譯校│張倩 張淼潔 翟新驗(yàn)（中國(guó)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心）

5 判斷對(duì)禽群有雞毒支原體、滑液囊支原體和火雞支原體陽(yáng)性反應(yīng)狀態(tài)的程序（血液檢測(cè)程序1～4請(qǐng)見(jiàn)本刊2019年1期）

美國(guó)病理學(xué)家協(xié)會(huì)（AAAP）出版的《禽類病原體、禽類支原體?。u毒支原體）分離、鑒定和特性方法實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》、世界動(dòng)物衛(wèi)生組織2004年出版的第五版《陸生動(dòng)物診斷試驗(yàn)和疫苗手冊(cè)》，以及本標(biāo)準(zhǔn)程序記錄了分離和鑒定支原體的程序。

（a）確定禽群支原體感染狀態(tài)。應(yīng)根據(jù)以下標(biāo)準(zhǔn)確定禽群的支原體感染狀態(tài)：

（1）如果酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）、官方分子檢查程序或血清平板試驗(yàn)結(jié)果呈陰性，則雞群符合陰性群的分類。

（2）如果酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定或血清平板試驗(yàn)結(jié)果呈陽(yáng)性，則應(yīng)進(jìn)行紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)或執(zhí)行分子檢查程序：若超過(guò)50%的樣本為雞毒支原體、火雞支原體或雞毒霉形體陽(yáng)性，則進(jìn)行紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)時(shí)，應(yīng)選擇10%的陽(yáng)性樣本或25個(gè)陽(yáng)性樣本進(jìn)行試驗(yàn)，以數(shù)量較大者為準(zhǔn)。1∶40或更高比例的紅細(xì)胞凝集抑制效價(jià)可被解釋為可疑反應(yīng)，應(yīng)立即（從最初采樣算起7天內(nèi)）從臨床檢測(cè)出受感染的30只家禽體內(nèi)采集合適的抗原檢測(cè)標(biāo)本，并用獲批的培養(yǎng)技術(shù)檢查每一只家禽，或用分子檢測(cè)程序或體內(nèi)生物鑒定試驗(yàn)進(jìn)行混樣檢測(cè)（每一次的檢測(cè)量多達(dá)5個(gè)拭子）。

（3）如果體內(nèi)生物鑒定、分子檢查程序或培養(yǎng)程序的結(jié)果呈陰性，則該禽群通過(guò)檢測(cè)，官方機(jī)構(gòu)應(yīng)認(rèn)證其符合陰性群的分類。當(dāng)培養(yǎng)液受到污染時(shí)，必須運(yùn)用分子檢查技術(shù)做出最終裁定。

（4）如果體內(nèi)生物鑒定、分子檢查程序或培養(yǎng)程序的結(jié)果呈陽(yáng)性，則可認(rèn)為該禽群已受到感染。

6 支原體標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)程序

血清平板凝集試驗(yàn)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）是基本的支原體抗體篩選檢測(cè)試驗(yàn)。選擇哪一種檢測(cè)取決于偏好、實(shí)驗(yàn)室設(shè)施和可獲得的抗原。盡管這兩種檢測(cè)都相當(dāng)準(zhǔn)確，但由于偶然存在非特異性反應(yīng)，這些檢測(cè)只能測(cè)定禽群的狀態(tài)，而不能測(cè)定單獨(dú)某只禽的狀態(tài)。在正常情況下，發(fā)生這種非特異性反應(yīng)的概率很低，尤其是在火雞身上使用了丹毒菌苗以后，用支原體抗體檢測(cè)密切相關(guān)的支原體的偶爾非特異性反應(yīng)的發(fā)生率會(huì)很高。就常規(guī)篩查而言，紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)陽(yáng)性反應(yīng)非常準(zhǔn)確，但有些過(guò)于煩瑣，只在評(píng)價(jià)與酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)和平皿抗原起反應(yīng)的血清標(biāo)本時(shí)有幫助。應(yīng)以4個(gè)紅細(xì)胞凝集單位為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢測(cè)。當(dāng)雞和火雞血清的效價(jià)為1∶80或更高時(shí)，結(jié)果為陽(yáng)性；為1∶40時(shí)，結(jié)果為可疑，則需要進(jìn)行額外的檢測(cè)。

