李小冬，莫本田，牟瓊，婁芬，陳文貴，陳光吉，張瑜，韓永芬*

(1.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院草業(yè)研究所,貴州 貴陽(yáng) 550006；2.貴州金農(nóng)富平生態(tài)農(nóng)牧科技有限公司，貴州 松桃 554100；3.大方縣農(nóng)牧局，貴州 大方 551600)

高等植物的基因行使其功能受到復(fù)雜而精細(xì)的調(diào)控，按照調(diào)控時(shí)間的先后順序可分為轉(zhuǎn)錄前調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控、翻譯調(diào)控和翻譯后調(diào)控幾個(gè)主要階段[1]。啟動(dòng)子是基因轉(zhuǎn)錄前調(diào)控的主要元件，通過(guò)對(duì)下游基因表達(dá)時(shí)期與表達(dá)量的調(diào)節(jié)，決定植物完成特殊生長(zhǎng)發(fā)育階段的轉(zhuǎn)變或應(yīng)答特殊環(huán)境脅迫[2]。

按照轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)方式可以將啟動(dòng)子分為組成型、組織特異型和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子[3]，但彼此之間可能有重疊，例如，果實(shí)特異啟動(dòng)子同時(shí)也有可能是乙烯誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，因?yàn)槠渖嫌螀^(qū)域可能存在多個(gè)順式作用元件，能夠與多種不同的反式作用因子相互作用[4]，特異性啟動(dòng)子與誘導(dǎo)型啟動(dòng)子能根據(jù)植物特殊生長(zhǎng)發(fā)育階段或特殊環(huán)境應(yīng)激啟動(dòng)相應(yīng)基因表達(dá)，能夠?qū)崿F(xiàn)精準(zhǔn)高效的調(diào)控，在基因功能研究與農(nóng)業(yè)分子育種中有巨大的應(yīng)用潛力，目前研究較多的有光誘導(dǎo)[5-6]、溫度誘導(dǎo)[7-9]、干旱誘導(dǎo)[10]、激素誘導(dǎo)[11]、傷害誘導(dǎo)型啟動(dòng)子[12]等，并且已經(jīng)成功的在煙草(Nicotianatabacum)、玉米(Zeamays)、水稻(Oryzasativa)等農(nóng)作物中培育了誘導(dǎo)型啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的抗逆種質(zhì)資源。

熱激轉(zhuǎn)錄因子Hsf與熱激蛋白Hsp是植物中重要的高溫誘導(dǎo)基因，其啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)比較保守，在模式植物擬南芥(Arabidopsisthaliana)中，熱激轉(zhuǎn)錄因子Hsf與其下游基因Hsp啟動(dòng)子區(qū)都存在HSE模體(AGAAnnTTCT)，并且21個(gè)Hsf中除HsfA4c和HsfA8外，其余都被報(bào)道參與抗熱反應(yīng)[13]。多橋蛋白因子(MBF1)是動(dòng)植物中高度保守的轉(zhuǎn)錄共激活子，在植物中，MBF1c參與高溫脅迫應(yīng)答，并顯著受熱誘導(dǎo)[14]。MBF1c蛋白具有DNA結(jié)合的能力，能夠調(diào)節(jié)DREB2A、HsfA3、HsfB2a以及HsfB2b等基因的表達(dá)[14-15]，并且其抗熱反應(yīng)受水楊酸和乙烯等多條激素途徑調(diào)節(jié)，是連接Hsf-Hsp途徑和激素途徑的中樞基因，然而關(guān)于MBF1c啟動(dòng)子的研究報(bào)道還很少。研究并開(kāi)發(fā)利用其啟動(dòng)子為豐富高溫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子庫(kù)具有重要的理論研究與實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究采用的紫花苜蓿材料為“中苜1號(hào)”(Medicagosativacv.Zhongmu 1#)，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所高洪文團(tuán)隊(duì)饋贈(zèng))，擬南芥為哥倫比亞型野生型，擬南芥與紫花苜蓿種植條件參考Li等[16]的方法，植物生長(zhǎng)溫度為22 ℃，相對(duì)濕度為60%，光周期為16 h光照/8 h黑暗，光照強(qiáng)度為230～300 μE·m-2·s-1，在人工智能氣候室中進(jìn)行，試驗(yàn)時(shí)間為2014-2017年。

