汪超，李阜爍，林文珍，陸文昊，范夢珠，陳平，洪志駿，張少輝，

（1.上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，上海200240；2.浙江熊貓乳業(yè)集團股份有限公司，浙江溫州325800；3.浙江輝肽生命健康科技有限公司,浙江溫州325800）

0 引言

牛乳中含有豐富的蛋白質(zhì)，這些蛋白被分解后產(chǎn)生的多肽具有多種生物活性，包括抗菌性、抗氧化性、免疫調(diào)節(jié)活性、抗高血壓、抗炎癥、抗衰老等[1-4]。牛乳蛋白中酪蛋白的占比達到80%，是乳源性多肽的重要來源，以其作為底物能夠得到很多具有不同生物活性的多肽[5-8]。

目前，乳源性多肽的制取方法主要有兩種：通過乳酸菌發(fā)酵制備，或利用胃蛋白酶、胰凝乳蛋白酶等消化酶進行酶解制備[9-10]。瑞士乳桿菌屬于水解性能較強的乳酸菌，在其發(fā)酵過程中能夠產(chǎn)生豐富的多肽[8,11,12]。

本文結(jié)合乳酸菌發(fā)酵和蛋白酶水解兩種方法，通過菌酶協(xié)同的發(fā)酵方式，以多肽產(chǎn)量為考察指標(biāo)，選擇胃蛋白酶、復(fù)合胰蛋白酶、酸性蛋白酶3種不同的酶作為輔助酶制劑，用瑞士乳桿菌CICC6024作為發(fā)酵菌種，研究了發(fā)酵時間、酶用量、發(fā)酵溫度三個因素對酪蛋白源多肽制備的影響，并通過Box-Behnken響應(yīng)面法對工藝參數(shù)進行了優(yōu)化，為酪蛋白源多肽的生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 實驗

1.1 材料與試劑

MRS培養(yǎng)基，酪蛋白，乳糖、胃蛋白胨Peptone（來源于酪蛋白），瑞士乳桿菌（CICC 6024），酸性蛋白酶（酶活力1×105U/g），胃蛋白酶（酶活力4×105U/g），復(fù)合胰蛋白酶（酶活力2×105U/g），氯化鈉（N aC l），等。

1.2 儀器與設(shè)備

3 ku超濾管，JB-VS-1300U超凈工作臺，LRH-250F生化培養(yǎng)箱，GI36T高壓滅菌鍋，F(xiàn)rom a 700低溫冰箱，RO 15純水系統(tǒng)，GL-22M高速冷凍離心機，Tecan Infinite M200 PRO酶標(biāo)儀。

1.3 方法

1.3.1 瑞士乳桿菌的純化

取少量瑞士乳桿菌C ICC 6024菌粉，接種到M RS液體培養(yǎng)基中，于37℃下培養(yǎng)24 h。用M RS培養(yǎng)基，將菌液進行梯度稀釋后，取合適濃度菌液于MRS瓊脂培養(yǎng)基上（瓊脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.4%）涂布培養(yǎng)，繼續(xù)培養(yǎng)48 h至長出明顯的菌落。挑取單菌落至M RS液體培養(yǎng)基中進行富集培養(yǎng)，繼續(xù)活化3次后使用和保存。

1.3.2 酶溶液的制備

根據(jù)酸性蛋白酶、胃蛋白酶、復(fù)合胰蛋白酶不同酶活性，分別稱取0.5，0.125，0.25 g酶制劑；溶于10 mL滅菌RO水，配制得到酶活力為5 000 U/mL的酶溶液，依次通過0.45μm濾膜、0.22μm濾膜進行過濾除菌，得到酶溶液待用，每次現(xiàn)制現(xiàn)用。

1.3.3 發(fā)酵液的制備

按實驗室之前的研究成果[13]，最適的酪蛋白培養(yǎng)液成分為8%酪蛋白、6%乳糖、0.5%N aCl（均為質(zhì)量分?jǐn)?shù)），最適pH值為6.5，按此條件配置酪蛋白培養(yǎng)液，(95±1)℃殺菌5 min，冰水浴冷卻至(37±1)℃。其后接種活化菌液，接種量為6%（體積分?jǐn)?shù)），并按比例加入酶溶液，37℃靜置發(fā)酵得發(fā)酵液，（95±1）℃水浴加熱5 min滅酶，冰水浴快速冷卻，4℃冷藏待用。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