（a）血清平板凝集試驗(yàn)。用來(lái)檢測(cè)支原體的血清平板凝集試驗(yàn)應(yīng)按照《國(guó)家家禽改良計(jì)劃》（NPIP）批準(zhǔn)的生產(chǎn)商的指示進(jìn)行，每檢測(cè)一個(gè)樣本時(shí)，都應(yīng)根據(jù)已知的陽(yáng)性和陰性對(duì)照血清來(lái)測(cè)試抗原?？蓮膰?guó)家獸醫(yī)服務(wù)實(shí)驗(yàn)室（NVSL）獲得陰性和陽(yáng)性血清。另外還可以通過(guò)商業(yè)途徑購(gòu)買到陽(yáng)性和陰性質(zhì)控血清。

（b）紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)。支原體紅細(xì)胞凝集抑制反應(yīng)試驗(yàn)通過(guò)抗原量不變，血清量降低的方法進(jìn)行。該方法需要用到4個(gè)紅細(xì)胞凝集單位的稀釋抗原。用到的紅細(xì)胞凝集單位數(shù)目的變化會(huì)顯著地改變陽(yáng)性血清效價(jià)。針對(duì)雞毒支原體、滑液囊支原體和火雞支原體的標(biāo)準(zhǔn)紅細(xì)胞凝集抗原可從國(guó)家獸醫(yī)服務(wù)實(shí)驗(yàn)室獲得。該抗原已按照1∶640的比例進(jìn)行滴定和稀釋。在首次使用或長(zhǎng)時(shí)間儲(chǔ)存后，應(yīng)按照段落（b）（2）（ii）或（b）（3）（ii）中所述的方法檢查每一個(gè)樣本的紅細(xì)胞凝集效價(jià)。為了保持抗原的紅細(xì)胞凝集活性，未稀釋的紅細(xì)胞凝集抗原應(yīng)保存在零下60℃至零下70℃的環(huán)境中。

（1）材料的準(zhǔn)備。（i）按表1配備磷酸緩沖鹽溶液（PBS）∶

表1 配備磷酸緩沖鹽溶液成分

若所有試劑都測(cè)量準(zhǔn)確的話，磷酸鹽緩沖溶液的酸堿度（pH）將在7.1～7.2。

（ii）采集火雞或雞的紅細(xì)胞（RBC's）放置在肝素（1000單位/毫升）或阿氏液中保存， 阿氏液的配制方法如表2：

表2 阿氏液的配制成分

將檸檬酸鈉和氯化鈉溶于800毫升的蒸餾水中，并在15磅的壓力下滅菌15分鐘。

將葡萄糖溶于200毫升的蒸餾水中，用蔡氏過(guò)濾器或其他類型的過(guò)濾器對(duì)其進(jìn)行滅菌，然后通過(guò)無(wú)菌操作將其加入無(wú)菌的檸檬酸鈉和氯化鈉溶液中。

（iii）從已知的不含所檢測(cè)支原體的火雞或雞身上，用含有肝素（每10毫升血液中大約含有0.2毫升肝素）或阿氏液的注射器，按照1∶5的比例（如：8毫升的血液配40毫升的阿氏液）抽取足量的血液。對(duì)血液離心10分鐘，轉(zhuǎn)速為1000rpm（轉(zhuǎn)/分鐘），然后用移液管去除上層清液。

（iv）用10倍量或更多份阿氏液或緩沖鹽水清洗紅細(xì)胞兩次，每一次清洗后都需以每分鐘1000rpm的轉(zhuǎn)速離心10分鐘。去除上清液后，用阿氏液或緩沖鹽水對(duì)紅細(xì)胞沉積物做懸浮處理，確保濃縮紅細(xì)胞在懸浮液中的濃度為25%（無(wú)論是檢測(cè)雞血清還是火雞血清，都必須使用同源的紅細(xì)胞，即檢測(cè)雞血清時(shí)要用雞的紅細(xì)胞，檢測(cè)火雞血清時(shí)，則需用到火雞的紅細(xì)胞）。若懸浮液需冷藏保存，則保存時(shí)間為采血后的7至8天。

（v）檢測(cè)時(shí)，將2毫升紅細(xì)胞濃度為25%的懸浮液加入到98毫升的緩沖鹽水中，制成終濃度為0.25%的紅細(xì)胞懸浮液。

（2）程序1。（i）所需材料：微量滴定儀（最小）；即微孔板、微量稀釋器、微量移液器、極限稀釋轉(zhuǎn)移測(cè)量?jī)x（0.05毫升）；磷酸鹽緩沖溶液（PBS）；從國(guó)家獸醫(yī)服務(wù)實(shí)驗(yàn)室獲得的試劑，即紅細(xì)胞凝集抗原和待檢測(cè)支原體的滴定過(guò)的陰性和陽(yáng)性血清；從未感染待檢測(cè)支原體的禽類體內(nèi)獲得的終濃度為0.5%（2毫升紅細(xì)胞濃度為25%的懸浮液加入到98毫升的磷酸鹽緩沖溶液中配備而來(lái)）的同源紅細(xì)胞（RBCs）懸浮液。見(jiàn)本節(jié)段落（d）（1）（ii）至（v）有關(guān)紅細(xì)胞配制的介紹。

