湯樣華，辛大偉，李國松，岳振雙，曾林如

（杭州市蕭山區(qū)中醫(yī)院 骨科，浙江 杭州 311201）

骨質疏松癥是以全身性骨量減少，單位體積骨量降低，礦鹽和骨基質比例減少，骨組織微觀結構退化為特征的疾病[1-2]。骨質疏松癥主要包括原發(fā)性、繼發(fā)性和特發(fā)性3種類型，其中糖皮質激素誘導的骨質疏松癥是繼發(fā)性骨質疏松癥的最常見形式[3]，并因此導致骨密度（bone mineral density，BMD）降低和骨折風險增加。骨質疏松癥屬于中醫(yī)“痿證”范疇，病變在骨，其本在腎，以補肝腎、強筋骨為治則。牛膝為莧科植物牛膝的干燥根，歸肝、腎經(jīng)，具有活血化瘀、補肝腎、強筋骨的作用。其中β-蛻皮甾酮（β-ecdysterone，β-Ecd）為牛膝的活性成分之一，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)[4]，β-Ecd能以劑量依賴性的方式逆轉地塞米松對成骨細胞分化、增殖的抑制和減少成骨細胞凋亡。目前BMD的測定和骨代謝生化指標檢測是骨質疏松癥的主要診斷手段。本研究通過使用潑尼松龍（prednisolone，Pred）誘導構建骨質疏松癥大鼠模型，采用β-Ecd進行干預處理，觀察其對大鼠血清骨代謝指標及BMD的影響，進一步探討β-Ecd治療糖皮質激素性骨質疏松癥的療效和作用機制。

1 材料和方法

1.1 材料 β-Ecd購自上海純優(yōu)生物科技有限公司；潑尼松龍緩釋片購自鄭州靈瑞制藥有限公司；阿侖膦酸注射液購自石家莊英創(chuàng)醫(yī)藥科技有限公司；枸櫞酸鈉溶液購自上海Jrdun生物技術有限公司；2%牛血清白蛋白購自美國Sigma-Aldrich公司；Micro-CT及分析軟件購自瑞士SCANCO醫(yī)療公司；CX41RF顯微鏡購自上海巴玖實業(yè)有限公司；70-70型全自動生化分析儀購自日本日立公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組：30只清潔級雄性Wistar大鼠[由上海實驗動物中心提供，許可證號：SCXK（滬）2016-0004]，鼠齡4周，體質量180～220 g。所有大鼠被安置在25 ℃（濕度60%～70%）的環(huán)境中，光/暗周期為12 h，可自由獲取食物和水。將大鼠隨機分為5組，每組6只。

1.2.2 動物造模和給藥：對照組：未接受任何干預治療；Pred組：在大鼠后背皮下埋入1粒潑尼松龍緩釋型藥片（2.5 mg/粒）[5]，連續(xù)4周；Pred+β-Ecd（5 mg/kg）組：在Pred組用藥的同時，皮下注射β-Ecd（5 mg/kg），周一到周五，每日1次，連續(xù)4周；Pred+β-Ecd（10 mg/kg）組：在Pred組用藥的同時皮下注射β-Ecd（10 mg/kg），周一到周五，每日1次，連續(xù)4周；Pred+阿侖膦酸（Alendronic acid，ALN）組：在Pred組用藥的同時，皮下注射ALN（3 mg/kg）周一到周五，每日1次。

1.2.3 血清骨代謝指標檢測：造模完成后，在血清分離管中采集10 mL的血液，在室溫下用800×g離心10 min，在血清分離成功后1 h內應用全自動生化分析儀測定血清鈣、磷濃度，抗酒石酸磷酸酶（tartrate-resistant phosp-hatase，TRAP）和堿性磷酸酶（alkaline phosp-hatase，ALP）活性。

1.2.4 Micro-CT測定骨結構和BMD：1個月后處死大鼠，取其第1～第5節(jié)腰椎。將大鼠第5節(jié)腰椎以3.7%中性甲醛溶液浸泡固定過夜，再浸入70%乙醇中固定24 h。用Micro-CT掃描，掃描部位為第5腰椎上下生長板之間。所用能量為70 keV，密度為85 μA。掃描213張圖（灰階圖），評估分析，以計算其骨小梁結構與厚度，并以Image Processing Language軟件處理模擬出3D結構圖。BMD以骨小梁體積（trabecular bone volume，TBV）、骨總體積（total bone volume，TBV）、骨體積分數(shù)（trabecular bone volume/total bone volume，TBV/TBV）、骨小梁厚度（trabecular thickness，Tb.Th）、骨表面積和組織體積的比值（bone surface/tissue volume，BS/TV）、骨小梁數(shù)量（trabeculae number，Tb.N）、骨小梁分離度（trabeculae separation，Tb.Sp）、結構模型指數(shù)（structural model index，SMI）表示。