參考文獻[14]中的方法，采用Folin-酚法測定多肽濃度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

稱取N a2CO3為1 g，N aOH為0.2 g，酒石酸鉀鈉（KNaC4H4O6·4 H2O）為0.025 g，充分溶解于RO水中，定容至50 mL，即為A液；稱取0.05 g硫酸銅（Cu-SO4·5H2O）溶解于RO水中，定容至10 m L，即為B液，A液和B液于4℃冰箱中保存。A液和B液以體積比50∶1混合，即得到試劑甲，每次現(xiàn)配現(xiàn)用。

稱取Peptone 150 m g，充分溶解于RO水中，定容至50 m L，配制成濃度為3 mg/m L的標(biāo)準(zhǔn)肽溶液。用RO水及標(biāo)準(zhǔn)溶液配制成質(zhì)量濃度分別為0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 g/L的肽溶液。分別吸取以上各質(zhì)量濃度的肽溶液30 uL于96孔板中，設(shè)置5個平行。每孔加入150 uL試劑甲，迅速振蕩，于室溫下（20～25℃）靜置10 min，再逐孔加入15 uL試劑乙（Fo lin-酚試劑），立即混勻，室溫下避光靜置30 min。用酶標(biāo)儀測定各孔中溶液500 nm處的吸光值（OD500），以肽濃度為橫坐標(biāo)，OD500值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.5 多肽的提取

取10 m L發(fā)酵液，在8 800 g（4℃低溫條件下）離心30 min，棄沉淀取上清。得到的上清液用3 ku超濾膜超濾，超濾離心條件為2 500 g，4℃，30 min；收集底部超濾液即得到混合多肽溶液，保存于4℃冰箱中待用。

1.3.6 多肽質(zhì)量濃度的測定

參考文獻[14]中的方法，并做了適當(dāng)修改，具體步驟如下。對混合肽溶液進行5倍、10倍稀釋，取各稀釋液用1.3.4中所述方法測定吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算肽質(zhì)量濃度，其計算為

式中：C為實際多肽液質(zhì)量濃度；C0為多肽稀釋液測定所得質(zhì)量濃度；N為稀釋因子。

1.3.7 蛋白酶的篩選

選擇酸性蛋白酶、復(fù)合胰蛋白酶、胃蛋白酶3種蛋白酶進行實驗。在接種瑞士乳桿菌的同時加入蛋白酶溶液，接種量6%(體積分?jǐn)?shù))，蛋白酶用量20 U/m L，37℃發(fā)酵24 h，期間每隔2 h取1次樣品，進行多肽質(zhì)量濃度的檢測。

1.3.8 單因素實驗

根據(jù)試驗結(jié)果篩選確定最佳蛋白酶后，在蛋白酶用量20 U/m L，發(fā)酵溫度37℃的條件下，研究發(fā)酵時間（0，2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24 h）對多肽產(chǎn)量的影響；在發(fā)酵時間8 h，發(fā)酵溫度37℃的條件下，研究蛋白酶用量（0，20，40，60，80，100，120，140，160 U/m L）對多肽產(chǎn)量的影響；在發(fā)酵時間8 h，蛋白酶用量60 U/m L的條件下，研究發(fā)酵溫度（31，34，37，40，43℃）對多肽產(chǎn)量的影響。確定最佳單因素。

1.3.9 響應(yīng)面優(yōu)化實驗

根據(jù)Box-Behnken實驗設(shè)計原理，在單因素試驗的基礎(chǔ)上進行響應(yīng)面法優(yōu)化試驗，以多肽產(chǎn)量為指標(biāo)，確定最佳工藝參數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 多肽質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線

邢美孜等人對Fo lin-酚法做出了針對性的改良，使其更適用于多肽濃度的測定。研究了多肽濃度測定用標(biāo)準(zhǔn)曲線的最適標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，對BSA、胰蛋白酶降解產(chǎn)物Tryptone和胃蛋白酶降解產(chǎn)物Peptone三種物質(zhì)進行比較分析后，確定了Peptone為最佳標(biāo)準(zhǔn)物[14]。參考其方法繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。

