劉明，陳遠(yuǎn)學(xué)，陳強，彭丹，喻曉，楊軍偉，徐開未*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)資源學(xué)院，四川 成都 611130；2.四川省煙草公司廣元市公司，四川 廣元 628000；3.四川省煙草公司攀枝花市公司，四川 攀枝花 617000)

化肥的使用為作物的增產(chǎn)做出了巨大貢獻，但是同時也給環(huán)境帶來了嚴(yán)重的危害，阻礙了農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。綠肥作為一種重要的有機肥料，其在減少化肥用量、提高作物產(chǎn)量、培肥土壤地力等方面起到了積極的作用，種植綠肥已成為目前土壤改良的重要手段[1-2]。在煙田冬季空閑茬口種植綠肥，具有充分利用光熱資源和保墑的作用，還能增加土壤中有機質(zhì)的含量[3]。綠肥通過發(fā)達的根系吸收深層土壤中的養(yǎng)分，尤其對土壤難溶性磷酸鹽具有較強的溶解和吸收能力，從而能提高土壤中的速效磷含量[4]，還具有富集鉀的作用[5]。土壤微生物和酶是土壤中重要的組成部分，對土壤的養(yǎng)分轉(zhuǎn)化、有機質(zhì)分解等方面起著重要作用，是衡量土壤生態(tài)環(huán)境質(zhì)量的重要指標(biāo)[6-7]。綠肥還田為土壤微生物提供了充足的碳源，可以促進微生物的生長繁殖，提高土壤微生物的活性[8-9]，同時增強土壤酶活性[10]。

根瘤菌與豆科作物之間的共生固氮可為豆科作物提供50%～90%的氮素營養(yǎng)。在大豆(Glycinemax)、花生(Arachishypogaea)、豌豆(Pisumsativum)等經(jīng)濟作物種植中，接種匹配高效的根瘤菌可以大幅度減少化肥使用，提高土壤肥力，達到增產(chǎn)目的[11-14]。根瘤菌劑也開始應(yīng)用在箭筈豌豆(Viciasativa)[15]、紫花苜蓿(Medicagosativa)[16-17]等豆科綠肥上，能增加綠肥鮮草產(chǎn)量、提高綠肥固氮能力等。豆科綠肥主要用在冬閑地，與水稻(Oryzasativa)、玉米(Zeamays)、烤煙(Nicotianatabacum)等輪作，具有增加土壤養(yǎng)分、提高土壤生物活性等作用[2-6,18-19]。但冬閑綠肥與主要糧食作物和烤煙的輪作體系中，一般未接種根瘤菌。如果能接種高效匹配的根瘤菌劑，會取得更好的經(jīng)濟效益和生態(tài)效應(yīng)[12]。面對國家“十三五”化肥零增長及減施增效的重大科技需求，本研究利用前期初篩的高效紫花苕子(Viciavillosa)根瘤菌，接種于四川廣元煙區(qū)冬閑種植的紫花苕子，充分發(fā)揮根瘤菌的生物固氮和翻壓豆科綠肥的肥土效應(yīng)，在紫花苕子翻壓還田種植烤煙減少20%施肥量的基礎(chǔ)上，探究接種根瘤菌的紫花苕子翻壓對植煙土壤肥力和土壤微生物群落的影響，為四川煙區(qū)更優(yōu)的綠肥-烤煙輪作模式提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗于2015-2016年在廣元市劍閣縣普安鎮(zhèn)光榮村烤煙主產(chǎn)區(qū)(105°42′ E、31°62′ N)進行。試驗地海拔620 m，年平均氣溫17.3 ℃，年日照時數(shù)1443.3 h，年降水量1205.4 mm。土壤類型為紫色土，pH 6.6、容重1.3 g·cm-3、有機質(zhì)26.1 g·kg-1、全氮1.1 g·kg-1、堿解氮102.7 mg·kg-1、有效磷11.5 mg·kg-1、速效鉀79.0 mg·kg-1。