1.3 統(tǒng)計學處理方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析。計量資料以 ±s表示，多組比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 血清骨代謝指標檢測結果 與對照組比，Pred組血清鈣、磷水平顯著升高，血清ALP活性和TRAP活性升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與Pred組比較，Pred+ALN組和Pred+β-Ecd（10 mg/kg）組血清鈣、磷水平明顯降低，ALP和TRAP活性也顯著降低（P＜0.05）；Pred+β-Ecd（5 mg/kg）組，血清ALP和TRAP活性減低（P＜0.05），而鈣、磷水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖1。

2.2 骨結構和BMD Micro-CT檢測結果 在所有Pred處理組大鼠中均觀察到不同程度的骨丟失。在Pred組中第5腰椎的BMD值明顯低于對照組（P＜0.05）。Micro-CT評估顯示Pred組BS/TV較對照組顯著降低。三維模型分析顯示，Pred組Tb.N、BV/TV均明顯低于對照組，Tb.Sp明顯增加（P＜0.05），但Tb.Th和SMI差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與Pred組比，Pred+ALN組和Pred+β-Ecd（10 mg/kg）組BMD、BS/TV、BV/TV和Tb.N水平顯著增加，而Tb.Sp和SMI降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與Pred組比，Pred+β-Ecd（5 mg/kg）組BMD、BS/TV、BV/TV和Tb.N水平顯著增高，而Tb.Th和Tb.Sp水平降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1和圖2。

圖1 各組大鼠血清生化指標比較

表1 各組大鼠第5腰椎BMD及微結構參數(shù)比較（每組n=6， ±s）

圖2 各組大鼠第5腰椎CT三維重建圖像

3 討論

骨質疏松癥的主要診斷評價標準包括BMD的測定和骨代謝生化指標檢測[6]。生物化學和生物力學研究表明，Pred誘導干預的大鼠BMD下降和骨小梁結構退化[7]。此外，ALP、TRAP、鈣、磷水平等生化指標的升高，提示骨吸收加重，成骨細胞活性下降，新生骨形成減少。近年來Pred誘導的骨質疏松模型已成功用于許多關于糖皮質激素性骨質疏松癥的實驗研究。研究[8-9]報道，Pred處理可降低骨礦物含量、皮質厚度、應力/應變指數(shù)和組織BMD。在本研究中，我們成功建立了Pred誘導的骨質疏松大鼠模型。

在血清骨代謝指標檢測結果中我們發(fā)現(xiàn)Pred使血清鈣、磷水平顯著升高，并提高了血清ALP活性和TRAP活性，證實Pred誘導干預后大鼠的骨吸收加重，成骨細胞活性下降，結果與相關研究報道相符[7]，也進一步表明本研究中大鼠實驗模型造模成功。但值得注意的是，在不同劑量的β-Ecd干預治療后，不僅均可抑制ALP和TRAP活性，且作用程度隨著劑量增加而增強。另一方面，隨著劑量的增加可顯著降低血清鈣、磷水平，提示骨吸收降低。

腰椎是BMD及微結構參數(shù)常用檢測部位[10]，研究表明，骨小梁結構是影響腰椎強度的關鍵因素[11]。動物解剖研究發(fā)現(xiàn)大鼠共6個椎體，其中第5、第6腰椎承受壓力最大，但第6腰椎因難以取材完整，故在BMD及微結構參數(shù)的實驗研究中一般都選擇第5腰椎來觀察。目前研究結果表明，BS/TV、BV/TV、Tb.N和Tb.Sp可能是早期檢測骨小梁結構改變的敏感變量，用于早期檢測骨小梁結構的改變，可預示骨質疏松癥的發(fā)展。也有研究報道BMD與微結構參數(shù)相關[12]。本研究通過對大鼠第5腰椎進行Micro-CT檢測發(fā)現(xiàn)，在所有Pred處理的大鼠中均觀察到不同程度的骨丟失。BMD、BS/TV、Tb.N、BV/TV均明顯降低，且Tb.Sp增加顯著。但是通過不同劑量β-Ecd進行干預治療后，能顯著逆轉增加BMD、BS/TV、BV/TV和Tb.N水平，與ALN作用結果相似。進而提示，β-Ecd可使骨質疏松性大鼠骨轉換率和BMD增高。

綜上所述，結合本研究結果表明，β-Ecd可能通過抑制骨丟失、改善骨代謝的作用機制，防治糖皮質激素性骨質疏松癥。但本研究也存在不足之處，本研究結果僅為動物整體實驗數(shù)據(jù)，尚缺乏體外分子實驗。接下來本課題組將從骨組織細胞的活性分化及自噬、凋亡的角度，對糖皮質激素性骨質疏松的分子生物學機制及β-Ecd的干預作用進行更進一步的研究。