1.2 方法

1.2.1紫花苜蓿DNA提取 稱取1 g新鮮“中苜1號(hào)”紫花苜蓿葉片，用液氮研磨成粉末，加入1 mL 65 ℃預(yù)熱的2% CTAB提取緩沖液(2% CTAB，20 mmol·L-1EDTA，100 mmol·L-1Tris-HCl, 1.4 mol·L-1NaCl)，65 ℃孵育1 h，12000 r·min-1離心10 min，將800 μL上清轉(zhuǎn)移到新離心管；加入200 μL氯仿，震蕩萃取30 min，12000 r·min-1離心10 min，將600 μL上清液轉(zhuǎn)移到新離心管；加入1 mL預(yù)冷的無(wú)水乙醇，-20 ℃孵育1 h，12000 r·min-1離心10 min，加入700 μL 75%的乙醇，10000 r·min-1離心5 min，棄上清，通風(fēng)廚中瀝干沉淀，加入50 μL dd H2O溶解備用。

1.2.2紫花苜蓿MsMBF1c啟動(dòng)子序列的分離克隆 采用基于巢式PCR的酶切連接技術(shù)分離MsMBF1c啟動(dòng)子序列，具體操作如下：1) 合成接頭引物：AF 5′-GTAATACGACTCACTATAGGGCACGCGTGGT-3′，AER (EcoRⅠ) 5′-AATTACCACGCGTGCTG-3′，AHR (HindⅢ) 5′-AGCTACCACGCGTGCTG-3′， ABR (BamHⅠ/BglⅡ) 5′-GATCACCACGCGTGCTG-3′，AXR (XhoⅠ) 5′-TCGAACCACGCGTGCTG-3′，APR (blunt-ended) 5′-ACCACGCGTGCTG-3′； 2) 制備接頭：在PCR儀中進(jìn)行，采用梯度變性退火方法制備，每一種內(nèi)切酶對(duì)應(yīng)一種接頭，體系如下：取AF (10 μmol·L-1) 10 μL，A*R (10 μmol·L-1) 10 μL (A*R指AER、AHR、ABR、AXR、APR等5條反向引物中的一條)，混合均勻，進(jìn)行接頭制備反應(yīng)，反應(yīng)程序如下：94 ℃ 3 min，70 ℃ 10 min，60 ℃ 10 min，50 ℃ 10 min，30 ℃ 10 min，25 ℃ 10 min，結(jié)束連接，接頭制備完成。

采用EcoRⅠ、BamHⅠ、HindⅢ、XhoⅠ、SmaⅠ (Fermentas)分別酶切苜蓿基因組DNA，酶切反應(yīng)體系如下：紫花苜蓿基因組DNA 2 μL，10×酶切反應(yīng)緩沖液1 μL，限制性內(nèi)切酶 0.5 μL，dd H2O 6.5 μL，37 ℃酶切0.5～2.0 h。酶切反應(yīng)完后進(jìn)行連接反應(yīng)，體系如下：酶切反應(yīng)樣品 10 μL，連接接頭1 μL，10×連接反應(yīng)緩沖液 2 μL，T4 DNA連接酶 1 μL，dd H2O 6 μL，4 ℃連接16 h。

巢式PCR擴(kuò)增，引物序列如下：AD1，5′-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3′，AD2，5′-ACTATAGGGCACGCGTGGT-3′，MBFR1，5′-TAGTTTTAGGGATTAGGAGC-3′，MBFR2，5′-GTTGACGGCTT TCTCATCTT-3′，MBFR3，5′-TTCTTGCGGATAACGACTGG-3′。以稀釋20～50倍的酶切連接產(chǎn)物為模板，以AD1與MBFR1為引物，配置PCR反應(yīng)混合物(上海生工 2×Taq PCR反應(yīng)試劑盒)，反應(yīng)體系如下： 2×Taq PCR Mixture 10 μL，AD1 (10 μmol·L-1) 1 μL， MBFR1 (10 μmol·L-1) 1 μL，模板 2 μL，dd H2O 6 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，7個(gè)循環(huán)，94 ℃ 30 s，68 ℃ 3 min，32個(gè)循環(huán)，72 ℃ 5 min，25 ℃ 5 min，反應(yīng)結(jié)束。以稀釋50～100倍的第一輪PCR產(chǎn)物為模板，進(jìn)行第二輪巢式PCR擴(kuò)增，引物組合為AD2與MBFR2，反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，5個(gè)循環(huán)，94 ℃ 30 s，68 ℃ 3 min，25個(gè)循環(huán)，72 ℃ 5 min，25 ℃ 5 min，反應(yīng)結(jié)束。第三輪巢式PCR引物組合為AD2與MBFR3，反應(yīng)體系與程序與第二輪相同。

