李孟湛，尹紅菊，李丁丁，劉亞琪，王鎖民

(蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,蘭州大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部草牧業(yè)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院,甘肅 蘭州 730020)

植物受到外界高鹽、干旱、高溫等逆境時(shí)，脅迫信號(hào)在細(xì)胞內(nèi)通過(guò)一系列地傳遞，最終激發(fā)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)；轉(zhuǎn)錄因子與相應(yīng)的順式作用元件結(jié)合后，從而特異性地啟動(dòng)應(yīng)答基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，與植物脅迫反應(yīng)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子主要有以下幾個(gè)家族：MYB、bZIP、WRKY、NAC類轉(zhuǎn)錄因子家族等。其中，MYB家族作為植物最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，在植物抵抗非生物脅迫過(guò)程中發(fā)揮著重要功能。

研究者在模式植物擬南芥(Arabidopsisthaliana)中首次發(fā)現(xiàn)了受脫落酸(abscisic acid, ABA)顯著誘導(dǎo)的AtMYB2基因，其編碼蛋白可參與調(diào)節(jié)脫水響應(yīng)基因RD22的表達(dá)[3]。近幾年先后從擬南芥、水稻(Oryzasativa)等植物中鑒定出一批參與非生物逆境響應(yīng)的MYB轉(zhuǎn)錄因子，并對(duì)其作用機(jī)理進(jìn)行了深入研究。如Dai等[4]在擬南芥中過(guò)量表達(dá)水稻OsMYB3R-2基因可顯著提高植株對(duì)冷、干旱和鹽脅迫的耐受力。在馬鈴薯(Solanumtuberosum)中超表達(dá)StMYB1R-1后，與干旱脅迫響應(yīng)相關(guān)基因RD28、ALDH和ERD15的表達(dá)豐度大幅上調(diào)，葉片的水分散失減少，從而顯著提高了植株的抗旱性[5]。番茄(Lycopersiconesculentum) R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子LeAN2受高溫誘導(dǎo)表達(dá)，高溫脅迫下超表達(dá)LeAN2的轉(zhuǎn)基因植株通過(guò)保持較高的鮮重、光合效率及酶活性使其耐受性增強(qiáng)[6]。前期研究也發(fā)現(xiàn)強(qiáng)旱生植物霸王(Zygophyllumxanthoxylum)轉(zhuǎn)錄因子ZxMYB315的表達(dá)豐度受干旱和鹽處理顯著誘導(dǎo)，在擬南芥中過(guò)量表達(dá)該基因顯著提高了植物對(duì)干旱和鹽脅迫的耐受力(未發(fā)表數(shù)據(jù))。

通過(guò)ZxMYB315 CDS序列Blast比對(duì)發(fā)現(xiàn)，擬南芥轉(zhuǎn)錄因子MYB40與ZxMYB315的同源性最高。MYB40具有兩種不同的可變剪接體MYB40.1和MYB40.2，在擬南芥信息學(xué)分析網(wǎng)站eFP(http://bar.utoronto.ca/efp/cgi-bin/efpWeb.cgi)上發(fā)現(xiàn)MYB40對(duì)鹽和干旱脅迫均有明顯響應(yīng)，表明其可能在植物抗逆過(guò)程中發(fā)揮重要功能，而相關(guān)方面的研究還未見(jiàn)報(bào)道。因此，獲得MYB40.1和MYB40.2的敲除突變體，并以敲除突變體為材料，研究MYB40的抗逆功能具有十分重要的意義。但在ABRC(https://abrc.osu.edu/)等相關(guān)的擬南芥突變體種子庫(kù)中未找到MYB40.1及MYB40.2相應(yīng)的T-DNA插入缺失突變體。鑒于此，應(yīng)用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，分別獲得MYB40.1和MYB40.2的敲除突變體，為揭示MYB40這兩種可變剪接體在擬南芥響應(yīng)逆境脅迫過(guò)程中的功能和分子機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

