羅欽文，王媛，高兢，毛學(xué)英

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京100083）

0 引言

糖尿病是當今社會一個重大的流行性疾病，其在全球的發(fā)病率連年升高，目前已成為世界上僅次于心腦血管疾病、腫瘤的第三位對人類健康有嚴重威脅的慢性疾病。國際糖尿病聯(lián)盟（IDF）發(fā)布的糖尿病地圖顯示，2017年全球已有4.25億人患有糖尿病，預(yù)計到2045年全球糖尿病患病人數(shù)將達到6.29億。其中，中國的成人糖尿病患者數(shù)量高達1.14億，位居第一位[1]。糖尿病主要分為一型糖尿病、二型糖尿病和妊娠期糖尿病，其中二型糖尿病最為普遍，占發(fā)病總?cè)藬?shù)的90%～95%[2-3]。目前糖尿病的治療以西藥為主，主要包括：磺脲類、雙胍類、噻唑烷二酮類、二肽基肽酶-Ⅳ抑制劑等[4]。但是，這些藥物都存在一定的副作用，如體重增加、骨質(zhì)流失、胃腸道不良反應(yīng)等[5-6]。因此，安全、無副作用的天然活性物質(zhì)成為目前降糖研究的一大熱點。在眾多的天然活性物質(zhì)中，生物活性肽因其安全性高、不良副作用小、生物活性多樣化而最受關(guān)注[7-8]。羊乳作為一種天然營養(yǎng)食品，富含蛋白質(zhì)、維生素、脂肪和礦物質(zhì)，蛋白質(zhì)的氨基酸組成也與母乳極為接近[9]。在近年的研究中發(fā)現(xiàn)，羊乳及其蛋白肽具有多種生物活性，如抑菌、降血壓、抗氧化、抗癌[10-13]。但是，關(guān)于羊乳蛋白肽改善胰島素抵抗的研究尚未見諸報道。因此，本研究采用風(fēng)味蛋白酶水解羊乳酪蛋白制備羊乳酪蛋白酶解物，以葡萄糖利用率和細胞內(nèi)糖原含量為指標評價其對高濃度葡萄糖誘導(dǎo)HepG2細胞胰島素抵抗的改善效果，以期為羊乳蛋白及其活性肽的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Hep G2細胞購自北京協(xié)和醫(yī)院；羊乳粉（內(nèi)蒙古華頤樂牧業(yè)科技有限公司）；M EM培養(yǎng)基；胎牛血清；青鏈霉素雙抗溶液（100×）；非必需氨基酸（100×）；0.25%胰蛋白酶（Gbico）；風(fēng)味蛋白酶（諾維信公司）；葡萄糖測定試劑盒（南京建成生物工程研究所）；糖原測定試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

1.2 儀器設(shè)備

DK-8B型電熱恒溫水浴鍋，F(xiàn)E20型pH計，TGL-20 M型低溫高速離心機，LGJ-12型真空冷凍干燥機，MCO-17 AC二氧化碳培養(yǎng)箱，DK-98-Ⅱ2KW型超凈工作臺，SCIENTZ-ⅡD細胞超聲破碎儀，iMarkTMMicroplate Reader酶標儀。

1.3 實驗方法

1.3.1 羊乳酪蛋白酶解物制備

將羊乳酪蛋白水化，調(diào)節(jié)溫度為55℃，pH為7.0，按照質(zhì)量分散為5%酶與底物比加入風(fēng)味蛋白酶水解，于0.25，0.50，0.75，1，2，3，4，5h時取樣，85℃ 15 min滅酶，凍干，得到羊乳酪蛋白酶解物。

1.3.2 水解度測定[14]

采用三硝基苯磺酸（TNBS）法測定羊乳酪蛋白酶解物的水解度。吸取0.5 mL的已滅酶的樣品，冷卻并轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，用1%十二烷基硫酸鈉（SDS）溶液定容靜置。取0.125 mL酶解液的SDS溶液與1 mL磷酸緩沖液（pH 8.2，0.2 mol/L）和1 mL的0.1%的TNBS溶液振蕩混合，于50℃水浴避光反應(yīng)60 min，反應(yīng)完畢之后，加入2 mL 0.1mol/L的HCl立即終止反應(yīng)，室溫放置30 min后，于420 nm下測定其吸光度值。0～5.0×10-3mol/L L-亮氨酸做標準曲線。按照公式(1)計算水解度。

式中：h——水解物中每克被裂解的肽鍵毫摩爾數(shù)（m eq/g protein）

htot——每克原料蛋白質(zhì)中的總的肽鍵毫摩爾數(shù)，酪蛋白為8.2 m eq/g protein

1.3.3 高濃度葡萄糖刺激H ep G2細胞建立胰島素抵抗模型[15]

將HepG2細胞以1×105個/μL的密度接入細胞培養(yǎng)板中，貼壁生長24 h后，加入終濃度為30 mmol/L的葡萄糖溶液，孵育24 h。最后加入終濃度為100 nmol/L的胰島素刺激30 min，即成功建立高濃度葡萄糖誘導(dǎo)的Hep G2細胞胰島素抵抗模型。

