g)、2(h))。說明偶氮苯被修飾到設(shè)計(jì)的寡核苷酸中，并且能起到光異構(gòu)化的作用。此外，260 nm是核酸的特征吸收峰，在DNA變性時(shí)吸光度升高表現(xiàn)出增色效應(yīng)，說明偶氮苯光異構(gòu)化可能影響DNA雙鏈的結(jié)構(gòu)，將進(jìn)一步通過進(jìn)行熱力學(xué)穩(wěn)定性的研究加以佐證。

圖2 偶氮苯修飾的DNA在不同時(shí)間的紫外和可見光照下紫外光譜的變化Fig.2 UV/Vis absorbance spectra of the C1, C2, C3, and C4 forms of azobenzene linked DNA before and after light illumination

2.3 偶氮苯修飾DNA的熱力學(xué)穩(wěn)定性

我們前期研究[29,31]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)4，4′-羥甲基偶氮苯代替4、5和6個堿基對的發(fā)夾DNA的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，偶氮苯的光異構(gòu)化能夠使得發(fā)夾DNA的穩(wěn)定性發(fā)生巨大改變(ΔTm=24 ℃)。這里進(jìn)一步研究不改變發(fā)夾DNA的環(huán)狀結(jié)構(gòu)上4，4′-羥甲基偶氮苯，僅僅增加一邊莖堿基數(shù)目，偶氮苯的光異構(gòu)化是否仍然可能開關(guān)發(fā)夾DNA的穩(wěn)定性。圖3展示紫外光照前后C1、C2、C3和C4的熔點(diǎn)曲線，很明顯發(fā)現(xiàn)C1和C2光照前后的熔鏈曲線有著較大差異(圖3(a)和3(b))，熔點(diǎn)溫度分別從光照前60.2和67.7 ℃，光照后降低到49.8和53.5 ℃，它們?nèi)埸c(diǎn)溫度的變化分別為10.4和14.2 ℃(表2)。這主要因?yàn)榕嫉降漠悩?gòu)化影響其與鄰位堿基之間堆積作用以及鄰位堿基對的氫鍵作用，導(dǎo)致寡聚核酸的穩(wěn)定性降低。尤其是C2，具有6個堿基對，紫外光照后的穩(wěn)定性降低(ΔTm=14.2 ℃)最多。然而，隨著莖堿基數(shù)目的增多，偶氮修飾的DNA通過紫外光照后的穩(wěn)定性降低的程度變小，C3的ΔTm僅是6.9 ℃而莖堿基數(shù)目增加到8個堿基對(C4)時(shí)光照后的Tm值幾乎沒有變化。這可能是偶氮苯兩端互補(bǔ)配對的序列太長(≥8 bp)，偶氮苯異構(gòu)化所產(chǎn)生的扭轉(zhuǎn)力不足以影響雙鏈的結(jié)合。

圖3 偶氮苯修飾的DNA光照前后的熔點(diǎn)曲線Fig.3 Typical melting curves of the C1, C2, C3, and C4 forms of azobenzene linked DNA before and after UV irradiation

DNATm/℃- UV+UVΔTm/℃C160.249.810.4C267.753.514.2C370.263.36.9C474.473.80.6

2.4 偶氮苯修飾DNA與引物結(jié)合的光控制

引物延伸的基本原則之一是引物與模板序列要緊密互補(bǔ)結(jié)合，因而偶氮苯修飾的DNA作為模板能否和引物形成適當(dāng)穩(wěn)定的雙鏈?zhǔn)且镅由斓年P(guān)鍵因素。在偶氮苯修飾的DNA中較長的莖堿基鏈原則上與引物互補(bǔ)結(jié)合，但是短鏈與長鏈形成的莖堿基對的穩(wěn)定性可能影響長莖堿基鏈與引物的結(jié)合，而偶氮苯異構(gòu)化可能影響莖堿基對的穩(wěn)定性。因此，考慮到發(fā)夾DNA的長鏈莖與引物和短鏈莖之間存在結(jié)合的競爭，我們通過篩選發(fā)夾DNA的短鏈長度分別為5、6、7和8個堿基長度的C1、C2、C3和C4，以及長度為12 mer(Pri.12)，15 mer(Pri.15)和17 mer(Pri.17)的引物，評價(jià)偶氮苯修飾的DNA與引物結(jié)合的光調(diào)控。