本實(shí)驗(yàn)所用擬南芥野生型材料為Col-0；CRISPR/Cas9中間載體AtU6-26-sgRNA-SK和終載體pCAMBIA1300-pYAO：Cas9由蘭州大學(xué)黎家實(shí)驗(yàn)室提供；根癌農(nóng)桿菌GV3101由蘭州大學(xué)牧草逆境生理與基因工程實(shí)驗(yàn)室保存。本試驗(yàn)于2017年3月至2017年11月進(jìn)行。

1.2 主要試劑

植物總RNA提取試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；引物合成及質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自上海生物工程有限公司；膠回收試劑盒購(gòu)自O(shè)mega公司；限制性內(nèi)切酶BsaⅠ-HF、NheⅠ-HF、SpeⅠ-HF，堿性磷酸酶CIAP及T4 DNA連接酶購(gòu)自NEB公司；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)、DNA marker及SYBR Green qPCR Master Mix-SYBR Advantage購(gòu)自大連寶生物公司；SILWET L-77購(gòu)自GE Healthcare公司；其他生化試劑為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.3 植物材料培養(yǎng)及處理

將健康飽滿的擬南芥Col-0種子消毒后，點(diǎn)種于1/2 MS固體培養(yǎng)基上，4 ℃春化3 d，置于培養(yǎng)室培養(yǎng)1周后收集幼苗，分別用1/2 MS液體培養(yǎng)基和含有150 mmol·L-1NaCl的1/2 MS液體培養(yǎng)基處理6 h后取樣，用于提取總RNA。

將健康飽滿的野生型擬南芥種子播種于裝有草炭土的小花盆中并放入培養(yǎng)室進(jìn)行培養(yǎng)。

培養(yǎng)室的溫度為22～23 ℃，光照條件為120～150 μmol·m-2·s-1、16 h(晝)/8 h(夜)，相對(duì)濕度50%～60%[7]。

1.4 MYB40.1及MYB40.2的表達(dá)模式分析

Real-time PCR引物設(shè)計(jì)：依據(jù)Tair網(wǎng)站(http://www.arabidopsis.org/)上MYB40兩種可變剪接體的cDNA序列，設(shè)計(jì)Real-time PCR引物如下(圖1，表1)。

圖1 Real-time PCR引物選擇示意圖Fig.1 Selection of Real-time PCR primer

總RNA提取及cDNA獲得：取1/2 MS液體培養(yǎng)基及含有150 mmol·L-1NaCl的1/2 MS液體培養(yǎng)基處理6 h的根樣，參照植物總RNA提取試劑盒方法提取RNA并使用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。

MYB40.1及MYB40.2的表達(dá)模式分析：將反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA稀釋5倍后作為模板進(jìn)行Real-time PCR。

1.5 CRISPR/Cas9載體構(gòu)建及農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化

靶點(diǎn)選擇及靶點(diǎn)引物合成：在Tair網(wǎng)站上查找獲得MYB40兩種轉(zhuǎn)錄本的gDNA序列，參考Ma等[8]及Yan等[9]的靶點(diǎn)選擇方法，應(yīng)用Optimized CRISPR Design在線設(shè)計(jì)軟件(http://crispr.mit.edu/)分別對(duì)MYB40.1、MYB40.2及MYB40進(jìn)行靶點(diǎn)選擇。因?yàn)榻?jīng)BsaⅠ酶切后會(huì)留下粘性末端ATTG及AAAC，所以在正向引物的5′端添加接頭ATTG，在反向引物的5′端添加接頭AAAC。選擇MYB40.1的靶點(diǎn)T1.1、T1.2，MYB40.2的靶點(diǎn)T2.1、T2.2及MYB40.1與MYB40.2的共同靶點(diǎn)T(圖2),并設(shè)計(jì)相應(yīng)靶點(diǎn)引物如下(表2)。

表1 Real-time PCR引物Table 1 Primers for Real-time PCR

圖2 靶點(diǎn)選擇示意圖Fig.2 Selection of target sequences

1.5.1sgRNA cassette構(gòu)建 將10 μmol·L-1的正反靶點(diǎn)引物各取10 μL于80 μL 0.5×TE (pH 8.0)，混勻98 ℃加熱3 min后取出。取1 μg中間載體AtU6-26-sgRNA-SK于50 μL反應(yīng)體系中，使用1 μLBsaⅠ-HF 37 ℃酶切4 h，凝膠電泳檢測(cè)，回收3.5 kb片段。在10 μL連接體系中，使用0.2 μL T4 DNA連接酶將40 ng酶切回收獲得的AtU6-26-sgRNA-SK片段與1 μL退火后的靶點(diǎn)引物在16 ℃連接過(guò)夜。

