黃 菊，李 攀，王志剛，韓曉霞，劉逢秋

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院超聲科 超聲分子影像重慶市重點實驗室，重慶 400010)

隨著精準(zhǔn)醫(yī)療和納米醫(yī)學(xué)的發(fā)展，診療一體化分子探針成為近年研究熱點。利用高分子聚合物包載顯像劑和藥物分子，能夠?qū)崿F(xiàn)影像學(xué)介導(dǎo)下的精準(zhǔn)治療，提高藥物的治療效果。光動力治療(photodynamic therapy， PDT)是近年來興起的一種新型治療方法，具有無創(chuàng)、低毒、高選擇性和重復(fù)性好等優(yōu)點，被用于抗腫瘤治療[1-2]。因激光穿透性較差，限制了PDT的應(yīng)用，使其主要用于治療表淺器官腫瘤，而對深部腫瘤無法達(dá)到治療效果，另外，臨床上所用的光敏劑在注入人體后必須避光處理，這在一定程度上給患者造成不便[3]。為克服PDT的不足，聲動力治療(sonodynamic therapy， SDT)應(yīng)運而生。超聲無創(chuàng)、操作性好、組織穿透性強，SDT將超聲波和聲敏劑結(jié)合，通過超聲空化作用、氧自由基產(chǎn)生氧化損傷等機制誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤增殖[4]，具有良好的應(yīng)用價值。本研究以聚乳酸-乙醇酸(PLGA)高分子化合物包載血卟啉單甲醚(hematoporphyrinmonomethyl ether， HMME)，探討其體外增強光聲顯像特性以及SDT效果，旨在制作一種光聲成像引導(dǎo)下的SDT分子探針，在真正意義上實現(xiàn)診療一體化。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料及儀器 主要材料：PLGA(PLGA-COOH聚合比50∶50，濟南岱罡生物科技有限公司)；聚乙烯醇(PVA，Sigma)；HMME(上海笛柏化學(xué)品技術(shù)有限公司)；2',7'-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA，Sigma)，鈣黃綠素/碘化丙啶(Calcein-AM/PI，Sigma公司)；吖啶橙(acridine orange, AO)染料(上海碧云天生物技術(shù)公司)；人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞(購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所)。

主要儀器：Sonics 630-0435聲振儀；DF-101磁力攪拌器(上海增森儀器科技有限公司)；Malvern Zetasizer Nano ZS90光粒徑測量儀； Hitachi S-3400N電子顯微鏡；島津UV2500 UV-VIS紫外可見光分光光度計；BD FACS Vantage SE 流式細(xì)胞儀；低強度聚焦超聲(low intensity focused ultrasound, LIFU)治療儀(重慶醫(yī)科大學(xué)超聲分子影像學(xué)研究所研制)；Lecia TCSSP2激光共聚焦顯微鏡；Visual Sonics Vevo?LAZR光聲成像系統(tǒng)。

1.2 包裹HMME的PLGA(HMME@PLGA)納米粒的制備 采用雙乳化法，將50 mg PLGA和2 mg HMME加入至2 ml二氯甲烷溶液中(油相)，常溫振蕩至完全溶解，加入200 μl雙蒸水(水相)，在常溫條件下以聲振儀聲振3 min，功率為100 W，再加入8 ml 4%PVA溶液進(jìn)行第2次聲振，以磁力攪拌器攪拌揮發(fā)二氯甲烷2 h，待二氯甲烷完全揮發(fā)，以雙蒸水離心洗滌(10 000 r/min，5 min)數(shù)次，制備獲得HMME@PLGA納米粒，于4°C條件下保存。

1.3 基本特征觀察 采用粒徑儀檢測納米粒的粒徑和表面電位，在光學(xué)顯微鏡、透射電鏡和激光共聚焦顯微鏡下觀察其形態(tài)特征，連續(xù)觀察1周。

1.4 包封率、載藥量和細(xì)胞存活率檢測 配置不同濃度的HMME三氯甲烷溶液，以紫外分光光度計測量其吸光度并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出包封率及載藥量。將10 μl濃度為1 mg/ml的HMME@PLGA納米粒與人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞共同孵育24 h，采用CCK-8法檢測細(xì)胞存活率。

1.5 體外光聲顯像 稱取一定量瓊脂，加入適量脫氣水，以微波爐加熱，攪拌至氣泡消失，然后將EP管底部插入凝膠內(nèi)并固定，待其冷卻凝固后取出，制作帶孔的凝膠模型。配制不同濃度(1、2、4、8、16 mg/ml)的HMME@PLGA納米粒溶液，分別加入至不同的凝膠孔內(nèi)，同時在另外2個凝膠孔內(nèi)加入等量的磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline， PBS)和0.48 mg/ml的HMME原液(采用濃度為16 mg/ml HMME@PLGA溶液，用量根據(jù)包封率計算，使其包載的HMME量為0.48 mg/ml)，在690 nm激光輻照后，以光聲成像系統(tǒng)采集得到體外光聲圖。