分別取第二輪與第三輪巢式PCR產(chǎn)物進(jìn)行水平膠電泳，將第二輪與第三輪都有明顯擴(kuò)增，且第三輪產(chǎn)物略小于(43 bp)第二輪的條帶進(jìn)行回收(上海生工膠回收試劑盒)，參照試劑盒說(shuō)明書(shū)，得到的序列即為MsMBF1c側(cè)翼序列的候選序列。

1.2.3pBI21-pMsMBF1c::GUS雙元載體的構(gòu)建 利用巢式PCR測(cè)序的結(jié)果設(shè)計(jì)引物：pMBF1cF 5′-AAGCTTAATGAATTTAAGTGG-3′，pMBF1cR 5′-GTTTATCTCTTTGGTTATG-3′，采用phusion DNA聚合酶(Thermo)進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系如下：10×buffer，2 μL；dNTP mix，0.5 μL；MgCl2，1.5 μL；pMBF1cF，1 μL；pMBF1cR，1 μL；DNA模板，2 μL；DNA Polymerase，0.2 μL；dd H2O，12 μL。程序如下：95 ℃ 1 min，95 ℃ 10 s，58 ℃ 10 s，72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)，72 ℃ 5 min，25 ℃ 5 min。將回收產(chǎn)物連接到pEASY-Blunt克隆載體(pEASY-Blunt Cloning Kit，Transgene)并進(jìn)行測(cè)序分析，提取pEASY-MsMBF1c載體質(zhì)粒，與pBI121載體一起，分別利用HindⅢ與BamHⅠ雙酶切，回收線性化的pBI121載體片段和MsMBF1c片段， 用T4連接酶(Fermentas)連接成pBI21-pMsMBF1c::GUS雙元載體，具體操作參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.2.4RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄 稱取100 mg新鮮“中苜1號(hào)”紫花苜蓿葉片或擬南芥葉片，用液氮研磨成粉末，采用TRIZOLTMKit RNA提取試劑(Invitrogen，USA)提取總RNA。采用RevertAid H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas) 反轉(zhuǎn)錄cDNA 第一鏈，參照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作。

1.2.5pBI21-pMsMBF1c::GUS擬南芥轉(zhuǎn)化與轉(zhuǎn)基因擬南芥篩選 擬南芥轉(zhuǎn)化與篩選參考文獻(xiàn)[17]，其操作方法如下：將活化的農(nóng)桿菌懸浮于新鮮配置的5%蔗糖誘導(dǎo)培養(yǎng)基中[10 g 蔗糖充分溶解于200 mL蒸餾水中，在轉(zhuǎn)化之前加入20 μL Silwet L-77(上海生工)]。去除處于盛花期野生型擬南芥的花和角果，將其浸泡在懸浮菌液中30 s，收取轉(zhuǎn)基因種子，并利用卡那霉素抗生素篩選，并以卡那霉素抗性基因以及MsMBF1c正向引物與GUS反向進(jìn)行分子鑒定。具體操作如下：首先將轉(zhuǎn)基因的種子用75%乙醇表面消毒1 min，用50% 84消毒液消毒3 min，然后用無(wú)菌水清洗種子3～4次，將消毒好的種子均勻鋪布于1/2 MS+300 mg·L-1特美汀+ 50 mg·L-1卡那霉素培養(yǎng)基中，在人工氣候室中篩選15～30 d，挑選綠色健壯的植株移栽到營(yíng)養(yǎng)土中備用。采用天根植物DNA提取試劑盒(DP305)提取轉(zhuǎn)基因與野生型擬南芥的新鮮葉片組織的DNA，程序方法參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。利用NPTF+NPTR和pMBF1cF+GUSR兩個(gè)引物組合分別對(duì)轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)行PCR 鑒定(上海生工 2×Taq PCR反應(yīng)試劑盒)，引物序列為NPTF：5′-GAGGCTATTCGGCTATGACTG-3′，NPTR：5′-ATCGGGAGCGGCGATACCGTA-3′，GUSR：5′-GCCCACAGGCCGTCGAGT-3′。反應(yīng)體系如下：2×Taq PCR Mixture，10 μL；正向引物，1 μL；反向引物，1 μL；DNA，2 μL；dd H2O，6 μL。混勻后進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，NPTF+NPTR程序如下：94 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)，72 ℃ 5 min，25 ℃ 5 min。pMBF1cF+GUSR程序如下：94 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，30個(gè)循環(huán)，72 ℃ 5 min，25 ℃ 5 min。分別取8 μL PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)，挑選陽(yáng)性植株用于表型考察與表達(dá)分析。