1.3.4 HepG2細胞葡萄糖利用率測定

采用葡萄糖氧化酶-過氧化物酶法測定葡萄糖含量。將HepG2細胞以1×105個/mL的密度接入96孔板中，貼壁24h。實驗組細胞添加刺激物和蛋白酶解物（終濃度為1.0 mg/mL），模型對照組添加刺激物，空白對照組添加等體積無菌PBS緩沖液，孵育24h。最后加入終濃度為100 nmol/L的胰島素刺激細胞30 min，吸取上層培養(yǎng)基，用葡萄糖測定試劑盒測定葡萄糖濃度，按公式二計算細胞葡萄糖利用率。

公式二：葡萄糖利用率（%）=(C1+C 2-C 3)/(C 1+C 2)×100%

式中：C 1—原培養(yǎng)基中葡萄糖含量（5.55 mmol/L）；

C 2—葡萄糖添加量；

C 3—上層培養(yǎng)基中的葡萄糖含量（mmol/L）

1.3.5 HepG2細胞內(nèi)糖原含量測定

將Hep G 2細胞以1×105個/mL的密度接入96孔板中，貼壁24 h。實驗組細胞添加刺激物和蛋白酶解物（終濃度為1.0 mg/mL），模型對照組添加刺激物，空白對照組添加等體積無菌PBS緩沖液孵育。最后加入終濃度為100 nmol/L的胰島素刺激細胞，吸取上層培養(yǎng)基，收集細胞，按照糖原測定試劑盒步驟測定細胞中的糖原含量。

1.3.6 體外模擬胃腸消化[16]

將羊乳酪蛋白酶解物溶于蒸餾水中，用1mol/L HC l調(diào)節(jié)p H值至2.0。加入胃蛋白酶（酶與底物質(zhì)量比為1：40），在37℃下振蕩孵育1.5 h。孵育結(jié)束后，取出一半溶液，80℃加熱20 min，凍干后得到胃消化樣品。另一半溶液用1 mol/L N aOH調(diào)節(jié)pH至7.5，加入胰酶（酶與底物質(zhì)量比為1∶100），在37℃下振蕩孵育2.5 h。之后溶液在80℃加熱20 min，凍干后得到胃腸消化樣品。

1.3.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行one-way ANOVA和Duncan's multiple-comparison test分析組間差異，以P〈0.05為顯著性，各組數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 羊乳酪蛋白酶解物對高糖刺激Hep G2細胞葡萄糖利用率的影響

利用風(fēng)味蛋白酶水解羊乳酪蛋白，不同時間酶解產(chǎn)物的水解度及其對HepG2細胞胰島素抵抗模型葡萄糖利用率的影響如圖1所示。隨著酶解時間的延長，羊乳酪蛋白酶解物的水解度逐漸增加。當濃度為0.25 mg/mL時，與羊乳酪蛋白處理組細胞相比，羊乳酪蛋白風(fēng)味蛋白酶酶解物處理組細胞的葡萄糖利用率顯著升高，表現(xiàn)出一定的改善胰島素抵抗的作用。這說明風(fēng)味蛋白酶的酶解作用促進了羊乳酪蛋白中活性序列的釋放。其中3 h酶解產(chǎn)物作用的細胞葡萄糖利用率最高，達到51.9±0.3%，與原蛋白處理組細胞相比提高了29.5%。因此，我們選用風(fēng)味蛋白酶3 h酶解產(chǎn)物進行后續(xù)實驗。

圖1 羊乳酪蛋白酶解物（風(fēng)味蛋白酶,3 h）水解度及對高糖刺激HepG2細胞葡萄糖利用率的影響

2.2 羊乳酪蛋白酶解物對高糖刺激HepG2細胞糖原含量的影響

羊乳酪蛋白酶解物對高糖刺激Hep G2細胞內(nèi)糖原含量的影響如圖2所示。30 mmol/L葡萄糖刺激Hep G2細胞后，細胞內(nèi)的糖原含量降低至空白對照組的61.9±2.9%。而0.25，0.5，1.0 mg/mL羊乳酪蛋白酶解物處理則顯著提高了細胞內(nèi)的糖原含量且呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng)（分別為空白對照組的70.3±2.5%，72.7±4.7%，83.3±4.0%）。說明羊乳酪蛋白酶解物能夠促進高糖刺激的HepG2細胞糖原合成，進而促使葡萄糖轉(zhuǎn)化為糖原，從而提高葡萄糖利用率。