圖1 多肽濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線

回歸方程為y=0.0604x+0.0073，R2=0.9916。由此可知，Peptone質(zhì)量濃度在0～3.0 g/L之間時，其質(zhì)量濃度與吸光度之間具有較好的線性關(guān)系。因此，將該曲線作為后續(xù)實驗的多肽濃度測定用標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.2 蛋白酶的篩選

胃蛋白酶、復(fù)合胰蛋白酶是酶解法制備乳源生物活性肽的常用蛋白酶[9,15]，故選擇該兩種酶進行菌酶協(xié)同發(fā)酵試驗。另外，考慮到菌酶協(xié)同發(fā)酵時的特殊環(huán)境，培養(yǎng)液的pH值會隨著時間的延長而不斷降低，故又選擇添加了酸性蛋白酶進行對比實驗。

菌酶協(xié)同發(fā)酵過程中，發(fā)酵時間和不同的蛋白酶對多肽產(chǎn)量的影響如圖2所示。從結(jié)果可以看出，發(fā)酵時間在6 h以內(nèi)時，胃蛋白酶組、酸性蛋白酶組和不加酶組的多肽產(chǎn)量差異不大，胰蛋白酶組多肽產(chǎn)量較高，但和8 h處的多肽產(chǎn)量相比，仍有較大差距。說明在發(fā)酵初期，不同蛋白酶的加入對多肽產(chǎn)量的影響均不大。這個結(jié)果可能與蛋白酶的適宜pH值有關(guān)，培養(yǎng)液的初始pH值為6.5，該條件下胰蛋白酶活性較強，酸性蛋白酶活性不強，而胃蛋白酶基本無活性。當(dāng)發(fā)酵時間超過6 h之后，各實驗組的多肽產(chǎn)量均快速提高，8 h之后，酸性蛋白酶組多肽產(chǎn)量明顯優(yōu)于其他三組，故選擇酸性蛋白酶用于后續(xù)實驗。

2.3 單因素試驗

2.3.1 發(fā)酵時間對多肽質(zhì)量濃度的影響

由圖2可知，發(fā)酵初期多肽產(chǎn)量變化不大，發(fā)酵時間超過6 h后，多肽產(chǎn)量出現(xiàn)明顯增加，8～24 h之間，多肽產(chǎn)量呈現(xiàn)出上下波動的趨勢。在16 h處多肽產(chǎn)量達最高值，質(zhì)量濃度為（6.10±0.20）g/L，但統(tǒng)計分析結(jié)果表明，其與8，14，18 h三個時間的多肽產(chǎn)量均無顯著性差別（P＞0.05）。

這可能是由于在瑞士乳桿菌與蛋白酶的協(xié)同發(fā)酵過程中，瑞士乳桿菌的發(fā)酵作用是主要因素，外源蛋白酶只起到輔助作用。前期瑞士乳桿菌的增殖處于遲緩期，培養(yǎng)液酸度不夠，故而多肽產(chǎn)量變化不大，6 h后進入瑞士乳桿菌的對數(shù)期，多肽產(chǎn)量出現(xiàn)快速提高。這與Ahtesh[16]等人在研究Flavourzym e與幾種益生菌的協(xié)同發(fā)酵時得到的結(jié)果類似。后期多肽濃度出現(xiàn)波動可能是由于多肽被瑞士乳桿菌吸收利用所導(dǎo)致的。根據(jù)試驗結(jié)果，結(jié)合生產(chǎn)效率的考量，確定發(fā)酵8 h為最佳發(fā)酵時間，此時多肽產(chǎn)量為（5.77±0.14）g/L。

圖2 不同蛋白酶及發(fā)酵時間對多肽產(chǎn)量的影響

2.3.2 酶用量對多肽質(zhì)量濃度的影響

實驗結(jié)果見圖3。根據(jù)實驗結(jié)果，不同劑量的酸性蛋白酶都有助于提高多肽產(chǎn)量，最佳蛋白酶用量為60 U/m L，此條件下，多肽產(chǎn)量為（6.19±0.19）g/L。當(dāng)酸性蛋白酶用量較少，在20～60 U/m L之間時，多肽產(chǎn)量隨著酶用量的提高而增加；當(dāng)用量高于60 U/m L后，多肽產(chǎn)量呈現(xiàn)出波動下降的趨勢。這可能是因為少量的外源性酸性蛋白酶能夠提高瑞士乳桿菌菌群的生理活性，促進多肽的產(chǎn)生。而過多的外源性蛋白酶會破壞菌群自身產(chǎn)生的蛋白酶系[17]，影響瑞士乳桿菌的生理活動，使多肽產(chǎn)量下降。