1.2 供試材料

供試綠肥品種為光葉紫花苕子(以下簡稱“苕子”)。供試烤煙品種為云煙87，由廣元市煙草公司統(tǒng)一育苗提供。供試根瘤菌菌株為JSP2-5，該菌株為前期經(jīng)過砂培試驗初篩得到的高效根瘤菌。將該菌株制成根瘤菌劑，菌劑的生產(chǎn)和質(zhì)量檢測方法參照文獻[20]。經(jīng)檢測，菌劑中根瘤菌JSP2-5活菌數(shù)含量為2.9×108CFU·g-1。

1.3 試驗設(shè)計及管理

烤煙地冬閑時(2015年10月7日)種植苕子，設(shè)置3個處理，CK-不種苕子(冬閑)、V-苕子不接種根瘤菌、VR-苕子接種根瘤菌JSP2-5。小區(qū)面積36 m2(6 m×6 m)，每個處理3次重復(fù)，隨機區(qū)組排列。根瘤菌劑采用拌種法，苕子的種子用量為138 kg·hm-2，菌劑用量為15 kg·hm-2。播種前利用旋耕機翻耕試驗地，播種后再利用旋耕機將土壤表面的種子翻入土。在紫花苕子生長過程中，除接種根瘤菌外，不施用任何肥料。適當(dāng)挖排水溝，確保能排能灌。苕子初花期時(2016年3月12日，生育期187 d)翻壓回田。

苕子翻壓后45 d(2016年4月26日)種植烤煙，處理與苕子種植相對應(yīng)，同樣設(shè)置3個處理：1)CF [對應(yīng)輪作苕子季的CK-不種苕子(冬閑)]，同樣用翻壓苕子的方法進行了翻耕，按照廣元煙草公司推薦施肥量進行，即全量施肥；2)V-20%CF(對應(yīng)輪作苕子季的V)-翻壓不接種根瘤菌的苕子但減少20%施肥量；3)VR-20%CF(對應(yīng)輪作苕子季的VR)-翻壓接種根瘤菌JSP2-5的苕子但減少20%施肥量?？緹煿芾戆凑债?dāng)?shù)亓?xí)慣進行。廣元煙草公司推薦施肥量：煙草專用復(fù)合肥450 kg·hm-2(N∶P2O5∶K2O為2∶3∶5)；商品有機肥750 kg·hm-2；磷肥225 kg·hm-2；油枯300 kg·hm-2。

1.4 測定項目與方法

苕子初花期時采集苕子樣品。采樣方法：使用20 cm×20 cm的采樣框，隨機采集小區(qū)內(nèi)的地上植株及耕層的根、根瘤，每個小區(qū)重復(fù)3次。測定植株株高(皮尺測定苕子地上部分高度)、鮮干草產(chǎn)量、根產(chǎn)量、總根瘤和有效瘤數(shù)。使用H2SO4-H2O2消煮法聯(lián)合測定植株全氮、全磷、全鉀含量[21]，并計算氮磷鉀積累量，養(yǎng)分積累量(kg·hm-2)=干草產(chǎn)量×養(yǎng)分含量。