圖4(a)顯示Pri.12和模板序列光照前后都沒有很好的結(jié)合，可能因?yàn)楸旧硪镦溇捅容^短，模板鏈自身能形成雙鏈結(jié)構(gòu)的部分較引物長，即使是偶氮苯在順式形態(tài)下，影響模板的雙鏈結(jié)構(gòu)，但C1、C2、C3，C4模板單鏈部分和引物能互補(bǔ)配對的長度為7、6、5和4 bp，仍然是不穩(wěn)定結(jié)合，所以在凝膠電泳上無法看到Pri.12和模板的結(jié)合。當(dāng)Pri.15和C1、C2、C3，C4模板單鏈部分能互補(bǔ)配對的長度增加為10、9、8和7 bp，引物依舊無法很好的參與模板鏈自身形成的雙鏈結(jié)構(gòu)進(jìn)行競爭。圖4(b)顯示Pri.15和C1只有微弱的結(jié)合，而其和C2、C3、C4都不穩(wěn)定結(jié)合。不同的是當(dāng)Pri.17和C1、C2、C3，C4模板單鏈部分能互補(bǔ)配對的長度增加為12、11、10和9 bp時(shí)，C1和Pri.17可以形成較為穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)，這意味引物和模板長鏈部分互補(bǔ)配對的長度為12 bp時(shí)，引物和模板能夠有相對穩(wěn)定的結(jié)合，而光照前后這種結(jié)合力的變化不是很明顯。正如所期望的，C2和Pri.17孵育后在光照前幾乎沒有結(jié)合，而在光照后它們有明顯的結(jié)合條帶，結(jié)合部分增加7%左右。由于保護(hù)鏈的增長，C3、C4和Pri.17在光照前后變化也不太明顯。

圖4 偶氮苯修飾的DNA和引物結(jié)合的光調(diào)控Fig.4 Photoregulation of the binding of azobenzene linked DNA with the primer

2.5 偶氮苯修飾的DNA指導(dǎo)引物延伸的光調(diào)控

反式是偶氮苯的熱穩(wěn)定形式，起到穩(wěn)定模板鏈自身雙鏈結(jié)構(gòu)的作用，所以引物鏈不能很好與模板鏈緊密結(jié)合，降低了引物的延伸產(chǎn)率。當(dāng)受外界的紫外光刺激時(shí)，偶氮苯能在比較短的時(shí)間發(fā)生異構(gòu)化轉(zhuǎn)變?yōu)轫樖浇Y(jié)構(gòu)，破壞模板鏈自身雙鏈的堿基堆疊與配對作用，導(dǎo)致雙鏈不穩(wěn)定，結(jié)合力降低。同時(shí)引物與模板鏈不僅存在著配對關(guān)系，還會與模板的莖短鏈存在著競爭配對，從而徹底打開模板自身的雙鏈結(jié)構(gòu)，引物和模板緊密結(jié)合，進(jìn)行DNA的復(fù)制。雖然影響引物延伸的因素有很多，但是我們主要從DNA模板、不同長度的引物和不同的酶這三方面來研究并篩選光控引物延伸最佳效率的條件。

由圖5可見，膠圖中最下方的條帶為起始引物條帶，最上面的條帶為延伸全長產(chǎn)物，中間的片段為反應(yīng)過程中未完全延伸的產(chǎn)物。在以Pri.12作為引物時(shí)，其與C1、C2、C3和C4配對區(qū)的堿基對分別為7、6、5和4 bp。由圖5(a)和6(a)可知，C1作為模板，紫外光照前，在Taq、Vent、Deep Vent酶的作用下引物延伸產(chǎn)率分別為37.5%，26.7%和31.7%，而紫外光照后，引物延伸產(chǎn)率存在不同程度增加(48.6%，40.7%和37.2%)。與C1相比，C2和C3，模板鏈的保護(hù)短鏈分別從5個堿基增加到6和7個堿基，與引物配對的堿基對也相應(yīng)從7 bp減少到6和5 bp，引物延伸的效率通常有所下降。且它們自身經(jīng)紫外光照后，引物延伸產(chǎn)率比光照前也存在不同程度增加。這是因?yàn)殡S著模板鏈自身的雙鏈長度增加，配對區(qū)長度逐漸減短，結(jié)合力變?nèi)酰镌诟偁幬恢弥饾u處在劣勢，大大降低了模板和引物的結(jié)合，所以延伸的產(chǎn)率逐漸減少。C1、C2和C3光照前后指導(dǎo)的引物延伸都有5%～15%的差異，正如我們所預(yù)期的，偶氮苯的順式形態(tài)影響了模板自身雙鏈的穩(wěn)定性，通過配對區(qū)的結(jié)合，引物“擠走”競爭區(qū)的干擾堿基從而自身參與模板鏈的結(jié)合，從而增加延伸效率。而C4光照前后引物的延伸幾乎都不明顯，這也與光照前后Tm值無明顯變化的結(jié)果相一致，偶氮苯開關(guān)不足以使得12 mer引物對8 bp長度的莖堿基對有所影響。