（ii）紅細(xì)胞凝集（HA）抗原滴定。標(biāo)記出抗原滴定試驗(yàn)的每一個(gè)孔，共兩排，每排10個(gè)孔（紅細(xì)胞凝集抗原滴定試驗(yàn)需設(shè)置復(fù)孔檢測(cè)）；標(biāo)記出每一排中最后一個(gè)孔，作為對(duì)照組；在小試管（12×75毫米）中，將0.1毫升的抗原與0.9毫升的磷酸緩沖鹽溶液混合，配制比例為1∶10的起始抗原稀釋液；向所有孔中加入0.05毫升的磷酸緩沖鹽溶液，包括對(duì)照組；將0.05毫升的抗原稀釋液（1∶10稀釋）加入到兩排的第1個(gè)孔中，充分混勻后，將稀釋液轉(zhuǎn)移到每排的第2個(gè)孔中進(jìn)行混勻，以此類推一直到每排的第10個(gè)孔，用分裝檢測(cè)卡檢查從最后一個(gè)孔中取出稀釋液混合物，然后將稀釋液放入蒸餾水中，如果稀釋液檢查有效，抗原稀釋度將依次為1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320、1∶640、1∶1280、1∶2560、1∶5120；用容量為0.05毫升的滴管向所有孔中加入0.05毫升濃度為0.5%的紅細(xì)胞懸浮液；若微孔板還需放置兩小時(shí)以上時(shí)，則將微孔板密封。搖動(dòng)微孔板并于室溫下靜置，直到對(duì)照組中的細(xì)胞聚集成緊湊的紐扣狀。滴度是能產(chǎn)生完整凝集反應(yīng)的最高稀釋度。0.05毫升稀釋液中包含1個(gè)紅細(xì)胞凝集單位；配制0.05毫升含8個(gè)紅細(xì)胞凝集單位的抗原稀釋液。例如：若抗原滴度為1∶640，則每0.05毫升的抗原稀釋液中含1個(gè)紅細(xì)胞凝集單位。用640除以8得80，那么1∶80稀釋的抗原稀釋液中含8個(gè)紅細(xì)胞凝集單位。用640除以4得160，那么1∶160稀釋后每0.05毫升的抗原稀釋中含有4個(gè)紅細(xì)胞凝集單位（見(jiàn)表3）。

表3 紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)的樣本結(jié)果（試管和血清稀釋）

（iii）血凝抑制試驗(yàn)。配制兩份抗原稀釋液，一份每0.05毫升包含8個(gè)紅細(xì)胞凝集單位，一份每0.05毫升包含4個(gè)紅細(xì)胞凝集單位。后者可通過(guò)往前者中混入等量的磷酸緩沖鹽溶液而獲得。每項(xiàng)檢測(cè)需標(biāo)記出一排8個(gè)孔。

在小試管（12×75毫米）中配制每種待檢測(cè)血清1∶5的稀釋液：0.1毫升血清加0.4毫升磷酸鹽緩沖溶液或0.05毫升血清加0.20毫升磷酸鹽緩沖溶液。

用容量為0.05毫升的滴管將0.05毫升的磷酸鹽緩沖溶液加入到每排最后一個(gè)孔中。

將0.05毫升含8個(gè)紅細(xì)胞凝集單位的抗原加入到每排的第2個(gè)孔中。

將0.05毫升含4個(gè)紅細(xì)胞凝集單位的抗原加入到每排第3至8個(gè)孔中。

針對(duì)每份待檢測(cè)血清，在每排第1個(gè)孔，加入0.05毫升的稀釋液和上文第（iii）段配制的將1∶5稀釋的血清。

混合均勻后，從第1個(gè)孔中吸取血清稀釋液，轉(zhuǎn)移到第2個(gè)孔中，依次進(jìn)行兩倍稀釋操作一直到第8個(gè)孔。

第1個(gè)孔（血清稀釋度為1∶10）為血清對(duì)照組。第2個(gè)孔＝1∶20稀釋度；第3個(gè)孔＝ 1∶40稀釋度；第4個(gè)孔＝1∶80稀釋度；第5個(gè)孔＝1∶160稀釋度；第6個(gè)孔＝1∶320稀釋度；第7個(gè)孔＝1∶640稀釋度；第8個(gè)孔＝1∶1280稀釋度。

