遲濤，王玉堂，王劍飛

（1.黑龍江省綠色食品科學(xué)研究院哈爾濱150028；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗室哈爾濱150030）

0 引言

乳清蛋白是一種營養(yǎng)價值非常高的蛋白質(zhì)、容易消化吸收、并且還含有多種人體需要的活性成分和必需氨基酸，因此人們對乳清蛋白的應(yīng)用逐漸重視起來[1]。親水性糖基的導(dǎo)入能夠改善蛋白質(zhì)的一些功能特性，例如乳化性、溶解性、抗氧化性等[2]。而連接的具有親水特性的糖基分子是提高蛋白質(zhì)的溶解性的主要原因[3]。研究報道，美拉德反應(yīng)能夠提高蛋白質(zhì)的溶解性[4-7]。乳清分離蛋白與低甲基化果膠的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物，在pH 5.5時具有優(yōu)良的乳化穩(wěn)定性，這使乳清分離蛋白可用于酸性條件的應(yīng)用[8]。Song等將殼寡糖導(dǎo)入酪蛋白和大豆分離蛋白的研究表明，糖基化的蛋白產(chǎn)物的表觀粘度與未修飾蛋白相比有顯著的提高，同時具有凝膠時間縮短，凝膠溫度降低的特點(diǎn)[9]。Corzo-Martínez等人的研究表明，糖基化產(chǎn)物的表觀黏度和彈性模量隨著糖基化反應(yīng)程度的增加而增加[10]。美拉德反應(yīng)的產(chǎn)物會產(chǎn)生褐變，進(jìn)而影響產(chǎn)品的感官特性，因為許多糖基化產(chǎn)物的褐變是人們不愿意看到的，并且糖基化產(chǎn)物的營養(yǎng)價值也會受到影響。此外，由于糖基化產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，種類繁多，美拉德反應(yīng)所得到的糖基化產(chǎn)物在食品安全上也存在問題。

轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶是一種能催化酰基轉(zhuǎn)移反應(yīng)的酶，能夠催化蛋白質(zhì)分子中谷氨酰胺殘基與賴氨酸殘基中的ε-氨基發(fā)生反應(yīng)，因此形成分子內(nèi)和/或分子間賴氨酸異肽鍵，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，該反應(yīng)以蛋白質(zhì)多肽鏈中谷氨酰胺殘基的γ-酰胺基作為酰基供體，?；荏w為賴氨酸的ε-氨基。該反應(yīng)能夠使蛋白質(zhì)在溶解性、起泡性、流變學(xué)性質(zhì)等方面獲得改善。與TGase催化蛋白質(zhì)交聯(lián)的研究相比，用TGase催化蛋白質(zhì)的糖基化的研究比較少。由于糖基的導(dǎo)入使其蛋白質(zhì)的重要的功能性質(zhì)得到改善，基于酶法糖基化修飾蛋白質(zhì)的良好的應(yīng)用前景，以及這種修飾方法較強(qiáng)的可操控性，產(chǎn)物安全性的優(yōu)勢。本文擬采用乳清蛋白、氨基葡萄糖和殼寡糖為底物，利用TGase催化乳清蛋白與氨基葡萄糖、乳清蛋白與殼寡糖進(jìn)行共價交聯(lián)反應(yīng)，將氨基葡萄糖和殼寡糖導(dǎo)入乳清蛋白分子，并探討糖基化修飾乳清蛋白對其功能性的影響。目的為了確認(rèn)TGase催化乳清蛋白糖基化的可行性，開發(fā)一種新的降低乳清蛋白的修飾方法，從而拓寬乳清蛋白在食品工業(yè)中的應(yīng)用范圍。

2 材料與方法

2.1 材料與設(shè)備

乳清蛋白（Brewster公司，美國）；氨基葡萄糖鹽酸鹽，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶（江蘇一鳴精細(xì)化工有限公司）；其它均為化學(xué)純試劑。