1.6 體外活性氧檢測 體外培養(yǎng)人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞，取對數(shù)生長期細(xì)胞，以1×105個/孔接種于6孔板內(nèi)。將細(xì)胞分為以下6組：①HMME@PLGA+US組，每孔加入1 ml HMME@PLGA(1 mg/ml)，培養(yǎng)3 h后，以PBS洗滌3次，再以LIFU(超聲功率1.5 W/cm2)輻照30 s后立即加入DCFH-DA溶劑，放入培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育30 min，以EDTA-胰酶消化細(xì)胞后離心，500 μl PBS重懸細(xì)胞，采用流式細(xì)胞儀檢測產(chǎn)生活性氧水平；②HMME+US組，每孔加入1 ml HMME的重懸液(30.24 μg HMME)，其他步驟同HMME@PLGA+US組；③PLGA+US組，每孔加入1 ml PLGA空白球，其他步驟同HMME@PLGA+US組；④HMME@PLGA組，除不用超聲輻照外，其他方法同HMME@PLGA+US組；⑤US組，直接對細(xì)胞孔板進(jìn)行超聲輻照，超聲能量及其他步驟同HMME@PLGA+US組；⑥對照組，細(xì)胞孔板內(nèi)不加任何試劑，亦不進(jìn)行超聲輻照，直接收集細(xì)胞通過流式細(xì)胞儀檢測活性氧含量。

1.7 體外SDT 取對數(shù)生長期人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞，以1×105個/孔接種于激光共聚焦培養(yǎng)皿內(nèi)。將細(xì)胞分為以下4組：①HMME@PLGA+US組，向培養(yǎng)皿內(nèi)加入1 ml HMME@PLGA(1 mg/ml)，培養(yǎng)數(shù)小時后，PBS洗滌3次，超聲輻照30 s，功率設(shè)定為1.5 W/cm2，然后加入配備好的Calcein-AM/PI染色15 min，EDTA-胰酶消化細(xì)胞，PBS洗去多余染料，放置于激光共聚焦儀器上觀察治療效果；②HMME@PLGA組，除不進(jìn)行超聲輻照外，實驗方法同HMME@PLGA+US組；③US組，除不加入納米乳液外，實驗方法同HMME@PLGA+US組；④對照組，除了不加入納米乳液和進(jìn)行超聲輻照外，其余方法同HMME@PLGA+US組。AO染色：除將Calcein-AM/PI染料替換成AO染料外，其余步驟同Calcein-AM/PI染色法。

2 結(jié)果

2.1 HMME@PLGA納米粒的基本特性 制備的多功能納米粒HMME@PLGA呈淺紅色懸著乳液，分散性好；光學(xué)顯微鏡下觀察，納米粒大小均一，形態(tài)規(guī)則(圖1A)；在透射電鏡下呈球形，大小約300 nm(圖1B)。通過激光共聚焦顯微鏡觀察此納米粒呈均勻一致的紅色顆粒(圖1C)。經(jīng)馬爾文粒徑儀測得納米粒的粒徑為(333.67±17.50)nm(圖1D)，表面電位為(-10.57±1.98)mV(圖1E)。該納米粒在1周內(nèi)大小、形態(tài)無明顯變化。

HMME@PLGA納米粒的包封率為75.62%，載藥量為2.90%，濃度為1 mg/ml的納米粒與人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞共孵育24 h的細(xì)胞存活率為87.21%。

2.2 體外光聲顯像 HMME@PLGA納米粒在激光照射下顯示較強的光聲信號(紅色)，并且隨濃度遞增，光聲信號逐漸增強；PBS無光聲信號，HMME原液(0.48 mg/ml)產(chǎn)生的光聲信號較弱(圖2)。

圖1 HMME@PLGA納米粒表征 A.光學(xué)顯微鏡下觀察； B.透射電鏡下觀察； C.激光共聚焦顯微鏡下觀察； D.粒徑分布圖； E.電位分布圖

圖2 HMME@PLGA納米粒體外光聲顯影圖 A.PBS溶液； B～F.濃度分別為1、2、4、8、16 mg/ml的HMME@PLGA納米粒溶液； G.HMME原液(0.48 mg/ml)

圖3 流式細(xì)胞儀定量測得各組細(xì)胞的活性氧含量 A.HMME@PLGA+US組； B.HMME+US組； C.PLGA+US組； D.HMME@PLGA組； E.US組； F.對照組

2.3 體外活性氧檢測 HMME@PLGA+US組有大量活性氧產(chǎn)生，與HMME+US組產(chǎn)生的量相當(dāng)，而其他各組均無明顯活性氧產(chǎn)生(圖3)。

2.4 體外SDT效果 Calcein-AM/PI染色顯示HMME@PLGA+US組細(xì)胞大量死亡，呈紅色熒光，而其他各組細(xì)胞均可見存活，呈綠色熒光(圖4A)。AO染色顯示HMME@PLGA+US組溶酶體不能顯色，而其他各組溶酶體均被染成黃色(圖4B)。