圖2 羊乳酪蛋白酶解物（風(fēng)味蛋白酶,3 h）對高糖刺激HepG2細胞內(nèi)糖原含量的影響

2.3 模擬胃腸消化作用對羊乳酪蛋白酶解物促進葡萄糖利用活性的影響

胃腸模擬消化作用對羊乳酪蛋白酶解物促進葡萄糖利用活性的影響如圖3所示。當采用終濃度為0.25，0.5，1.0 mg/mL羊乳酪蛋白酶解物處理細胞后，胰島素抵抗模型細胞的葡萄糖利用率顯著升高，且呈現(xiàn)一定的劑量依賴效應(yīng)。羊乳酪蛋白酶解物經(jīng)模擬胃消化、模擬胃腸消化后，其促進葡萄糖利用的活性并未發(fā)生明顯改變。

圖3 胃腸模擬消化作用對羊乳酪蛋白酶解物促進葡萄糖利用活性的影響

2.4 模擬胃腸消化作用對羊乳酪蛋白酶解物促進糖原合成活性的影響

胃腸模擬消化作用對羊乳酪蛋白酶解物促進糖原合成活性的影響如圖4所示。當采用終濃度為0.25，0.5，1.0 mg/mL羊乳酪蛋白酶解物處理細胞后，胰島素抵抗模型細胞的糖原含量顯著升高，且呈現(xiàn)一定的劑量依賴效應(yīng)。羊乳酪蛋白酶解物經(jīng)模擬胃消化、模擬胃腸消化后，其促進糖原合成的活性并未發(fā)生明顯改變。

圖4 胃腸模擬消化作用對羊乳酪蛋白酶解物促進糖原合成活性的影響

3 討論

糖尿病是一種嚴重威脅人類健康的代謝性疾病，可導(dǎo)致神經(jīng)病變、腎病、視網(wǎng)膜病變以及心血管疾病等一系列的并發(fā)癥[17]。在機體內(nèi)，肝臟是攝取、儲存、合成和分解葡萄糖的主要場所，在維持血糖穩(wěn)定過程中起著非常重要的作用[18]。在糖尿病患者體內(nèi)，肝臟代謝發(fā)生改變，胰島素對糖原合成的促進作用和對糖異生的抑制作用降低，出現(xiàn)胰島素抵抗，進而造成高血糖癥[19]。已有多項研究表明，生物活性肽具有肝臟胰島素抵抗的功能。Boonloh等人研究了米糠蛋白水解物（RBP）對Hep G2細胞胰島素抵抗和炎癥反應(yīng)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RBP緩解了胰島素抵抗狀態(tài)下Hep G2細胞的葡萄糖利用損傷，抑制了炎癥反應(yīng)，并促進了AM PK信號通路的激活[20]。Song等人通過體外實驗研究表明，來源于酪蛋白糖巨肽的肽段IPPKKNQKTE能通過激活A(yù)M PK信號通路提高Hep G2肝細胞葡萄糖攝取和糖原合成水平，降低糖異生水平，進而改善肝細胞胰島素抵抗[15]。與以往的研究結(jié)果類似，在本實驗中，羊乳酪蛋白酶解物有效促進了高濃度葡萄糖誘導(dǎo)的Hep G2細胞的葡萄糖利用和糖原合成（圖1-圖2），說明其具有良好的體外改善胰島素抵抗活性。

生物活性肽由氨基酸組成，對存在于胃腸道中的蛋白酶具有非常強的敏感性，經(jīng)胃腸道消化后，其活性會減弱或增強[21]。因此，在生物活性肽開發(fā)利用過程中，胃腸消化穩(wěn)定性研究至關(guān)重要。體外模擬胃腸消化模型（SGM）是目前公認的一種初步確定肽的生物利用度的方法[22]。因此，在本研究中，我們測定了體外模擬胃腸消化后羊乳酪蛋白酶解物促進Hep G2細胞葡萄糖利用和糖原合成活性的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過胃消化、胃腸消化的羊乳酪蛋白酶解物處理組細胞與未經(jīng)消化的羊乳酪蛋白酶解物處理組細胞相比，其葡萄糖利用率和細胞內(nèi)糖原含量并無顯著變化（圖3-圖4）。說明在胃腸消化過程中，羊乳酪蛋白酶解物改善胰島素抵抗的活性并沒有破壞。

4 結(jié)論

本研究證明羊乳酪蛋白酶酶解物對高濃度葡萄糖誘導(dǎo)的HepG2細胞胰島素抵抗具有良好的改善效果。當濃度為0.25 m g/m L時，羊乳酪蛋白風(fēng)味蛋白酶酶解物處理組細胞葡萄糖利用率顯著高于羊乳酪蛋白原蛋白處理組細胞；羊乳酪蛋白酶解物還能顯著提高HepG2細胞胰島抵抗模型細胞內(nèi)的糖原含量。體外模擬胃腸消化作用對羊乳酪蛋白酶解物促進葡萄糖利用和糖原合成的活性并無顯著影響。本研究結(jié)果可為羊乳酪蛋白源生物活性肽的開發(fā)提高一定的理論依據(jù)。在后續(xù)研究中，本課題組將對羊乳酪蛋白酶解物進行分離純化，鑒定活性氨基酸序列，并對其改善胰島素抵抗的作用機制進行進一步研究。