抗原對(duì)照組。標(biāo)記6個(gè)孔作為抗原對(duì)照組；將0.05毫升磷酸緩沖鹽溶液加入到第2、3、4、5和6個(gè)孔中；將0.05毫升含8個(gè)紅細(xì)胞凝集單位的抗原加入到第1和第2個(gè)孔中；用空的稀釋器，將第2個(gè)孔里的溶液混勻，并依次進(jìn)行兩倍稀釋操作一直到第6個(gè)孔；第1個(gè)孔中包含8個(gè)紅細(xì)胞凝集單位，第2個(gè)孔中包含4個(gè)紅細(xì)胞凝集單位，第3個(gè)孔中包含2個(gè)紅細(xì)胞凝集單位，第4個(gè)孔中包含1個(gè)紅細(xì)胞凝集單位，第5個(gè)孔中包含1/2個(gè)紅細(xì)胞凝集單位，第6個(gè)孔中包含1/4個(gè)紅細(xì)胞凝集單位；標(biāo)記兩個(gè)孔作為對(duì)照組，向每個(gè)孔中加入0.05毫升磷酸鹽緩沖溶液；在室溫下（20～23℃）孵育20至30分鐘，使抗體抗原充分發(fā)生反應(yīng)，向所有孔中加入0.05毫升濃度為0.5%的紅細(xì)胞懸浮液；密封所有的孔（如果反應(yīng)孔需放置2小時(shí)以上時(shí)）。充分搖勻微孔板；在室溫下孵育30至45分鐘。

解釋：血凝抑制效價(jià)是當(dāng)反應(yīng)板傾斜時(shí)通過(guò)紅細(xì)胞流下時(shí)，能夠呈現(xiàn)完整的紅細(xì)胞凝集抑制反應(yīng)的最高血清稀釋度。效價(jià)為1∶80或更高的血清被視為陽(yáng)性，效價(jià)為1∶40的被視為可疑。樣本檢測(cè)結(jié)果如本段表1所示。

（iv）如果不確定血凝試驗(yàn)和血凝抑制試驗(yàn)的檢測(cè)結(jié)果，則意味著至少間隔21天后，需對(duì)樣本進(jìn)行病原培養(yǎng)。

（3）程序2。目的：通過(guò)紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)（HI）檢測(cè)禽類支原體的抗體。本試驗(yàn)運(yùn)用抗原量不變、稀釋血清的方法來(lái)測(cè)量雞毒支原體、滑液囊支原體或火雞支原體的抗體。

（i）所需材料。雞毒支原體、滑液囊支原體，火雞支原體血凝抑制抗原；陽(yáng)性和陰性對(duì)照血清；磷酸鹽緩沖溶液；96孔U型底微量滴定板；12道移液器（德國(guó)伯赫）；50微升移液器（皮佩曼，P200）；移液器吸頭；含0.5%同源紅細(xì)胞的磷酸鹽緩沖溶液（使用來(lái)自待檢測(cè)同一物種身上提取的紅細(xì)胞）；封板膜；鏡面讀數(shù)器。

（ii）紅細(xì)胞凝集（HA）抗原滴定。對(duì)支原體抗原進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)紅細(xì)胞凝集（HA）檢測(cè)，以確定其抗原效價(jià)；將50微升磷酸鹽緩沖溶液加入到96孔微量滴定板的3排孔中；將50微升抗原原液加入到2排孔中；用12道移液器依次進(jìn)行兩倍倍比稀釋（50微升）。稀釋比例為1∶2至1∶4096；向3排孔中加入50微升濃度為0.5%的同源紅細(xì)胞。未添加抗原的那一排作為紅細(xì)胞對(duì)照組。

在室溫下進(jìn)行孵育（大約30分鐘）直到對(duì)照組紅細(xì)胞凝集成緊湊的紐扣狀。當(dāng)最后一個(gè)孔中的紅細(xì)胞呈現(xiàn)出完整的彌散狀（紅細(xì)胞凝集）時(shí)，讀取紅細(xì)胞凝集效價(jià)。

為進(jìn)行血凝抑制試驗(yàn)，將抗原原液稀釋成含4個(gè)紅細(xì)胞凝集單位的抗原稀釋液。該含4個(gè)紅細(xì)胞凝集單位的抗原稀釋液是用抗原原液的紅細(xì)胞凝集效價(jià)除以8計(jì)算得出。（例如：1∶320紅細(xì)胞凝集單位除以8等于40，按1∶40的比例稀釋抗原原液）

（iii）紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)。在96孔U底微孔板上標(biāo)記出一列（A到H）為每個(gè)樣本、每個(gè)陽(yáng)性和陰性對(duì)照組、抗原回滴孔和紅細(xì)胞對(duì)照的加樣孔。