在以Pri.15作為引物時(shí)，其與C1、C2、C3和C4配對區(qū)的堿基對增加為10、9、8和7 bp，因而較Pri.12表現(xiàn)出更強(qiáng)的結(jié)合力，提高了“擠走”競爭區(qū)模板端位短鏈的可能性。圖5(b)和6(b)顯示，Pri.15作為引物表現(xiàn)出比Pri.12更多量的聚合物鏈反應(yīng)產(chǎn)物。此外，光照前后引物延伸效率差異比較明顯，其中C3，在Vent酶作用下引物延伸效率僅為28.4%，而紫外光照后引物延伸效率達(dá)到57.8%，光照前后的PCR產(chǎn)率增加超過1倍。在Deep Vent酶的作用下C3光照前后指導(dǎo)的PCR產(chǎn)率也增加73%。C2在Vent作用下光照后指導(dǎo)的PCR產(chǎn)率很高(91.8%)，但光照前指導(dǎo)PCR反應(yīng)產(chǎn)率也較高(63.1%)，因而光照前后的產(chǎn)率也表現(xiàn)出差異，僅為28.7%。對于C4，不管是光照前還是光照后，其指導(dǎo)的引物延伸產(chǎn)率都比較低，偶氮苯開關(guān)仍不足以使得15 mer引物對8 bp長度的莖堿基對有所影響。

在以Pri.17作為引物時(shí)，其與C1、C2、C3和C4配對區(qū)的堿基對增加為12、11、10和9 bp，因而較Pri.12和Pri.15表現(xiàn)出更強(qiáng)的結(jié)合力，“擠走”競爭區(qū)模板端位短鏈的可能性更大。圖5(c)和圖6(c)均顯示，C1光照前引物延伸的效率已經(jīng)很大(83.2%以上)，紫外光照后引物延伸的效率96.0%以上，由于光照前的背景較高，所以光照前后PCR效率沒有明顯的變化。說明偶氮苯開關(guān)調(diào)控的影響不大，原因是配對區(qū)的雙鏈較長，即使是競爭區(qū)引物不能和模板鏈緊密結(jié)合，配對區(qū)也能夠指導(dǎo)引物繼續(xù)延伸。然而，C2，由于配對區(qū)的堿基對增加，紫外光照前降低了引物延伸效率的背景，Vent催化下延伸產(chǎn)率僅為49.6%，紫外光照射后的延伸產(chǎn)率達(dá)到91.4%，增加了84%。C3的調(diào)控比C2的調(diào)控略有不足，而C4受到偶氮苯自身調(diào)控能力和配對區(qū)結(jié)合力的限制延伸結(jié)果也不夠理想。

此外，使用同一種DNA模板，在不同酶的作用下，引物延伸的調(diào)控效果只有略微的區(qū)別，其中Vent酶表現(xiàn)略好的調(diào)控效果。更多的影響調(diào)控效果的是DNA模板和引物的組合，這是由于發(fā)夾DNA的模板與短保護(hù)鏈和引物之間存在結(jié)合的競爭。我們發(fā)現(xiàn)，具有7個保護(hù)堿基的C3對Pri.15及6個堿基短鏈的C2對Pri.17具有普遍較好的光調(diào)控延伸效果。其中C3，在Vent酶作用下紫外光照前后引物延伸效率增加超過1倍。而C2，由于引物長度增加，盡管紫外光照前增加了引物延伸的背景，但Vent催化下紫外光照射后的延伸產(chǎn)率達(dá)到91.4%，也增加了84%，這也與DNA與引物的結(jié)合實(shí)驗(yàn)中光照前后具有不同的結(jié)合力相一致。

2.6 偶氮苯修飾的DNA指導(dǎo)引物延伸的可逆研究

為評價(jià)偶氮苯引入到核酸分子中對引物延伸的可逆調(diào)控，我們選擇C2序列與Pri.15在Vent酶作用下，通過紫外光和可見光交替照射來研究引物延伸的可逆行為。圖7(a)表示溶液退火后37 ℃下共孵育58 min，18和38 min分別用UV光和可見光照射2 min，每隔9 min取等量溶液電泳表征(光照時(shí)間除外)。線性結(jié)果如圖7(b)，前18 min反應(yīng)速率線性擬合為1.22，UV光照射后反應(yīng)加快，斜率為2.17，增加1.7倍，可見光照后反應(yīng)速率又下降到較低水平，僅為0.4。證明偶氮苯修飾的模板能夠可逆的控制引物延伸速率。

圖7 偶氮苯修飾的DNA(C2)指導(dǎo)引物延伸的可逆光調(diào)控Fig.7 Reversible photoregulation of primer extension using C2 with UV and visible light

3 結(jié)論

本文研究偶氮苯單元修飾在DNA模板上對引物延伸的光控制行為，篩選5、6、7和8個堿基的保護(hù)鏈通過4，4′-二羥甲基偶氮苯連接的25 mer DNA模板，在紫外光照前后調(diào)控的引物延伸效率。結(jié)果表明具有7個保護(hù)堿基的C3對Pri.15及6個堿基短鏈的C2對Pri.17具有普遍較好的光調(diào)控延伸效果，并且因聚合酶的改變而對引物的調(diào)控效果只有略微不同。因而我們斷定偶氮苯修飾的DNA模板對引物延伸的光控制行為的主要影響是因?yàn)榕嫉絾卧揎椖０逅纬傻母偁巺^(qū)和引物與模板形成的配對區(qū)之間的相互競爭。