圖3 蛋白酶用量對多肽產(chǎn)量的影響

2.3.3 發(fā)酵溫度對多肽質(zhì)量濃度的影響

實驗結(jié)果見圖4。根據(jù)實驗結(jié)果，發(fā)酵溫度對多肽產(chǎn)量影響較大。隨著溫度的提高，多肽產(chǎn)量呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢。當(dāng)溫度達到37℃時，多肽產(chǎn)量達到最高，為（6.18±0.10）g/L。值得注意的是，當(dāng)發(fā)酵溫度為40℃時，多肽產(chǎn)量下降并不明顯，隨著溫度的繼續(xù)升高，多肽產(chǎn)量出現(xiàn)較大幅度的下降。這可能是由于40℃下瑞士乳桿菌的活性比37℃時更強，菌體繁殖更快，但發(fā)酵過程中產(chǎn)生的多肽被進一步降解和利用，以滿足菌體自身的營養(yǎng)需求[18-19]，所以多肽產(chǎn)量出現(xiàn)小幅下降。而當(dāng)溫度持續(xù)上升后，超過菌體的適宜生長溫度，多肽產(chǎn)量開始明顯下降。

圖4 發(fā)酵溫度對多肽產(chǎn)量的影響

由單因素試驗結(jié)果可知，酸性蛋白酶與瑞士乳桿菌協(xié)同發(fā)酵的最佳條件為：發(fā)酵時間8 h，酸性蛋白酶用量60 U/m L，發(fā)酵溫度37℃。以此結(jié)果為基礎(chǔ)，進行響應(yīng)面優(yōu)化實驗。

2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化產(chǎn)肽工藝參數(shù)

2.4.1 響應(yīng)面實驗設(shè)計與結(jié)果

以單因素實驗結(jié)果為基礎(chǔ)，采用Box-Behnken中心組合設(shè)計原理，以發(fā)酵時間（X1）、酶用量（X2）、發(fā)酵溫度（X3）為自變量，以多肽產(chǎn)量為響應(yīng)值進行響應(yīng)面實驗設(shè)計，實驗設(shè)計及結(jié)果如表1所示。

采用Design-Expert 8.0.6對試驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，得到的回歸方程為

表1 Box-Behnken實驗設(shè)計與結(jié)果

具體分析結(jié)果如表2所示。

表2 響應(yīng)面實驗?zāi)Ｐ头讲罘治?/p>

由表2可以看出，回歸方程模型顯著性檢測P〈0.0001，極顯著，表明該回歸方程模型具有統(tǒng)計學(xué)意義；失擬項P=0.8202〉0.05，差異不顯著，表明擬合情況良好，未知因素對實驗結(jié)果的影響較小。該模型的確定系數(shù)R2=0.9845，調(diào)整系數(shù)R2Adj=0.9646，說明該模型能解釋96.46%響應(yīng)值的變化，擬合度較好，試驗誤差較小，可以用此模型對多肽產(chǎn)量進行分析和預(yù)測。由顯著性檢驗可知，一次項X1，X2，X3；交互項為X2X3；平方項為X21和X23均為極顯著；交互項為X1X2和X1X3；平方項X22為不顯著。

2.4.2 響應(yīng)面分析與條件優(yōu)化

發(fā)酵時間、酶用量、發(fā)酵溫度三個因素之間交互作用的響應(yīng)面和等高線如圖5-圖7所示。

圖5 發(fā)酵時間和蛋白酶用量的響應(yīng)面和等高線圖（X 3=37℃）

圖6 發(fā)酵時間和發(fā)酵溫度的響應(yīng)面和等高線圖（X2=60 U/m L）

圖7 發(fā)酵溫度和蛋白酶用量的響應(yīng)面和等高線圖（X1=8 h）

由圖5可以看出，發(fā)酵溫度固定為37℃時，多肽產(chǎn)量隨著酶用量的增加而不斷提高，發(fā)酵時間小于8 h時，增長較快，而當(dāng)發(fā)酵時間超過8 h后，多肽產(chǎn)量的增長趨勢減緩；隨著發(fā)酵時間的延長，多肽產(chǎn)量先上升后下降，酶用量低于60 U/m L時，下降趨勢明顯，酶用量高于60 U/m L時，下降幅度很小。根據(jù)模型分析的結(jié)果，發(fā)酵時間和酶用量的交互作用不顯著。