土壤樣品采樣時間為2016年4月25日(烤煙種植前)和2016年9月5日(烤煙收獲后)。采集0～20 cm的耕層土樣，用于測定土壤理化性狀、酶活性、微生物數(shù)量。其中：pH值采用電位法測定，有機質(zhì)采用重鉻酸鉀容量法測定，全氮采用凱氏法測定，堿解氮采用堿解擴散法測定，有效磷采用碳酸氫鈉浸提-鉬銻抗顯色分光光度法測定，速效鉀采用醋酸銨提取火焰光度法測定[21]。蔗糖酶采用3,5-二硝基水楊酸比色法測定；過氧化氫酶采用高錳酸鉀容量法測定；磷酸酶采用磷酸苯二鈉比色法測定；脲酶采用納氏比色法測定[22]。土壤細(xì)菌、真菌、放線菌數(shù)量采用平板菌落計數(shù)法測定[23], 所用培養(yǎng)基：細(xì)菌為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(牛肉膏3 g·L-1、蛋白胨10 g·L-1、NaCl 5 g·L-1、瓊脂15～20 g·L-1)；放線菌為高氏1號培養(yǎng)基(可溶性淀粉20 g·L-1、KNO31 g·L-1、NaCl 0.5 g·L-1、K2HPO40.5 g·L-1、MgSO40.5 g·L-1、FeSO40.01 g·L-1、瓊脂20 g·L-1、重鉻酸鉀0.102 g·L-1)；真菌為馬丁氏孟加拉紅培養(yǎng)基(葡萄糖10 g·L-1、蛋白胨5 g·L-1、KH2PO41 g·L-1、MgSO4·7H2O 0.5 g·L-1、瓊脂 20 g·L-1、孟加拉紅0.011 g·L-1、鏈霉素 0.03 g·L-1)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

使用Microsoft Excel 2010和SPSS 17.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 接種根瘤菌對苕子的影響

2.1.1接種根瘤菌對苕子生長的影響 從表1可以看出，VR(接種根瘤菌的苕子)與V(不接種根瘤菌的苕子)比較，總瘤數(shù)及有效瘤數(shù)都達顯著性差異，分別增加50.7%、77.1%。VR的鮮草產(chǎn)量、干草產(chǎn)量、根產(chǎn)量、株高均優(yōu)于V，但無顯著性差異?？梢?，接種根瘤菌抑制了無效土著根瘤菌的定殖，能顯著促進苕子的生長。

表1 接種根瘤菌對苕子生長的影響Table 1 Effects of inoculating rhizobium on V. villosa growth

注：V表示不接種根瘤菌的苕子，VR表示接種根瘤菌的苕子。同列不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。

Note: V means thatV.villosawhich was non-inoculation of rhizobium; VR means thatV.villosawhich was inoculation of rhizobium. Different small letters in the same column indicate significant difference atP<0.05 level. The same below.

2.1.2接種根瘤菌對苕子養(yǎng)分含量及積累量的影響 為有利于苕子腐解相對充分且不影響后茬烤煙煙苗的生長，在煙苗移栽前45 d即苕子初花期時就進行了翻壓回田。翻壓時苕子地上部分的養(yǎng)分含量及積累量如表2。VR的全氮、全磷、全鉀含量及氮、磷、鉀積累量均優(yōu)于V，但無顯著性差異?？梢姡臃N根瘤菌不僅能夠增加苕子的固氮量，同時能間接地促進植株對磷、鉀的吸收，從而增加植株全氮、全磷、全鉀含量，進而有效地增加植株的氮、磷、鉀積累量。

表2 接種根瘤菌對苕子植株養(yǎng)分含量及積累量的影響Table 2 Effects of inoculating rhizobium on the nutrient content and accumulation of V. villosa

2.2 翻壓接種根瘤菌的苕子對植煙土壤理化性狀的影響

2.2.1種煙前的植煙土壤理化性狀 翻壓回田45 d后，接種根瘤菌的苕子對土壤理化性狀影響較大。由表3可以看出，種煙前，VR(翻壓接種根瘤菌的苕子)與V(翻壓不接種根瘤菌的苕子)能降低土壤pH，其中VR相比CK(不種苕子的冬閑裸地)降低幅度稍大。V相比CK，有機質(zhì)、有效磷含量均達顯著性差異，分別增加24.1%、45.3%。VR相比CK，全氮、有機質(zhì)、有效磷含量均達顯著性差異，分別增加30.0%、30.8%、126.6%。VR相比V，有效磷增加55.9%，達顯著性差異。說明苕子經(jīng)過一段時間的腐解礦化，植株的養(yǎng)分釋放到土壤中，改變了土壤養(yǎng)分含量，且翻壓接種根瘤菌的苕子效果更明顯。