旋轉(zhuǎn)流變儀（Gemini II，英國馬爾文公司）。

2.2 實(shí)驗方法

2.2.1 糖基化交聯(lián)修飾乳清蛋白的制備

反應(yīng)體系中乳清蛋白濃度50 g/L與氨基葡萄糖鹽酸鹽溶液混合，TGase添加量為10 U/g乳清蛋白，pH為7.5，37°C恒溫水浴震蕩反應(yīng)4 h。反應(yīng)結(jié)束后，取出樣品，置于85°C水浴鍋中滅酶5 min，冷卻。調(diào)節(jié)溶液pH值至5.0，加入等體積的無水乙醇8 000×g離心10 min，收集沉淀，乙醇洗兩次。

2.2.2 游離氨基含量的測定

取一定體積的0.6 g/L標(biāo)準(zhǔn)亮氨酸溶液，稀釋制得系列濃度的亮氨酸溶液（0、0.012、0.018、0.024、0.030、0.036 g/L），取稀釋液3 m L，與同體積的OPA溶液混合反應(yīng)5 min后，340 nm處測定溶液吸光度值。以亮氨酸濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值的平均值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。取其樣品稀釋液3 m L，按照上述步驟，測定其樣品吸光度值。

2.2.3 乳化性的測定

用0.1 mol·L-1的磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）溶解乳清蛋白樣品。將樣品溶液與大豆油混合（90∶30，V/V），在12 000 r/min條件下均質(zhì)1 min。分別在0 min和靜止10 min時取50μL乳液置于試管中，加入5 m L 1 g/L的SDS溶液混合均勻，在500 nm處下測定吸光度值。乳化活性指數(shù)（EAI）及乳化穩(wěn)定性指數(shù)（ESI）為：

式中：A0——零時刻的吸光度值；C——蛋白質(zhì)濃度（g/m L）；φ——油相體積分?jǐn)?shù)（0.25）；A10——靜置10 min后的吸光度值。

2.2.4 吸水性和吸油性

吸水性：離心管中加入0.5 g乳清蛋白樣品，加入3 m L蒸餾水，勻速攪拌1 min，使蛋白樣品與水充分接觸，將離心管在室溫下放置60 min，讓蛋白樣品充分吸水。然后5 000×g離心20 min，緩慢倒出上清液，稱量離心管與沉淀的重量。持水性（WHC）按照下式計算：

式中：O0——加入蛋白質(zhì)干重（g）；O1——離心管與干燥的蛋白質(zhì)重量之和（g）；O2——離心管與離心后沉淀重量之和（g）。

2.2.5 流變性

配制p H=7.0的蛋白質(zhì)分散液，乳清蛋白、交聯(lián)交聯(lián)乳清蛋白、氨基葡萄糖糖基化交聯(lián)交聯(lián)乳清蛋白和殼寡糖糖基化交聯(lián)乳清蛋白的濃度分別為15%、15%、7%、7%。測定時，將樣品分散液緩慢傾注充滿夾具中（直徑60 mm、錐角 0.5°的錐板），在25°C保溫5 min。測定頻率在0.1～10 s-1時測試樣品的表觀黏度。

配制pH=7.0的蛋白質(zhì)分散液，乳清蛋白、交聯(lián)交聯(lián)乳清蛋白、氨基葡萄糖糖基化交聯(lián)交聯(lián)乳清蛋白和殼寡糖糖基化交聯(lián)乳清蛋白的濃度分別為15%、15%、7%、7%的分散液緩慢傾注充滿夾具中（直徑60 mm、錐角0.5°的錐板），在25°C保溫5 min。首先通過低振幅振蕩測試確定樣品分散液的線性黏彈區(qū)的應(yīng)力振幅值（strain）。在剪切頻率0.1～10 H z范圍進(jìn)行頻率掃描試驗，分析樣品分散液的彈性模量（G′）和黏性模量（G″）隨剪切頻率的變化。

2.2.6 數(shù)據(jù)分析

本研究中所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。采用SPSS 16.0軟件中的單因素方差分析（One-way AVONA）和Duncan多重比較法進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。用Excel（2007）軟件繪制圖示。

式中：W0——加入蛋白質(zhì)干重（g）；W1——離心管與干燥的蛋白質(zhì)重量之和（g）；W2——離心管與離心后沉淀重量之和（g）。

吸油性：稱取0.5 g蛋白質(zhì)樣品于離心管中，然后加入5 m L精制大豆油，勻速攪拌1 min，使蛋白樣品充分與油接觸，在室溫下放置30 min后，5000×g離心20 min。將未吸附的油緩慢倒出，再進(jìn)行稱重。蛋白質(zhì)的吸油性（OAC）按照下式計算：