1.2.6高溫脅迫處理 采用1.2.5表面消毒方法消毒轉(zhuǎn)基因以及野生型擬南芥，并分別播種到1/2 MS培養(yǎng)基上，室溫生長(zhǎng)7 d，對(duì)照組一直置于22 ℃培養(yǎng)箱中生長(zhǎng)，處理組采用浸入法將培養(yǎng)皿置于42 ℃水浴鍋中熱處理1 h后分別取樣進(jìn)行GUS染色和熱誘導(dǎo)表達(dá)分析，取3個(gè)獨(dú)立的株系，每個(gè)株系處理30個(gè)植株。

1.2.7GUS染色分析 將正常與高溫處理之后的轉(zhuǎn)基因以及野生型擬南芥置于新鮮配置的GUS染色液中37 ℃染色2 h，用75%的乙醇脫色3～5次至背景色為白色，在相同曝光條件下，比較各材料GUS染色強(qiáng)度來(lái)判斷啟動(dòng)子是否受誘導(dǎo)。

1.2.8熒光定量分析 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄參照1.2.4的方法，采用GoTaq Real-Time PCR Systems (Promega，A6001)檢測(cè)pMBF1c:GUS與野生型擬南芥中GUS基因以及AtMBF1c基因在正常以及高溫誘導(dǎo)條件下的表達(dá)，引物組合為：qGUSF，5′-CGGTCAGTGGCAGTGAAGGG-3′與qGUSR，5′-CGAGGTACGGTAGGAGTTGG-3′，AtMBF1c基因：qAtMBF1cF，5′-TGCCGAGCAGATACCCAGGAGC-3′；qAtMBF1cR，5′-TAACCGTTTGAACCGCGACACC-3′，內(nèi)參基因?yàn)锳ctin2，引物組合為Actin2 F，5′-AGCGCTGAGGCTGATGATATTCAAC-3′，Actin2 R 5′-TCTAGAAACATTTTCTGTGAACGATTC-3′，操作方法按照試劑盒說(shuō)明書(shū)，反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃ 2 min，94 ℃ 15 s，58 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，讀取熒光信號(hào)，45個(gè)循環(huán)，72 ℃ 5 min，25 ℃ 5 min。采用2-ΔΔct方法分析GUS和AtMBF1c的表達(dá)變化，每個(gè)樣品3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)生物學(xué)重復(fù)3個(gè)技術(shù)重復(fù)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，采用t測(cè)驗(yàn)分析表達(dá)差異顯著性，閾值設(shè)為P<0.05，采用Excel 2010與Power Point 2010作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫花苜蓿MsMBF1c側(cè)翼序列的克隆與分析

紫花苜蓿是草牧業(yè)與生物固氮領(lǐng)域的重要農(nóng)作物之一。其同源種蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)作為豆科牧草的模式植物，基因組已經(jīng)完成。然而由于紫花苜蓿異源四倍體的基因組特點(diǎn)，其基因組的研究仍相對(duì)滯后。本研究前期通過(guò)同源克隆的方法從紫花苜蓿基因組克隆獲得MsMBF1c基因，并發(fā)現(xiàn)其顯著受高溫誘導(dǎo)，然而其啟動(dòng)子序列仍未知。借鑒染色體步移技術(shù)方法，采用酶切連接的方法利用EcoRⅠ、BamHⅠ、HindⅢ、XhoⅠ、SmaⅠ酶切紫花苜基因組DNA，并用相應(yīng)接頭連接后形成擴(kuò)增模板。根據(jù)已知的MsMBF1c編碼序列和接頭序列信息設(shè)計(jì)了2對(duì)巢式PCR引物，經(jīng)過(guò)兩輪巢式PCR擴(kuò)增，獲得MsMBF1c的側(cè)翼序列片段，回收在第一輪與第二輪PCR反應(yīng)中都有擴(kuò)增，且第二輪PCR產(chǎn)物略小于第一輪產(chǎn)物的片段(圖1)，測(cè)序分析獲得側(cè)翼序列信息。