由圖6可以看出，蛋白酶用量固定為60 U/m L時，隨著發(fā)酵溫度的升高，多肽產(chǎn)量不斷提高，隨著發(fā)酵時間的延長呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，發(fā)酵溫度低于37℃時，下降趨勢明顯，發(fā)酵溫度高于37℃時，下降趨勢較小。根據(jù)模型分析的結(jié)果，發(fā)酵時間與發(fā)酵溫度之間的交互作用也為不顯著。

由圖7可以看出，發(fā)酵時間固定為8 h時，發(fā)酵溫度低于37℃時，隨著酶用量的增加，多肽產(chǎn)量不斷提高，而發(fā)酵溫度高于37℃時，多肽產(chǎn)量基本處于平穩(wěn)狀態(tài)，酶用量增加帶來的效果并不明顯；隨著發(fā)酵溫度的升高，多肽產(chǎn)量先上升后趨于平穩(wěn)，酶用量低于60 U/m L時平穩(wěn)階段到來較晚，酶用量高于60 U/m L時平穩(wěn)階段到來較早。根據(jù)模型分析的結(jié)果，發(fā)酵溫度與酶用量的交互作用極顯著。

根據(jù)模型分析的結(jié)果，發(fā)酵時間、酶用量、發(fā)酵溫度三個因素的影響作用由大到小排列依次為發(fā)酵溫度＞發(fā)酵時間＞酶用量。通過模型優(yōu)化，得到的最佳產(chǎn)肽工藝參數(shù)為：發(fā)酵時間8.78 h，蛋白酶用量59.28 U/m L，發(fā)酵溫度39.62℃，此條件下理論多肽產(chǎn)量為7.07 g/L。

2.4.3 工藝參數(shù)驗證試驗

為了驗證響應(yīng)面優(yōu)化法所得結(jié)果的準(zhǔn)確性，采用上述工藝參數(shù)進行多肽的制備?？紤]到實驗可操作性，將實際的工藝調(diào)整為發(fā)酵時間8.8 h，酶用量59 U/m L，發(fā)酵溫度為39.6℃，最終得到的多肽產(chǎn)量為（7.11±0.07）g/L，與模型估計值7.07 g/L相比，相對誤差為0.57%，小于5%，響應(yīng)面法所得的優(yōu)化條件參數(shù)準(zhǔn)確可靠，該模型具有實用價值。

3 結(jié)論

本實驗以酪蛋白為原料，以瑞士乳桿菌為發(fā)酵菌種，輔助添加蛋白酶，研究確定菌酶協(xié)同發(fā)酵對酪蛋白源多肽產(chǎn)量的影響。通過比較不同蛋白酶對提高多肽產(chǎn)量的促進效果，篩選出制備酪蛋白源多肽的最佳蛋白酶為酸性蛋白酶。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，用響應(yīng)面法進行參數(shù)優(yōu)化，根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗設(shè)計原理，得到了多肽產(chǎn)量與發(fā)酵時間、酶用量和發(fā)酵溫度的回歸模型。發(fā)現(xiàn)發(fā)酵時間、酶用量、發(fā)酵溫度以及酶用量和發(fā)酵溫度的交互作用對多肽產(chǎn)量的影響均為極顯著（P＜0.01）。確定最佳工藝參數(shù)為：發(fā)酵時間8.8 h，酶用量59 U/m L，發(fā)酵溫度39.6℃。在此條件下多肽產(chǎn)量為(7.11±0.07)g/L。與原工藝只用瑞士乳桿菌發(fā)酵相比，產(chǎn)量提高73.84%。此結(jié)果為今后酪蛋白源多肽的生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)，有助于酪蛋白源多肽生物活性的研究。