3 結(jié)果與分析

3.1 游離氨基含量的變化

乳清蛋白修飾產(chǎn)物的游離氨基含量的變化如表1所示。氨基葡萄糖糖基化交聯(lián)乳清蛋白的游離氨基含量（0.62 mol/kg蛋白質(zhì)）和殼寡糖糖基化交聯(lián)乳清蛋白的游離氨基含量（0.61 mol/kg蛋白質(zhì)）明顯低于乳清蛋白的游離氨基含量（0.70 m o l/kg蛋白質(zhì)）和交聯(lián)乳清蛋白的游離氨基含量（0.67 m o l/kg蛋白質(zhì)）。氨基葡萄糖糖基化交聯(lián)乳清蛋白的游離氨基含量與殼寡糖糖基化交聯(lián)乳清蛋白的游離氨基含量在數(shù)據(jù)統(tǒng)計上沒有顯著差異（0.62 vs.0.61 m o l/kg蛋白質(zhì)）。游離氨基含量的減少，主要是由于乳清蛋白的賴氨酸中的ε-氨基參與了蛋白質(zhì)自身的交聯(lián)。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶在催化氨基葡萄糖和殼寡糖導(dǎo)入乳清蛋白的過程中，同時乳清蛋白分子發(fā)生了自身的交聯(lián)反應(yīng)。反應(yīng)體系中糖的變化對糖基化交聯(lián)修飾程度并沒有顯著性的影響。

表1 乳清蛋白修飾產(chǎn)物游離氨基含量的變化

3.2 糖基化對修飾產(chǎn)物乳化性質(zhì)的影響

利用比濁法對乳清蛋白、交聯(lián)乳清蛋白以及糖基化交聯(lián)乳清蛋白修飾產(chǎn)品的乳化活性和乳化穩(wěn)定性進(jìn)行了評價，其結(jié)果如圖1所示，與原料乳清蛋白相比轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶催化的乳清蛋白修飾產(chǎn)物的乳化活性和乳化穩(wěn)定性都下降，然而轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶催化的糖基化乳清蛋白的乳化活性和乳化穩(wěn)定性下降的更多，并且下降的比例隨著導(dǎo)入糖基分子的增大而增大。

圖1 乳清蛋白及其修飾產(chǎn)物乳化活性及乳化穩(wěn)定性

3.3 糖基化對修飾產(chǎn)物吸水吸油性的影響

乳清蛋白及其轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶催化的修飾產(chǎn)物的吸水性和吸油性的結(jié)果如表2所示。與原料乳清蛋白相比，交聯(lián)乳清蛋白、氨基葡萄糖糖基化的乳清蛋白和殼寡糖乳清蛋白持水性分別提高了23.25%、24.25%和53%。在持油性方面，與原料乳清蛋白相比，交聯(lián)乳清蛋白的持油性幾乎不變，然而氨基葡萄糖糖基化乳清蛋白和殼寡糖糖基化乳清蛋白的持油性分別提高了1.5倍和2.85倍。通過以上的數(shù)據(jù)結(jié)果可以表明轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶催化的糖基化交聯(lián)修飾乳清蛋白能夠顯著的提高其持水和持油能力。然而也有一些研究結(jié)果表明，由于親水性的糖基的導(dǎo)入能夠提高蛋白質(zhì)的持水能力同時持油性增加大豆蛋白糖基化交聯(lián)修飾能夠顯著的提高大豆蛋白的持水能力，同時吸油能力也有所提高[11]，與本研究結(jié)果一致。