將40微升的磷酸緩沖鹽溶液加入到微孔板的最上面一排（A排）的每個(gè)孔中。向該微孔板所有剩余的孔中加入25微升磷酸緩沖鹽溶液。

在A排每個(gè)孔中加入每份待測(cè)血清10微升（制成比例為1∶5的血清稀釋液）。

用12道移液器依次從A孔到H孔倍比稀釋25微升血清稀釋液。最后25微升溶液棄去，這樣各排的稀釋比例分別為：A排＝1∶5至H排1∶640。

用牛津劑量器，向B孔到H孔依次加入25微升含4個(gè)紅細(xì)胞凝集單位的抗原。A孔為血清對(duì)照組。

通過(guò)向其中一列的每個(gè)孔中加入25微升的磷酸鹽緩沖溶液來(lái)進(jìn)行抗原回滴。向A孔中加入25微升的稀釋抗原，然后從A至D孔依次稀釋25微升，這樣抗原稀釋度依次為1∶2、1∶4、1∶8和1∶16。（建議在血凝抑制試驗(yàn)中使用抗原稀釋液前，進(jìn)行抗原會(huì)滴。這樣就可以在不合適的抗原稀釋液被用于血凝抑制試驗(yàn)前及時(shí)發(fā)現(xiàn)不合適的抗原稀釋問(wèn)題并進(jìn)行糾正。）

其中一列孔中不添加抗原和血清，作紅細(xì)胞對(duì)照組用。輕輕攪拌并在室溫下孵育30分鐘。

向所有孔中加入50微升濃度為0.5%的紅細(xì)胞。注意：加入紅細(xì)胞后不要攪動(dòng)（攪拌可能會(huì)導(dǎo)致紅細(xì)胞下沉，從而引起假陽(yáng)性反應(yīng)，形成“假”的紐扣狀凝塊）。

用封板膜蓋上反應(yīng)板。在室溫下孵育30分鐘，或直至對(duì)照組中紅細(xì)胞形成一個(gè)緊湊的紐扣狀凝塊為止。

在鏡像平板讀數(shù)器上讀取反應(yīng)結(jié)果。

（ⅳ）結(jié)果。效價(jià)指的是形成緊湊的紐扣狀紅細(xì)胞的最后一個(gè)稀釋度的倒數(shù)。最終稀釋方案包括稀釋計(jì)算中的抗原，具體如下，B＝1∶20、C＝1∶40、D＝1∶80、E＝1∶160、F＝1∶320、G＝1∶640、H＝1∶1280。

只有滿足以下條件，試驗(yàn)才有效：陽(yáng)性對(duì)照組血清效價(jià)應(yīng)在此前已測(cè)定效價(jià)的一個(gè)滴度范圍內(nèi)；陰性對(duì)照組血清必須呈陰性；抗原回滴結(jié)果必須為1∶4或1∶8；紅細(xì)胞對(duì)照組必須呈現(xiàn)緊湊且非溶血的紐扣狀凝塊；血清對(duì)照組（A排孔的每份待測(cè)血清）都不得出現(xiàn)非特異性凝集或溶血。如果為陰性，報(bào)告中應(yīng)描述為“陰性，且無(wú)非特異性凝集或非特異性溶血”，或“由于非特異性凝集或溶血而無(wú)法評(píng)估”，或“處理血清，去除非特異性凝集，并重復(fù)試驗(yàn)”。

去除非特異性凝集的處理。目的：處理血清，去除影響血凝抑制試驗(yàn)的非特異性凝集。樣本：血清。

材料：同源紅細(xì)胞（雞或火雞），50%的磷酸鹽緩沖溶液、離心機(jī)、孵化器、冰箱（4℃）。

程序：將50微升的血清加入200微升的磷酸鹽緩沖溶液中，配制稀釋度為1∶5的試驗(yàn)用血清；向磷酸鹽緩沖溶液中加入等量的濃縮紅細(xì)胞，配制濃度為50%的紅細(xì)胞溶液。均勻混合；將25微升濃度為50%的紅細(xì)胞溶液加入到血清稀釋液中；輕輕攪拌混勻；在4℃下孵育1小時(shí)；離心紅細(xì)胞形成小球狀；用上清液進(jìn)行血凝抑制試驗(yàn)。調(diào)整試驗(yàn)中的稀釋方案時(shí)需考慮到處理過(guò)程中的初始1∶5血清稀釋液。在1∶5的血清稀釋方案中，不要在A排的孔中加入磷酸鹽緩沖溶液，而要在其中加入50微升1∶5稀釋的處理后的上清液。從A排到H排，依次倍比稀釋25微升，這樣從B排至H排血清稀釋度依次為1∶10到1∶640。