2.2 MsMBF1c啟動(dòng)子序列結(jié)構(gòu)與生物信息學(xué)分析

利用Sequencer 4.0將分離側(cè)翼序列的測(cè)序結(jié)果與MsMBF1c基因進(jìn)行比對(duì)，獲得一條與MsMBF1c序列有重疊的1748 bp片段，采用PlantCARE軟件(Plant Cis-Acting Regulatory Element, http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)與AGRIS軟件(The Arabidopsis Gene Regulatory Information Server，http://agris-knowledgebase.org/)對(duì)該序列結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，MsMBF1c的啟動(dòng)子有植物耐熱、抗旱、ABA信號(hào)傳導(dǎo)以及環(huán)境脅迫緊密相關(guān)模體(表1)，說(shuō)明MsMBF1c可能參與植物耐熱等環(huán)境脅迫應(yīng)答。已經(jīng)將該序列上傳到GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)，其登錄號(hào)為：MH760587。

圖1 MsMBF1c啟動(dòng)子序列的分離Fig.1 Isolation of the promoter sequence of MsMBF1c 每一個(gè)橫線指示一種酶切連接方法。A：第一輪巢式PCR電泳結(jié)果;B：第二輪巢式PCR電泳結(jié)果。箭頭表示回收用于測(cè)序分析的候選啟動(dòng)子片段。Every horizontal line stands for a digest-ligation method. A: The results of electrophoresis of the first round of nested-PCR； B: The results of electrophoresis of the second round of nested-PCR. The arrowhead indicate the potential promoter fragments recycled for sequence analysis.

模體名字 Motif name保守序列Consensus motif相關(guān)功能Related function參考文獻(xiàn)ReferencesHSEs結(jié)合模體HSEs binding site motifAGAANNTTCT熱激轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn),調(diào)節(jié)動(dòng)植物耐熱性Heat stress transcription factor binding site, regulating plant thermotolerance[18]GATA 啟動(dòng)子模體GATA pro-moter motif(A/T)GATA(G/A)參與植物耐熱調(diào)節(jié)Regulating plant thermotolerance[19]ABRE結(jié)合模體ABRE binding site motif(C/T)ACGTGGCABA響應(yīng)原件結(jié)合位點(diǎn),參與多種環(huán)境脅迫因子應(yīng)答ABA responsible el-ement binding site, involving in various environmental stress regulation[20]RD22中AtMYB2的結(jié)合位點(diǎn)AtMYB2 binding site in RD22CTAACCA調(diào)節(jié)干旱與ABA途徑相關(guān)基因表達(dá)Regulating the expressions of drought and ABA pathway related genes[21]RD22中AtMYC2的結(jié)合位點(diǎn)AtMYC2 binding site in RD22CACATG調(diào)節(jié)干旱與ABA途徑相關(guān)基因表達(dá)Regulating the expressions of drought and ABA pathway related genes[21]CBF2 結(jié)合位點(diǎn)模體CBF2 bind-ing site motifCCACGTGG參與水分和ABA介導(dǎo)的脅迫反應(yīng)調(diào)節(jié)Involving in water and ABA me-diated stress regulation[22]MYB3的結(jié)合位點(diǎn)模體MYB3 binding site motifTAACTAAC參與冷害與病害在內(nèi)的多種環(huán)境脅迫應(yīng)答Involving in various stresses including cold and pathogen stress regulation[23]MYB4 結(jié)合位點(diǎn)模體MYB4 binding site motifA(A/C)C(A/T)A(A/C)C參與紫外線、冷害與病害在內(nèi)的多種環(huán)境脅迫應(yīng)答Involving in various stresses including UV, cold and pathogen stress regulation[23-24]Box II啟動(dòng)子模體Box II pro-moter motifGGTTAA參與TFIIA-TBP-TATA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控Involving in TFIIA-TBP-TA-TA mediated transcription regulation[25]DPBF1和DPBF2結(jié)合位點(diǎn)模體DPBF1&2 binding site motifACACNNG參與bZIP轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)的ABA應(yīng)答途徑Regulating bZIP transcription factor mediated ABA responsible pathway[26]