2.2.2收煙后的植煙土壤理化性狀 苕子翻壓176 d后(收煙后)，在土壤中經(jīng)過長時間的腐解，養(yǎng)分釋放到土壤中，增加了土壤的養(yǎng)分含量。從表3可以看出，收煙后，V-20%CF(翻壓不接種根瘤菌的苕子但減施20%的肥料)相比CF(全量施肥)的pH變化不大，而VR-20%CF(翻壓接種根瘤菌的苕子但減施20%的肥料)相比CF的pH有所增加。VR-20%CF相比CF，全氮、有效磷含量均達顯著性差異，分別增加27.3%、44.7%。VR-20%CF相比V-20%CF，有效磷含量增加64.1%，達顯著性差異。說明在減施20%的肥料后，僅翻壓苕子不僅促進烤煙的生長，還能增加土壤養(yǎng)分，培肥地力。但在減施20%的肥料后，翻壓接種根瘤菌的苕子更有利于土壤養(yǎng)分的增加和培肥地力。

表3 翻壓接種根瘤菌的苕子對植煙土壤理化性狀的影響Table 3 Effects of overturning inoculation with rhizobium of V. villosa on tobacco-planting soil properties

注：CK/CF表示不種苕子的冬閑裸地與全量施肥相對應(yīng)；V/V-20%CF表示翻壓不接種根瘤菌的苕子與翻壓不接種根瘤菌的苕子但減施20%的肥料相對應(yīng)；VR/VR-20%CF表示翻壓接種根瘤菌的苕子與翻壓接種根瘤菌的苕子但減施20%的肥料相對應(yīng)；CF表示全量施肥；V-20%CF表示翻壓不接種根瘤菌的苕子但減施20%的肥料；VR-20%CF表示翻壓接種根瘤菌的苕子但減施20%的肥料。下同。

Note: CK/CF means that theV.villosaare not planted in winter naked and full fertilization；V/V-20%CF means that overturningV.villosawhich was non-inoculation of rhizobium and overturningV.villosawhich was non-inoculation of rhizobium but reduced by 20% of the fertilizer；VR/VR-20%CF means that overturningV.villosawhich was inoculation of rhizobium and overturningV.villosawhich was inoculation of rhizobium but reduced by 20%; CF means that the full fertilization; V-20%CF means thatV.villosawhich was non-inoculation of rhizobium but reduced by 20% of the fertilizer；VR-20%CF means that overturningV.villosawhich was inoculation of rhizobium but reduced by 20%. The same below.

2.3 翻壓接種根瘤菌的苕子對植煙土壤酶活性的影響

2.3.1種煙前植煙土壤酶活 土壤酶活性是衡量土壤肥力水平的重要指標(biāo)。翻壓苕子能提高土壤酶活性(表4)，種煙前，V與CK比較，蔗糖酶活性達顯著性差異，增加62.0%。VR與CK比較，蔗糖酶、過氧化氫酶、磷酸酶均達顯著性差異，分別增加82.5%、14.6%、37.8%。說明苕子翻壓45 d后，經(jīng)過腐解礦化提高了土壤酶活性，且翻壓接種根瘤菌的苕子效果更明顯。

表4 翻壓接種根瘤菌的苕子對植煙土壤酶活性的影響Table 4 Effects of overturning inoculation with rhizobium of V. villosa on the enzyme activities of tobacco-planting soil

2.3.2收煙后植煙土壤酶活 由表4可以看出，VR-20%CF對收煙后的土壤酶活性影響明顯。收煙后，V-20%CF與CF比較，蔗糖酶、磷酸酶、脲酶均達顯著性差異，分別增加61.8%、29.8%、20.0%。VR-20%CF與CF比較，蔗糖酶、磷酸酶、脲酶均達顯著性差異，分別增加67.0%、36.9%、20.3%。VR-20%CF酶活性均優(yōu)于V-20%CF，但差異不顯著。表明在減施20%的肥料的情況下，翻壓苕子可以顯著提高土壤酶活性，但是翻壓接種根瘤菌的苕子對土壤酶活性的提高作用更明顯。