7 制備診斷試驗(yàn)用蛋黃標(biāo)本的程序

如下檢測(cè)條款適用于《聯(lián)邦法規(guī)匯編》中美國(guó)禽群雞毒支原體凈化相關(guān)內(nèi)容、美國(guó)禽群滑液囊支原體凈化相關(guān)內(nèi)容、美國(guó)禽群H5/H7禽流感受到監(jiān)控相關(guān)內(nèi)容。

（a）在授權(quán)代理人或州檢察員的監(jiān)督下，用于蛋黃檢測(cè)的雞蛋必須是從種雞群所在的養(yǎng)殖場(chǎng)中挑選而來(lái)、必須包括從該雞群?jiǎn)稳债a(chǎn)出的雞蛋中所挑選出的30個(gè)雞蛋做代表性樣本、必須標(biāo)記出來(lái)源雞群和雞舍且必須送往授權(quán)實(shí)驗(yàn)室制備診斷試驗(yàn)用檢測(cè)樣本。

（b）授權(quán)實(shí)驗(yàn)室必須確認(rèn)每個(gè)雞蛋來(lái)自哪個(gè)種雞群和雞舍，且在以下各個(gè)環(huán)節(jié)都需要保留該鑒定信息：

（1）用鈍器將雞蛋圓端敲開(kāi)。

（2）將雞蛋的內(nèi)容物倒入開(kāi)放的容器中（使蛋黃裸露出來(lái)），并用針刺穿蛋黃。

（3）用1毫升不帶針頭的注射器，從蛋黃開(kāi)口處抽吸0.5毫升蛋黃。

（4）將抽吸的蛋黃裝入一支試管中，然后在相同的試管中加入0.5毫升磷酸鹽緩沖溶液，將試管放在架子上。

（5）所有的雞蛋都取樣后，將試管架放置在旋轉(zhuǎn)振蕩器上30秒鐘。

（6）樣本以每分鐘2500 rpm的轉(zhuǎn)速（1000xg）離心30分鐘。

（7）對(duì)于用于保持美國(guó)禽群雞毒支原體和滑液囊支原體凈化分類的待檢測(cè)蛋黃樣本，檢測(cè)離心處理后的蛋黃上清液中是否含有雞毒支原體和滑液囊支原體應(yīng)運(yùn)用指定檢測(cè)血清和指定的檢測(cè)免疫球蛋白抗體的試驗(yàn)程序（做這些實(shí)驗(yàn)時(shí)，可用血清替代離心處理后的蛋黃上清液）。

對(duì)于用于美國(guó)禽群H5/H7禽流感監(jiān)測(cè)的待檢測(cè)蛋黃樣本，依據(jù)《聯(lián)邦法規(guī)匯編》中的要求檢測(cè)離心處理后的蛋黃上清液。

注意：評(píng)估任意蛋黃檢測(cè)試驗(yàn)的結(jié)果時(shí)要記住，初始樣本配制時(shí)是用鹽水將蛋黃1∶2稀釋的。

8 禽流感標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)程序

（a）瓊脂凝膠免疫擴(kuò)散（AGID）試驗(yàn)。瓊脂凝膠免疫擴(kuò)散（AGID）試驗(yàn)被視為針對(duì)甲型流感病毒抗體的基本篩選試驗(yàn)。瓊脂凝膠免疫擴(kuò)散試驗(yàn)被用來(lái)檢測(cè)針對(duì)甲型流感群特異性抗原的循環(huán)抗體，即核糖核蛋白（RNP）和基質(zhì)蛋白（M）。因此，不論它們是哪種亞型毒株，本試驗(yàn)針對(duì)甲型流感病毒的抗體均可檢測(cè)。瓊脂凝膠免疫擴(kuò)散試驗(yàn)也可以作為鑒定甲型禽流感病毒分離菌的群特異性試驗(yàn)。使用的方法和比爾德（Beard）所描述的方法類似。瓊脂凝膠免疫擴(kuò)散試驗(yàn)的基礎(chǔ)是抗原和抗體通過(guò)瓊脂凝膠基質(zhì)向彼此同時(shí)移動(dòng)。當(dāng)抗原和特異性抗體接觸時(shí)，它們會(huì)結(jié)合形成一種沉淀物，該沉淀物卡在凝膠基質(zhì)中，形成一條肉眼可見(jiàn)的線條。沉淀物在抗原和抗體濃度最佳的地方形成線條。抗原和抗體相對(duì)濃度的變化會(huì)使該線條的位置移向孔中濃度最低的地方，或不會(huì)形成一條沉淀物線條。電解質(zhì)濃度、酸堿度、溫度和其他變量也會(huì)影響沉淀物的形成。