2.3 MsMBF1c啟動(dòng)子克隆與遺傳轉(zhuǎn)化

根據(jù)測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)引物，克隆獲得MsMBF1c啟動(dòng)子全長(zhǎng)序列，利用HindⅢ與BamHⅠ限制性酶切外源片段與pBI121載體，并進(jìn)行連接，獲得pBI121-pMsMBF1c::GUS雙元載體。采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花器官轉(zhuǎn)化法將pBI121-pMsMBF1c::GUS雙元載體轉(zhuǎn)化野生型擬南芥，以50 mg·L-1的卡那霉素進(jìn)行篩選，共獲得了24株陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株，分別采用抗性基因NPTF+NPTR與基因特異引物pMsMBF1cF+GUSR組合檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植株。24株植株用抗性基因檢測(cè)呈陽(yáng)性，其中，20株植株用基因特異引物檢測(cè)呈陽(yáng)性(圖2)。

圖2 pBI121-pMsMBF1c::GUS雙元載體構(gòu)建與轉(zhuǎn)基因擬南芥分子鑒定Fig.2 pBI121-pMsMBF1c::GUS vector construction and detection of positive transgenic Arabidopsis plants A：pMsMBF1c-GUS報(bào)告基因表達(dá)載體示意圖；B：轉(zhuǎn)基因擬南芥分子檢測(cè)示意圖，上排為抗性基因檢測(cè)(NPT)，下排為基因特異性引物檢測(cè)(pMBF1c F+GUS R)。A: A diagram showing pBI121-pMsMBF1c::GUS reporter vector； B: Results of molecular detections of transgenic Arabidopsis, antibiotic resistant gene premiers were showed in the upper line (NPT F+NPT R) and the gene specific premiers were showed in the down line (pMBF1c F+GUS R).

2.4 MsMBF1c熱誘導(dǎo)表達(dá)分析

為進(jìn)一步驗(yàn)證pMsMBF1c啟動(dòng)子的功能，本研究分析了正常與高溫條件下野生型擬南芥與pBI121-pMsMBF1c::GUS轉(zhuǎn)基因植株(抗性及特異性分子鑒定為陽(yáng)性的植株)中GUS基因與內(nèi)源的AtMBF1c的表達(dá)變化。在正常條件下，野生型與pBI121-pMsMBF1c::GUS轉(zhuǎn)基因植株中AtMBF1c的表達(dá)基本相當(dāng)，而在高溫脅迫后，AtMBF1c基因的表達(dá)都顯著被誘導(dǎo)，并且誘導(dǎo)程度相似，分別上升了3.9與4.8倍。在正常以及熱誘導(dǎo)條件下的野生型中都沒(méi)有檢測(cè)到GUS基因的表達(dá)，而在pBI121-pMsMBF1c::GUS轉(zhuǎn)基因植株中，GUS基因顯著受熱誘導(dǎo)，與正常條件相比，表達(dá)量增加了5.4倍(圖3)。

2.5 MsMBF1c啟動(dòng)子熱誘導(dǎo)GUS染色分析

動(dòng)植物中MBF1家族基因的功能與耐逆性尤其與耐熱調(diào)節(jié)顯著相關(guān)，挑選3個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)pBI121-pMsMBF1c::GUS株系與野生型擬南芥一起，采用β-葡萄糖醛酸糖苷酶(β-glucuronidase,GUS) 組織化學(xué)染色分析其在正常與42 ℃高溫誘導(dǎo)后的表達(dá)變化。在正常和高溫誘導(dǎo)條件下，野生型均不能被染色(無(wú)GUS基因表達(dá))。在正常條件下， 3個(gè)pBI121-pMsMBF1c::GUS轉(zhuǎn)基因植株呈淡藍(lán)色，pMsMBF1c啟動(dòng)子低豐度驅(qū)動(dòng)GUS表達(dá)，42 ℃高溫處理1 h后，3個(gè)pBI121-pMsMBF1c::GUS植株呈深藍(lán)色，說(shuō)明pMsMBF1c啟動(dòng)子顯著受高溫誘導(dǎo)，驅(qū)動(dòng)下游報(bào)告基因GUS的表達(dá)(圖4)。