將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞并凃于含有50 mg·L-1氨芐的LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜，使用SK-gRNA-F (5′-CTCACTATAGGGCG AATTGG-3′)與靶點(diǎn)反向引物進(jìn)行菌落PCR，PCR長(zhǎng)度應(yīng)為499 bp。挑選陽(yáng)性克隆進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)并提取質(zhì)粒送測(cè)序，將測(cè)序正確的質(zhì)粒應(yīng)用NheⅠ-HF和SpeⅠ-HF 37 ℃雙酶切4 h，電泳后切膠回收大小約642 bp的片段，所獲片段即為sgRNA cassette。

1.5.2雙元載體構(gòu)建及農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化 在50 μL體系中，使用1 μLSpeⅠ-HF在37 ℃酶切2 μg終載體pCAMBIA1300-pYAO：Cas9 4 h后，80 ℃失活20 min，待反應(yīng)體系冷卻至室溫后，加入堿性磷酸酶CIAP 0.2 μL于37 ℃反應(yīng)10 min。 電泳， 切膠回收大小約14 kb 的片段。在10 μL連接體系中，加入約40 ng酶切后的pCAMBIA1300-pYAO：Cas9及15 ng左右的sgRNA cassette，使用0.2 μL T4 DNA連接酶在16 ℃連接過(guò)夜。

將10 μL連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌EscherichiacoliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂于含有50 mg·L-1卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)。使用1300-gRNA-F (5′-CCAGTCACGACGTTGTAAAC-3′)與1300-gRNA-R (5′-CAATGAATTTCCCATCGTCGAG-3′)進(jìn)行菌落PCR并進(jìn)行跑膠檢測(cè)，PCR產(chǎn)物片段應(yīng)為750 bp左右。挑選陽(yáng)性克隆進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)并提取質(zhì)粒。

使用凍融法將獲得的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，涂于含有50 mg·L-1卡那霉素及50 mg·L-1慶大霉素的LB固體培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)48 h，用1300-gRNA-F及1300-gRNA-R引物進(jìn)行菌落PCR，PCR產(chǎn)物片段長(zhǎng)度約為750 bp。對(duì)于每種質(zhì)粒，分別挑選陽(yáng)性克隆進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)并保存于-80 ℃冰箱。

1.6 擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化及基因編輯植株獲得

1.6.1擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化 應(yīng)用浸花法[7]對(duì)擬南芥進(jìn)行轉(zhuǎn)化，4周后收集種子。

1.6.2基因編輯植株獲得 擬南芥種子消毒后，點(diǎn)于含有30 mg·L-1潮霉素的1/2 MS固體培養(yǎng)基上，4 ℃春化3 d后置于培養(yǎng)室生長(zhǎng)2周，將具有潮霉素抗性的植株移植至草炭土中進(jìn)行培養(yǎng)。

依據(jù)靶點(diǎn)引物的位置，在其上下游分別設(shè)計(jì)轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株檢測(cè)引物(表3)。SDS法[8]提取潮霉素抗性擬南芥植株葉片總DNA，使用檢測(cè)引物進(jìn)行PCR檢測(cè)，PCR產(chǎn)物送至蘇州金維智公司進(jìn)行測(cè)序分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 MYB40.1及MYB40.2表達(dá)模式分析

表2 MYB40不同轉(zhuǎn)錄本CRISPR/Cas9靶點(diǎn)引物設(shè)計(jì)Table 2 Design of CRISPR/Cas9 target primer for different transcripts of MYB40