2.4 翻壓接種根瘤菌的苕子對土壤微生物數(shù)量的影響

2.4.1種煙前土壤微生物數(shù)量 種煙前(苕子翻壓45 d后)，苕子腐解為微生物提供了充足的營養(yǎng)，促使土壤中微生物大量繁殖。從圖1可以看出，V相比CK，細(xì)菌、真菌數(shù)量達顯著性差異，分別增加72.6%、95.4%。VR與CK比較，細(xì)菌、放線菌、真菌均達顯著性差異，分別增加103.0%、85.3%、236.9%。VR與V比較，放線菌、真菌數(shù)量達顯著性差異，分別增加59.4%、72.4%。可見，翻壓不接種根瘤菌的苕子能改變土壤中微生物群落結(jié)構(gòu)，而翻壓接種根瘤菌的苕子對微生物群落結(jié)構(gòu)的改變更明顯。

圖1 苕子接種根瘤菌劑對土壤細(xì)菌、放線菌、真菌數(shù)量的影響Fig.1 Effects of overturning inoculation with rhizobium of V. villosa on quantity of tobacco-planting soil microorganisms 不同字母表示差異顯著(P<0.05)。Different small letters indicate significant difference at P<0.05 level.

2.4.2收煙后土壤微生物數(shù)量 收煙后土壤中的微生物數(shù)量以翻壓接種根瘤菌的苕子處理最為突出。從圖1可以看出，V-20%CF與CF比較，真菌數(shù)量達顯著性差異，增加81.7%。VR-20%CF與CF比較，細(xì)菌、放線菌、真菌均達顯著性差異，分別增加65.1%、473.3%、426.0%。VR-20%CF與V-20%CF比較，細(xì)菌、放線菌、真菌數(shù)量達顯著性差異，分別增加33.8%、492.4%、189.5%。可見，在減施20%的肥料的前提下，翻壓不接種根瘤菌的苕子可以增加土壤細(xì)菌、真菌數(shù)量，但是對放線菌數(shù)量無增加的作用，而翻壓接種根瘤菌劑的苕子對土壤細(xì)菌、放線菌、真菌的數(shù)量增加效果明顯。

3 討論與結(jié)論

綠肥在盛花期時生物量達到最大，最適合翻壓[24]。廣元3月平均溫度是 8～17 ℃，苕子剛進入初花期，未能達盛花期。為了不耽誤烤煙種植，在初花期(烤煙種植前45 d)時就將苕子翻壓還田。豆科綠肥接種根瘤菌能有效地增加根部定殖瘤數(shù)，提高固氮量，從而促進植株生長[15-16]，本試驗結(jié)果與此一致。在苕子生育期187 d(初花期)時，接種根瘤菌能顯著增加苕子結(jié)瘤數(shù)，提高植株固氮效率，同時促進了植株對磷、鉀的吸收。苕子翻壓后腐解礦化，養(yǎng)分釋放到土壤中，為烤煙提供了良好的生長環(huán)境。