3 討論

圖3 AtMBF1c與GUS報(bào)告基因在正常與高溫脅迫條件下的野生型及轉(zhuǎn)基因擬南芥中的表達(dá)變化分析Fig.3 Expression analysis of AtMBF1c and GUS, the reporter gene, in wild type and transgenic Arabidopsis plants 每個(gè)樣品3個(gè)生物學(xué)重復(fù)， Actin 7為內(nèi)參基因, *表示轉(zhuǎn)基因植物與野生型之間差異在P<0.05達(dá)顯著水平，$表示相同材料在正常和熱激條件下差異在P<0.05達(dá)顯著水平。Each sample had 3 biological repeats, Actin 7 were used as an internal reference, *stands for a significant difference at P<0.05 between different materials (wild type and transgenic plants), while $ stands for a significant difference at P<0.05 between different treatment (normal and high temperature stress conditions) within the same material.

植物為光合自養(yǎng)型生物，不能像動(dòng)物那樣采取移動(dòng)的方式來(lái)應(yīng)對(duì)不利的環(huán)境脅迫，因此需要通過(guò)調(diào)節(jié)不同基因的表達(dá)以提高自身的適應(yīng)性[27]。植物基因的表達(dá)是由不同啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，可以分為組成型、組織特異型和誘導(dǎo)型等幾種，根據(jù)生長(zhǎng)發(fā)育和應(yīng)對(duì)脅迫需要，選擇性的啟動(dòng)或關(guān)閉基因的表達(dá)，節(jié)約植物新陳代謝所需的能量[1]。在模式植物擬南芥[15, 28]與小麥(Triticumaestivum)[29]等農(nóng)作物中，MBF家族基因都被報(bào)道能夠參與植物耐熱調(diào)節(jié)，然而還沒(méi)有對(duì)該基因的啟動(dòng)子進(jìn)行研究的報(bào)道，因此本研究對(duì)紫花苜蓿MsMBF1c的啟動(dòng)子的熱誘導(dǎo)性進(jìn)行系統(tǒng)研究，為更好的利用MBF基因進(jìn)行耐熱性改良奠定基礎(chǔ)。

植物耐熱調(diào)控網(wǎng)絡(luò)已經(jīng)有了很好的研究，前人建立了一個(gè)以HSF-HSP為核心的耐熱調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[18]。其中受HSF調(diào)節(jié)的基因在其啟動(dòng)子區(qū)域都存在一個(gè)核心的保守順式作用元件HSE[13]。在MsMBF1c啟動(dòng)子序列中，發(fā)現(xiàn)了該功能保守的元件，說(shuō)明MsMBF1c可能受HSF直接作用參與植物耐熱調(diào)節(jié)，最近在匍匐剪股穎(Agrostisscabra)耐熱轉(zhuǎn)錄組中，HSF、HSP與MBF1基因都顯著受熱誘導(dǎo)[30]，能夠從側(cè)面印證本研究的推論。除了HSF-HSP調(diào)控網(wǎng)絡(luò)外，植物耐熱途徑還存在第二信使途徑、植物激素調(diào)節(jié)途徑以及其他調(diào)解途徑等，這些途徑之間相互獨(dú)立，但也通過(guò)一些關(guān)鍵基因相互鏈接到一起[31]。最近的研究發(fā)現(xiàn)GATA啟動(dòng)子模體能夠參與植物耐熱調(diào)節(jié)[19]，在MsMBF1c啟動(dòng)子序列中共有3個(gè)拷貝的GATA啟動(dòng)子模體，說(shuō)明MsMBF1c的表達(dá)可能受耐熱核心基因HSF與GATA相關(guān)途徑的耐熱相關(guān)基因的共同調(diào)節(jié)，前人研究發(fā)現(xiàn)HSP70能夠通過(guò)GATA途徑調(diào)控紫杉醇誘導(dǎo)的細(xì)胞程序死亡[32]，而HSP70也是耐熱調(diào)節(jié)途徑的關(guān)鍵基因[33]。

圖4 GUS染色顯示高溫誘導(dǎo)MsMBF1c啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)報(bào)告基因表達(dá)Fig.4 GUS staining of pBI121-MsMBF1c::GUS transgenic plants showed the MsMBF1c promoter could be induced by high temperature A：pBI121-MsMBF1c::GUS轉(zhuǎn)基因植物在正常與高溫條件下報(bào)告基因GUS染色結(jié)果；B：正常與高溫處理示意圖。+CK: pBI121空載體;-CK: 野生型擬南芥;GUS-1,-2,-3：pBI121-MsMBF1c::GUS轉(zhuǎn)基因株系-1,-2,-3, 標(biāo)尺=5 mm。A: GUS staining of pBI121-MsMBF1c::GUS transgenic plants under normal and high temperature conditions; B: A diagram showing the normal and high temperature stress conditions. +CK: pBI121 vector; -CK: Wild type Arabidopsis seedlings; GUS-1,-2,-3: pBI121-MsMBF1c::GUS transgenic plants -1,-2,-3, bars=5 mm.