表3 突變檢測(cè)引物設(shè)計(jì)Table 3 Design of primers for mutation detection

提取Control (1/2 MS)及150 mmol·L-1NaCl (1/2 MS+150 mmol·L-1NaCl)處理6 h擬南芥的根樣，液氮速凍后研磨，提取總RNA，使用NanoDrop 1000核酸蛋白檢測(cè)儀檢測(cè)，OD260/OD280為1.8～2.1，表明所提RNA質(zhì)量較高，可用于隨后的實(shí)驗(yàn)中。使用反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板，分析鹽處理?xiàng)l件下MYB40.1及MYB40.2表達(dá)變化(圖3)。發(fā)現(xiàn)在鹽處理6 h后，MYB40.1及MYB40.2的表達(dá)均下調(diào)，表明這兩種可變剪接體在擬南芥的耐鹽過(guò)程中可能發(fā)揮了負(fù)調(diào)控的功能。

圖3 AtMYB40.1及AtMYB40.2表達(dá)模式分析Fig.3 Relative expression levels of AtMYB40.1 and AtMYB40.2

2.2 sgRNA cassette構(gòu)建

通過(guò)酶切連接的方法構(gòu)建sgRNA cassette。使用SK-gRNA-F與靶點(diǎn)反向引物進(jìn)行菌落PCR，在499 bp處出現(xiàn)目標(biāo)條帶(圖4)。對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒后送測(cè)序，挑選測(cè)序結(jié)果合適的質(zhì)粒，使用NheⅠ-HF與SpeⅠ-HF進(jìn)行雙酶切，對(duì)642 bp左右的條帶進(jìn)行切膠回收(圖5)，所獲片段即為sgRNA cassette。

圖4 菌落PCR電泳圖Fig.4 Agarose gel electrophoresis of colony PCRM：Marker，DL 2000.下同The same below.

圖5 sgRNA cassetteFig.5 sgRNA cassette

2.3 雙元載體構(gòu)建

通過(guò)酶切連接的方法構(gòu)建雙元載體。使用1300-gRNA-F與1300-gRNA-R進(jìn)行菌落PCR，在750 bp處出現(xiàn)目標(biāo)條帶(圖6)，表明MYB40兩種不同可變剪接體的CRISPR/Cas9雙元載體構(gòu)建成功。

圖6 雙元載體菌落PCR電泳圖Fig.6 Agarose gel electrophoresis of binary vector colony PCR

2.4 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化及陽(yáng)性植株鑒定

通過(guò)凍融法[6]將構(gòu)建好的CRISPR/Cas9雙元載體導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌GV3101中，挑取單克隆進(jìn)行菌落PCR，在750 bp處出現(xiàn)條帶，表明雙元載體成功轉(zhuǎn)化進(jìn)入根癌農(nóng)桿菌中(圖7)。提取具有潮霉素抗性的擬南芥植株總DNA，并使用突變檢測(cè)引物進(jìn)行檢測(cè)，PCR產(chǎn)物送測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與擬南芥野生型MYB40.1，MYB40.2的序列進(jìn)行比對(duì)，序列發(fā)生變化或測(cè)序出現(xiàn)套峰的即為基因編輯植株(圖8)。

圖7 農(nóng)桿菌菌檢電泳圖Fig.7 Agarose gel electrophoresis of Agrobacterium tumefaciens PCR

圖8 基因編輯植株測(cè)序結(jié)果Fig.8 Sequencing results of gene-edited alleles黑線標(biāo)出為靶點(diǎn)。Black lines indicate target sequences.

3 討論

干旱、鹽堿等非生物脅迫影響了植物的正常生長(zhǎng)發(fā)育，導(dǎo)致作物減產(chǎn)。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，通常通過(guò)灌溉及施肥減緩不良環(huán)境條件對(duì)作物生長(zhǎng)的不利影響[10]。這些田間管理措施雖然在短時(shí)間內(nèi)提高了作物產(chǎn)量，但也造成了水資源浪費(fèi)、次生鹽漬化及水體富營(yíng)養(yǎng)化等危害[11-12]。因此，培育能夠保障穩(wěn)定糧食供給且具有更強(qiáng)抗性的作物就具有十分重要的意義。植物在長(zhǎng)期適應(yīng)過(guò)程中，進(jìn)化出了一系列抗逆機(jī)制并形成了相應(yīng)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。轉(zhuǎn)錄因子作為一種調(diào)控蛋白，在植物響應(yīng)各種非生物脅迫的信號(hào)通路中具有十分重要的功能，其不同可變剪接體的形成在植物適應(yīng)各種非生物脅迫中起到了關(guān)鍵作用[13-17]。因此，研究轉(zhuǎn)錄因子受非生物脅迫所產(chǎn)生的可變剪接體在抗逆過(guò)程中的功能以更好的理解植物的脅迫響應(yīng)機(jī)制具有十分重要的意義。