（1）所需材料：冰箱（4℃）；冷凍箱（零下20℃）；用于室溫（約25℃）孵育的孵化器或密閉容器；高壓滅菌器；加熱板/攪拌器和磁力攪拌棒（可選）；真空泵；顯微鏡照明器或其他合適的光源，用于讀取結(jié)果；免疫擴(kuò)散模板切割器、七孔模型（中心孔周圍由六個(gè)間隔均勻的孔組成）。孔的直徑為5.3毫米，間隔2.4毫米；上皿天平（能夠測(cè)量0.1克的差異）；可吸取50微升溶液的吸移器；常見(jiàn)實(shí)驗(yàn)室物品和玻璃器皿—錐形瓶、刻度量筒、移液管、100×15毫米或60×15毫米培養(yǎng)皿、真空軟管、支管燒瓶（500毫升或更大）以及一根12或14號(hào)平頭端插管。

（2）所需試劑：磷酸鹽緩沖液（PBS），0.01M，pH7.2（國(guó)家獸醫(yī)服務(wù)實(shí)驗(yàn)室的培養(yǎng)基#30054或等同物）；瓊脂糖（培養(yǎng)基II型中等，西格瑪化工有限公司#A-6877或等同物）；美國(guó)農(nóng)業(yè)部和官方國(guó)家機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)的禽流感瓊脂凝膠免疫擴(kuò)散抗原和陽(yáng)性對(duì)照血清；美國(guó)農(nóng)業(yè)部和官方國(guó)家機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)的強(qiáng)陽(yáng)性、弱陽(yáng)性和陰性對(duì)照血清。（陰性對(duì)照血清可選可不選）。

（3）配制禽流感瓊脂凝膠免疫擴(kuò)散瓊脂：向裝有1升磷酸鹽緩沖溶液（0.01M，pH為7.2）的2升錐形瓶中加入9克瓊脂糖和80克氯化鈉。

可通過(guò)如下方式混合瓊脂：將混合物高壓滅菌10分鐘，從高壓滅菌器中取出后，通過(guò)旋轉(zhuǎn)的方式進(jìn)行混合，確保成分均勻混合；在電熱板上通過(guò)煮沸來(lái)溶解混合物，在加熱的過(guò)程中，用磁力攪拌棒使錐形瓶中的內(nèi)容物混合。沸騰后，讓瓊脂在室溫（約25℃）下冷卻10～15分鐘，然后將其轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿中。

可將瓊脂分裝成小份（日常工作容積），并在4℃下儲(chǔ)存在密閉容器中幾周，需要時(shí)再將其融化放入培養(yǎng)皿中。注意：當(dāng)觀察到瓊脂被雜菌感染或有沉淀物時(shí)，請(qǐng)勿使用。

（4）進(jìn)行瓊脂凝膠免疫擴(kuò)散。（i）檢測(cè)血清抗體。用容量為25毫升的移液管，將15至17毫升融化的瓊脂加入到100×15毫升的培養(yǎng)皿中，或?qū)?至6毫升的瓊脂加入到60×15毫升的培養(yǎng)皿中。瓊脂的厚度約為2.8毫米。

讓平皿在相對(duì)無(wú)塵的環(huán)境中冷卻，揭開(kāi)蓋子蒸發(fā)出水蒸氣。蓋子應(yīng)揭開(kāi)至少15分鐘，但不得超過(guò)30分鐘，因?yàn)樗终舭l(fā)可能會(huì)改變瓊脂電解液的濃度，從而對(duì)沉淀物線條有不利影響。注意：倒入瓊脂后，應(yīng)在24小時(shí)內(nèi)使用平皿。

記錄樣本編號(hào)、試劑批號(hào)、檢測(cè)日期和檢測(cè)及讀取檢測(cè)結(jié)果人員。

瓊脂硬化后，用模板將瓊脂切開(kāi)。100×15毫米的平板上最多可切出7個(gè)模板模式、60×15毫米的平板上最多可切出2個(gè)模板模式。

用一根12或14號(hào)插管將瓊脂膠塞吸開(kāi)，該插管通過(guò)一塊硅膠或一根橡膠管連接在支管燒瓶上，燒瓶通過(guò)管狀物連接在一個(gè)真空泵上。調(diào)整真空度，以便在取下瓊脂塞時(shí)，孔周圍的瓊脂不會(huì)受到干擾。