3 討論

惡性腫瘤已成為威脅人類健康的主要原因之一。目前治療癌癥的方式主要有化療、放療、手術(shù)等，雖能在一定程度上抑制腫瘤生長，但其不良反應(yīng)不容忽視[5]。SDT較PDT有顯著優(yōu)點，如無創(chuàng)、成本低、操作性強、可有效聚焦深部組織等，但許多聲敏劑單線態(tài)氧產(chǎn)量低、光毒性作用強、結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定、腫瘤組織選擇性低，因而選擇高效低毒的聲敏劑對SDT的進(jìn)一步發(fā)展至關(guān)重要。

HMME具有成分單一、組成穩(wěn)定、治療后避光時間短等顯著優(yōu)點[6]，但顯著疏水性限制了其臨床應(yīng)用。PLGA具有良好的生物相容性[7-8]和極高的生物安全性，被美國食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)應(yīng)用于藥物遞送，同時被用于研制納米材料，在腫瘤顯像與治療方面取得了很大進(jìn)步與發(fā)展[9]。由PLGA包裹HMME納米粒可提高其穩(wěn)定性并降低光漂白速率。研究[10-11]表明，HMME不僅具有SDT作用，且在增強光聲顯像方面亦有顯著效果。光聲成像是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域興起的新型成像技術(shù)，主要利用組織光能量的吸收分布推測內(nèi)部結(jié)構(gòu)，是一種無創(chuàng)、非電離性檢測手段，具有組織分辨力好、對比度高、穿透性強等特點[12-13]；然而體內(nèi)存在許多固有光聲信號，如黑色素、血紅蛋白等可干擾對腫瘤組織的顯影。通過被動靶向作用，納米級光聲造影劑能夠選擇性聚集在腫瘤病變區(qū)域，對于提高診斷準(zhǔn)確性、減少體內(nèi)信號干擾有明顯作用。

圖4 激光掃描共聚焦圖 A～D.分別為 HMME@PLGA+US組、HMME@PLGA組、US組、對照組Calcein-AM/PI染色圖； E～H.分別為 HMME@PLGA+US組、HMME@PLGA組、US組、對照組AO染色圖

本研究通過雙乳化法制備的HMME@PLGA納米粒，大小均一，且在1周內(nèi)大小、形態(tài)無明顯變化，表明其穩(wěn)定性好。HMME在激光激發(fā)下呈紅色熒光，激光共聚焦顯微鏡顯示該納米粒呈均一大小的紅色顆粒，表明HMME成功包載于PLGA內(nèi)。HMME是一種水溶性物質(zhì)，難以進(jìn)行生物利用，用PLGA負(fù)載后提高了HMME的穩(wěn)定性，克服了其疏水局限性，有利于其進(jìn)一步生物利用；該納米粒與人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞共孵育24 h后87.21%細(xì)胞仍能繼續(xù)存活，提示其具有較高的生物安全性。

HMME@PLGA納米粒在激光照射下能將光信號轉(zhuǎn)化為聲學(xué)信號。HMME具有增強光聲顯影的作用。本研究中，隨納米粒濃度增加，光聲信號逐漸增強；而在同等濃度下，HMME@PLGA納米粒產(chǎn)生的光聲信號明顯高于HMME原液，提示被包裹的HMME有更好的光穩(wěn)定性。

DCFH-DA本身無熒光信號，但可自由穿過細(xì)胞膜，當(dāng)其與活性氧接觸時，可以產(chǎn)生有綠色熒光的DCF，其熒光信號強度與活性氧水平呈正比。超聲波激發(fā)下，吞噬了HMME@PLGA的人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞呈現(xiàn)出明顯綠色，表明其產(chǎn)生了大量活性氧，對細(xì)胞產(chǎn)生明顯的殺傷作用，經(jīng)Calcein-AM/PI染色顯示大片細(xì)胞壞死(紅色熒光)，而單純超聲輻照或者單獨納米球并不能對細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，對細(xì)胞存活率無明顯影響(綠色熒光)，由此證實HMME@PLGA納米粒在體外具有明顯的SDT效果。為進(jìn)一步驗證SDT對細(xì)胞器的治療效果，本研究采用AO染料對細(xì)胞進(jìn)行染色，發(fā)現(xiàn)在對照組、US組和HMME@PLGA組中可見細(xì)胞周圍有大量正常溶酶體，染色后呈黃色，而HMME@PLGA+US組則由于超聲輻照后活性氧的產(chǎn)生對細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，細(xì)胞溶酶體結(jié)構(gòu)破壞消失，無明顯染色，進(jìn)一步證實了活性氧介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用。

總之，本研究成功制備了包裹HMME的高分子納米粒，可顯著增強體外光聲成像并具有良好的SDT治療效果，有望成為一種新型的診療一體化分子探針。