土壤的環(huán)境條件是決定烤煙品質(zhì)高低的一個重要生態(tài)因素[8,25]。孔偉等[26]研究表明，苕子翻壓后前5周內(nèi)氮釋放86.9%以上，鉀釋放90.1%以上?？緹煼N植前苕子已在土壤中腐解45 d，其氮、鉀等養(yǎng)分可能已大部分釋放，提高了土壤養(yǎng)分含量。種煙前，土壤中的養(yǎng)分含量都以翻壓接種根瘤菌的苕子處理最高，尤其是對土壤全氮、有機質(zhì)、有效磷的增加較為突出，這與其養(yǎng)分釋放相關(guān)。在烤煙種植時減少20%施肥量，以苕子釋放到土壤中的養(yǎng)分來補充烤煙苗期生長所需營養(yǎng)。收煙后，土壤中的養(yǎng)分含量還是以翻壓接種根瘤菌的苕子處理最高，尤其是對土壤全氮、有效磷的增加效果突出。翻壓接種根瘤菌的苕子處理收煙后的土壤全氮含量稍高于種煙前的土壤全氮含量，可能與后期苕子氮的釋放量有關(guān)，也可能與苕子的氮積累量有關(guān)。可見，在苕子種植時接種根瘤菌，初花期就進行翻壓，對土壤全氮、有機質(zhì)、有效磷等養(yǎng)分含量影響明顯，能有效地改善土壤肥力，達到培肥地力的目的。

土壤酶活性在一定程度上反映了土壤的肥力水平，對土壤肥力的演化具有重要影響[27-29]。土壤蔗糖酶、過氧化氫酶、磷酸酶、脲酶活性常被用來衡量植煙土壤酶活的強弱[7-8,10]。綠肥翻壓回田后，本身能夠在土壤中釋放各種酶類，為微生物提供營養(yǎng)，促進微生物大量繁殖，使其產(chǎn)生大量土壤酶[8]。本研究得出，種煙前及收煙后都是以翻壓接種根瘤菌的苕子的酶活性最高，其中蔗糖酶活性最突出。同一處理種煙前與收煙后的酶活性進行比較可以得出，種煙前的土壤酶活性都高于收煙后，這與苕子的腐解相關(guān)，由于苕子前期腐解需要大量的微生物作用，促進了酶活性的提高，而后期在烤煙生長過程中，需要大量的酶參與，從而導(dǎo)致收煙后的酶活性降低。可見，減施20%的肥料的情況下，翻壓接種根瘤菌的苕子對酶活的影響效果更佳，這可能與接種的根瘤菌有關(guān)，根瘤菌的施用使得土壤中的微生物結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而影響了土壤酶活性的變化。

土壤微生物數(shù)量是衡量土壤活力的重要指標(biāo)。微生物數(shù)量多和區(qū)系復(fù)雜的土壤，有利于烤煙健康生長[9]。翻壓綠肥能增加土壤中微生物數(shù)量[8,30]，本研究與其結(jié)論相似。綠肥在腐解的過程中，需要大量的微生物參與。本研究發(fā)現(xiàn)，種煙前土壤中的微生物數(shù)量變化較大，僅翻壓不接種根瘤菌的苕子與不種苕子的冬閑地比較，其中細(xì)菌、真菌增加都在72.6%以上，而翻壓接種根瘤菌的苕子的微生物數(shù)量更為突出，這與接種根瘤菌密切相關(guān)。收煙后，翻壓接種根瘤菌的苕子對土壤細(xì)菌、放線菌、真菌的數(shù)量影響顯著，大大地提高了三大類群微生物的數(shù)量。翻壓接種根瘤菌的苕子相比不接種根瘤菌的苕子，放線菌、真菌增量突出；相比全量施肥，細(xì)菌、放線菌、真菌增加效果顯著。結(jié)果得出，同一處理種煙前的細(xì)菌、放線菌數(shù)量都高于收煙后，可能是因為在烤煙生長過程中，大量的細(xì)菌、放線菌在土壤中發(fā)生生理生化反應(yīng)，為烤煙的生長提供營養(yǎng)物質(zhì)。而翻壓接種根瘤菌的苕子在減施20%的肥料處理收煙后的真菌數(shù)量還稍大于種煙前，這可能與苕子的翻壓量有關(guān)?？梢姡瑴p施20%的肥料的前提下，翻壓接種根瘤菌的苕子，對土壤中微生物數(shù)量影響顯著。