MBF1c基因不僅能顯著受高溫誘導(dǎo)，而且在部分植物中已經(jīng)被應(yīng)用于耐熱性改良[14]。本研究采用熒光定量的方法分析了pBI121-MsMBF1c::GUS轉(zhuǎn)基因株系和野生型擬南芥中AtMBF1c的表達(dá)也能顯著受高溫誘導(dǎo)，與前人的結(jié)果一致[34]。熒光定量表達(dá)分析MsMBF1c啟動(dòng)子的熱誘導(dǎo)性發(fā)現(xiàn)高溫條件下GUS的表達(dá)也顯著的高于正常條件(圖3)，組織化學(xué)染色(GUS)印證了熒光定量PCR的結(jié)果(圖4)。

植物耐逆調(diào)控網(wǎng)絡(luò)一直都是植物育種與植物功能基因組研究的熱點(diǎn)，并已發(fā)現(xiàn)一批功能保守的轉(zhuǎn)錄因子，它們具有多種功能能夠調(diào)節(jié)植物耐逆性，這些轉(zhuǎn)錄因子是連接其他轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子、植物激素等信號(hào)分子與功能基因的橋梁與紐帶[35]，例如MBF家族基因。小麥的TaMBF1c能夠促進(jìn)水稻和酵母的耐熱性[29]。水稻MBF1不僅能夠調(diào)節(jié)植物營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)與滲透脅迫，而且還參與水稻抗稻瘟病調(diào)節(jié)[36]。南極洲苔蘚(Polytrichichastrumalpinum)MBF1c基因能顯著增強(qiáng)擬南芥對(duì)高鹽脅迫的耐受性[37]，然而在牧草類作物中，還沒(méi)有關(guān)于MBF參與其他耐逆性的報(bào)道。本研究中，在MsMBF1c啟動(dòng)子中共發(fā)現(xiàn)了5個(gè)ABA應(yīng)答元件(ABRE、MYB2、MIC2、CBF與DPBF)，分別參與干旱(水分調(diào)節(jié))等環(huán)境脅迫調(diào)節(jié)反應(yīng)，說(shuō)明MsMBF1c可能參與了ABA介導(dǎo)的植物耐逆性調(diào)節(jié)。因?yàn)锳BA是植物耐逆調(diào)控的關(guān)鍵激素之一，特別是在抗旱反應(yīng)中對(duì)氣孔的開(kāi)閉起到至關(guān)重要的作用[38]。此外，在MsMBF1c啟動(dòng)子中還發(fā)現(xiàn)了MYB3與MYB4兩個(gè)參與冷害與病害調(diào)節(jié)順式作用元件，說(shuō)明MsMBF1c除了參與抗旱耐熱反應(yīng)外，還可能參與其他耐逆性調(diào)節(jié)。

4 結(jié)論

在無(wú)參考基因組信息的作物中，酶切連接是一個(gè)經(jīng)濟(jì)有效的獲取已知序列側(cè)翼序列的方法，對(duì)小宗農(nóng)作物重要基因啟動(dòng)子序列的獲得與功能分析有重要促進(jìn)作用。紫花苜蓿MsMBF1c啟動(dòng)子序列中有多個(gè)保守的參與植物耐熱調(diào)節(jié)及其他抗逆調(diào)節(jié)的順式作用元件，其可能是紫花苜蓿耐逆(熱)調(diào)節(jié)的關(guān)鍵作用因子。從生物信息分析、基因表達(dá)分析與組織化學(xué)染色等多個(gè)角度說(shuō)明MsMBF1c啟動(dòng)子能顯著受高溫誘導(dǎo)激活，因此可作為高溫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子用于科研與生產(chǎn)實(shí)踐。