在準(zhǔn)備反應(yīng)孔時(shí)，用帶有吸頭的微量移液管，將50微升禽流感瓊脂凝膠免疫擴(kuò)散抗原加入到位于中心的孔中。將50微升的禽流感瓊脂凝膠免疫擴(kuò)散陽(yáng)性血清，分別加入到周圍三個(gè)孔中，且每?jī)蓚€(gè)孔之間間隔一個(gè)孔，然后在剩余的三個(gè)孔中各加入50微升待檢血清。這種安排能保證每一份待檢血清的旁邊都有一個(gè)陽(yáng)性對(duì)照組線條，從而為每一份待檢血清兩側(cè)沉淀物線條的形成做準(zhǔn)備（見(jiàn)圖1）。注意：一種圖案的測(cè)試血清孔中可包含陽(yáng)性、弱陽(yáng)性和陰性參照血清，以幫助闡釋結(jié)果（見(jiàn)圖2）。

填充完所有的孔后，將所有微孔板都蓋起來(lái)，讓微孔板放入封閉的反應(yīng)室中防止蒸發(fā)，并在室溫（大約25℃）下孵育24小時(shí)。應(yīng)在培養(yǎng)室中放一張濕紙巾以保證濕度。注意：移位過(guò)程中溫度的變化可能會(huì)導(dǎo)致不準(zhǔn)確的結(jié)果。

（ii）解釋檢測(cè)結(jié)果。將平皿放在黑色的背景上，取下蓋子并檢查反應(yīng)結(jié)果，并從下方成一定角度地用光源照亮平皿。顯微鏡發(fā)光器很有幫助，能夠調(diào)整照明位置和光照強(qiáng)度。

反應(yīng)的類型將隨待檢測(cè)樣本中抗體的濃度而變化。陽(yáng)性對(duì)照血清的沉淀線是讀取測(cè)試結(jié)果的依據(jù)。如果該線條不清晰，則試驗(yàn)無(wú)效，必須重做。會(huì)觀察到如下幾種類型的反應(yīng)（見(jiàn)圖3）：

陰性反應(yīng)。在試驗(yàn)樣品孔中，對(duì)照組線條繼續(xù)保持原樣，而不會(huì)彎曲或稍微發(fā)生彎曲，遠(yuǎn)離抗原孔，靠近陽(yáng)性對(duì)照組血清孔。

陽(yáng)性反應(yīng)。陽(yáng)性對(duì)照組線條與待檢血清和抗原之間的線相結(jié)合，或與之形成一條連續(xù)的線（同一線）。該線條的位置將取決于待檢血清中抗體的濃度。弱陽(yáng)性樣本可能不會(huì)在抗原和待檢血清之間產(chǎn)生一條完整的沉淀線，但可能只是引起對(duì)照組線條末端向內(nèi)彎曲，靠近待檢血清孔。

非特異性線條。偶爾在抗原和待檢血清孔之間會(huì)觀察到這些線。陽(yáng)性對(duì)照組線條會(huì)穿過(guò)非特異性線條，繼續(xù)進(jìn)入待檢血清孔。非特異性線條不會(huì)與陽(yáng)性對(duì)照組線條形成連續(xù)線。

免疫擴(kuò)散試驗(yàn)（圖1），中間孔中加入的是禽流感瓊脂凝膠免疫擴(kuò)散抗原；A和D孔中加入的是禽流感陽(yáng)性對(duì)照血清；B，C，E和F孔中加入的是禽流感陰性測(cè)試血清。

◎圖1

免疫擴(kuò)散試驗(yàn)（圖2），中間孔中加入的是禽流感瓊脂凝膠免疫擴(kuò)散抗原；A、C和E孔中加入的是禽流感陽(yáng)性對(duì)照血清；B，D和F孔中加入的是禽流感陰性測(cè)試血清。

◎圖2

免疫擴(kuò)散試驗(yàn)（圖3），中間孔中加入的是禽流感瓊脂凝膠免疫擴(kuò)散抗原；A、C和E孔中加入的是禽流感陽(yáng)性對(duì)照血清；B孔中加入的是禽流感陰性測(cè)試血清；D孔中加入的是禽流感陽(yáng)性測(cè)試血清；F孔中加入的是弱陽(yáng)性測(cè)試血清。

◎圖3

（b）酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）可用作禽流感篩查試驗(yàn)。只能使用聯(lián)邦許可的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒，并按照制造商說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。所有酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)陽(yáng)性血清樣本必須經(jīng)過(guò)瓊脂凝膠免疫擴(kuò)散試驗(yàn)的確認(rèn)，確認(rèn)試驗(yàn)需按照本節(jié)（a）段中的方法執(zhí)行。