CRISPR/Cas9技術(shù)作為一種新興的編輯技術(shù)，因其高效性及簡(jiǎn)便性，越來(lái)越多的應(yīng)用于動(dòng)植物的基因功能驗(yàn)證及育種中[18]。在該技術(shù)中，通過(guò)構(gòu)建特定的sgRNA，引導(dǎo)Cas9至DNA的特定位點(diǎn)進(jìn)行切割，形成DNA雙鏈斷裂，隨后，經(jīng)非同源末端連接(non-homologous end joining，NHEJ)或同源重組(homologous recombination,HR)自我修復(fù)機(jī)制進(jìn)行修復(fù)。通常情況下，NHEJ會(huì)導(dǎo)致隨機(jī)的插入或缺失，當(dāng)插入或缺失發(fā)生在編碼區(qū)時(shí)，會(huì)導(dǎo)致翻譯時(shí)的移碼，無(wú)法翻譯成正確的蛋白，從而達(dá)到基因編輯的目的[19]。在使用這一技術(shù)對(duì)擬南芥的基因進(jìn)行編輯的過(guò)程中，多通過(guò)農(nóng)桿菌侵染花序，將包含有Cas及相關(guān)序列的載體轉(zhuǎn)入植物體內(nèi)。因此，在這一過(guò)程中，T-DNA最先進(jìn)入到擬南芥的胚囊細(xì)胞中[20]。然而，與其在營(yíng)養(yǎng)組織中的活性相比，最為廣泛使用的啟動(dòng)Cas表達(dá)的CaMV 35S啟動(dòng)子在花序侵染的過(guò)程中活性較低，嚴(yán)重影響了編輯效率且獲得的突變多為體細(xì)胞突變(somatic mutations)。YAO參與擬南芥的胚胎發(fā)生及配子發(fā)育，主要表達(dá)于分裂能力強(qiáng)的組織中[21]。因此，本研究使用該基因的啟動(dòng)子pYAO代替35S啟動(dòng)子來(lái)啟動(dòng)Cas9的表達(dá)以提高編輯效率并獲得生殖系突變(germline mutations)[9,21]。

靶位點(diǎn)的選擇將影響最終的編輯效率，優(yōu)先選擇在內(nèi)含子與外顯子的連接處、起始密碼子處及基因重要的功能結(jié)構(gòu)域的NGG前設(shè)計(jì)靶點(diǎn)引物，使編輯后DNA轉(zhuǎn)錄獲得的pre-mRNA無(wú)法正常剪接、成熟的mRNA無(wú)法正常翻譯或翻譯獲得的蛋白不具有活性，以提高突變效率[8]。同時(shí)，為達(dá)到特異性敲除不同可變剪接體的目的，靶位點(diǎn)應(yīng)根據(jù)兩可變剪接體序列上的差異進(jìn)行選擇。因此，本研究參照Ma等[8]及Yan等[9]的方法，分別在AtMYB40.1的起始密碼子處及第2個(gè)外顯子與內(nèi)含子的連接處，AtMYB40.2 CDS序列的5′端，AtMYB40.1的第3個(gè)外顯子處分別選擇編輯AtMYB40.1、AtMYB40.2及同時(shí)編輯AtMYB40.1和AtMYB40.2的靶位點(diǎn)。

4 結(jié)論

在本研究中，獲得3個(gè)MYB40.1和MYB40.2被同時(shí)編輯的株系及2個(gè)MYB40.1基因編輯株系，隨后將繼續(xù)對(duì)MYB40.2的突變體植株進(jìn)行篩選，獲得3種不同突變體的純合植株以進(jìn)行抗逆功能分析，同時(shí)，該研究也為應(yīng)用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)霸王等非模式植物進(jìn)行基因編輯以更好的研究其抗逆機(jī)理打下基礎(chǔ)。