表2 乳清蛋白蛋白及其修飾產(chǎn)物的吸水性和吸油性

3.4 流變性

濃度分別為15%、15%、7%、7%的乳清蛋白、交聯(lián)乳清蛋白、氨基葡萄糖修飾乳清蛋白、殼寡糖修飾乳清蛋白的0.1～10s-1剪切速率下的表觀黏度曲線如圖2所示。圖2的數(shù)據(jù)表明，四種蛋白樣品的表觀黏度隨著剪切速率的增加而逐漸降低，表現(xiàn)為非牛頓流體狀態(tài)。四種蛋白樣品的表觀粘度的大小為：7%的殼寡糖糖基化的乳清蛋白〉7%的氨基葡萄糖糖基化乳清蛋白〉15%的交聯(lián)乳清蛋白〉15%的原料乳清蛋白。由此可見，殼寡糖糖基化的乳清蛋白的表觀黏度必然為最大。上述的結(jié)果表明，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶催化的乳清蛋白交聯(lián)作用導(dǎo)致了蛋白質(zhì)分子體積的增加，并且增加了蛋白質(zhì)分散液的表觀黏度，隨著剪切速率逐漸增加，蛋白質(zhì)分子的表觀體積減小，交聯(lián)乳清蛋白表現(xiàn)出剪切稀釋特性。然而對于糖基化修飾的乳清蛋白而言，由于糖基具有很好的親水性，所以糖基的導(dǎo)入增加了其表觀黏度[12]，其表觀黏度增加的大小與導(dǎo)入糖基分子的大小呈正比。研究表明，美拉德反應(yīng)能夠改變蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)[13]，乳清分離蛋白與木糖、葡萄糖、果糖、乳糖等發(fā)生美拉德反應(yīng)后，糖基化后的產(chǎn)物的無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)增加，并且無規(guī)則卷曲隨著糖分子的增大而增加[14]。從而導(dǎo)致不同結(jié)構(gòu)的糖基化產(chǎn)物界面性質(zhì)的差異。

在0.1～10 Hz的頻率范圍內(nèi)，測定了乳清蛋白(A)、交聯(lián)乳清蛋白(B)、氨基葡萄糖糖基化乳清蛋白(C)、殼寡糖糖基化乳清蛋白的黏彈性(D)，其濃度與測定表觀黏度的濃度一致，分別為15%、15%、7%、7%，四種分散液的彈性模量（G′）和黏性模量（G″）隨剪切頻率的變化如圖3所示。

圖2 乳清蛋白及其修飾產(chǎn)品分散液的表觀黏度

圖3 殼寡糖糖基化乳清蛋白及其修飾產(chǎn)物分散液的黏彈性變化曲線

從圖3a可以看出，在0.1～1H z時乳清蛋白的分散液的黏性模量高于彈性模量，表現(xiàn)為液體特性，當(dāng)頻率在1～10Hz時分散液的彈性模量高于黏性模量，表現(xiàn)為固體特性。從圖3 b、c和d中可以看出乳清蛋白修飾產(chǎn)物分散液的彈性模量均高于黏性模量，彈性模量占主導(dǎo)，表明各分散液明顯顯現(xiàn)出本身的固態(tài)性質(zhì)。在0.1～10H z的頻率范圍內(nèi)乳清蛋白修飾產(chǎn)物的黏性模量和彈性模量隨著頻率的增加而增加并且糖基化交聯(lián)修飾的乳清蛋白的彈性模量和黏性模量均高于交聯(lián)的乳清蛋白。殼寡糖糖基化乳清蛋白的彈性模量和黏性模量最高。通過流變學(xué)研究結(jié)果可以顯示從乳清蛋白到交聯(lián)乳清蛋白到修飾乳清蛋白，其分散液經(jīng)歷了從溶液到黏液的轉(zhuǎn)變，表明轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的催化修飾作用能夠?qū)е氯榍宓鞍桩a(chǎn)品內(nèi)部結(jié)構(gòu)上的差異。糖基化交聯(lián)修飾導(dǎo)致乳清蛋白的黏彈性質(zhì)發(fā)生了明顯的改變。María Julia Spotti等人的通過美拉德反應(yīng)的糖基化乳清蛋白的流變性的研究中也得到了相似的結(jié)論[15]。

4 結(jié)論

糖基化交聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致了乳清蛋白修飾產(chǎn)物的持水性、吸油性發(fā)生顯著變化。但其乳化性顯著下降。此外糖基化交聯(lián)修飾乳清蛋白的流變性也發(fā)生了顯著的變化，其表觀黏度和動態(tài)模量都顯著性的增加。