姜盈盈，陳隆望，林岳，陳新國，鄭炎焱，盧中秋

（1.溫州醫(yī)科大學第三臨床學院 溫州市人民醫(yī)院 急診科，浙江 溫州 325000；2.溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 急診醫(yī)學中心，浙江 溫州 325015）

急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）是一種原發(fā)性或者繼發(fā)性導致腎臟功能急劇下降的綜合征，是臨床上最常見的危急重癥之一。許多因素均可誘導AKI，膿毒癥是造成重癥患者AKI的主要原因之一，其中脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）是最重要的誘導因素[1]。腎損傷因子-1（kidney injury molecule-1，KIM-1）是一種最早發(fā)現(xiàn)于非洲綠猴中的甲型肝炎病毒受體（he-patitis A virus receptor，HAVCR1）[2-3]，后來研究發(fā)現(xiàn)也在人類中表達，主要表達于近端小管的受損上皮細胞中并且具有促進腎纖維化的作用[4]，在正常人的腎組織細胞和尿液中均不能檢測出[5]。雖然KIM-1在多種AKI患者的血清和尿液中檢測出，并作為早期診斷的分子標志物，但是其本身的生物學作用以及對腎小管上皮細胞增殖和炎性反應的影響尚未見報道。本研究擬通過體外實驗研究LPS處理人腎小管上皮細胞并分析KIM-1的表達在LPS誘導HK-2細胞炎癥反應中的作用，以期為膿毒癥AKI的診斷和預防探尋新的、簡便和可靠的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料 人腎小管上皮細胞系HK-2細胞購于南京凱基生物科技有限公司；Hoechst33342/PI試劑盒購于南京凱基生物科技有限公司；LPS和CCK-8試劑盒購于北京索萊寶生物科技有限公司；兔抗人KIM-1多克隆抗體和兔抗人IL-6多克隆抗體購于美國Abcam公司；兔抗人GAPDH多克隆抗體、HRP標記的羊抗兔IgG多克隆抗體、預染蛋白Marker和ECL化學發(fā)光試劑盒購于北京康為世紀生物科技有限公司；TRIzol試劑、2×Taq PCR Mastermix、反轉(zhuǎn)錄試劑盒FastQuant RT Kit（With gDNase）、DNA Marker和BCA蛋白定量試劑盒購于北京天根生化科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基購于美國Hyclone公司；胎牛血清購于杭州四季青生物工程材料有限公司。

1.2 方法

1.2.1 CCK-8實驗：將生長覆蓋率至90%左右的HK-2細胞用胰蛋白酶消化，重懸后鋪種于96孔板中，鋪種密度為103個細胞/孔。LPS處理組中加入不同濃度的LPS，對照組加入同體積無菌PBS緩沖液，轉(zhuǎn)染組按照轉(zhuǎn)染試劑說明書配置siRNA轉(zhuǎn)染混合液后加入細胞培養(yǎng)板中，6 h更換含有100 μg/mL的LPS的完全培養(yǎng)基。5% CO2，37 ℃培養(yǎng)48 h后，加入10 μL的CCK-8溶液；加入CCK-8溶液繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，取上清液于450 nm處測定吸光度，根據(jù)同時間點各組OD值計算生長抑制率。

1.2.2 Hoechst33342/PI細胞凋亡雙染實驗：HK-2細胞生長至90%覆蓋率，用胰蛋白酶消化后鋪種于6孔板中，轉(zhuǎn)染組于次日進行siRNA轉(zhuǎn)染6 h后，處理組和轉(zhuǎn)染組中加入100 μg/mL的LPS繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細胞后低速離心2 min，去上清液后加入1 mL培養(yǎng)基重懸浮細胞并加入10 μL的Hoechst33342熒光染料，混勻后37 ℃避光染色10 min，1 000 r/min離心5 min，去上清后加入1 mL的1×Buffer A，加入5 μL的PI熒光染料后室溫避光染色10 min，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.3 RT-PCR實驗：HK-2細胞經(jīng)胰蛋白酶消化和懸浮后鋪種于6孔板中，鋪種密度為105個細胞/孔，處理組分別加入0、10、50和100 μg/mL的LPS，轉(zhuǎn)染組加入siRNA轉(zhuǎn)染混合液6 h后更換含有100 μg/mL的LPS的完全培養(yǎng)基，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)48 h。按照TRIzol試劑說明書步驟提取RNA，核酸蛋白測定儀檢測RNA溶液的OD260/OD280，按照cDNA合成試劑盒說明書步驟進行反轉(zhuǎn)錄反應，以及Taq酶混合液產(chǎn)品說明書配置PCR反應液，按表1所示引物序列設定擴增程序并進行PCR擴增反應。擴增完成后用2%的瓊脂糖凝膠進行電泳分離，凝膠成像系統(tǒng)拍照后用Image J軟件對電泳條帶進行灰度值分析，并計算目的基因的相對表達量。

表1 RT-PCR引物序列

1.2.4 Western blot實驗：藥物處理和細胞轉(zhuǎn)染方法同上，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)48 h，收集細胞并加入含有PMSF的RIPA裂解液，于冰上裂解1 h后通過BCA法測定總蛋白濃度，加入Loading buffer后煮沸，取等量蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳后，進行半干法轉(zhuǎn)膜和10%脫脂奶封閉，按照抗體說明書推薦比例對一抗進行稀釋并于4 ℃對醋酸纖維素膜孵育過夜，PBST清洗后加入HRP標記的二抗室溫孵育2 h，PBST清洗后并用ECL反應液孵育，暗室中進行曝光顯影定影。

1.3 統(tǒng)計學處理方法 采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料以 ±s表示，2組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 細胞抑制率 HK-2細胞分別加入0、10、50和100 μg/mL的LPS溶液，作用24 h后加入CCK-8并檢測細胞生存率，結果顯示10、50和100 μg/mL濃度組的LPS均能抑制HK-2細胞增殖，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖1A。用終濃度為100 μg/mL的LPS溶液處理HK-2細胞，分別處理0 h、24 h和48 h后，CCK-8檢測結果表明，在對照組中各時間段OD值差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；在LPS處理組中，處理24 h和48 h后細胞生長均受到一定程度的抑制，與0 h組相比差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖1B。

圖1 LPS對HK-2細胞增殖的抑制作用

2.2 KIM-1蛋白和基因的表達 HK-2細胞加入終濃度為0、10、50和100 μg/mL的LPS處理48 h后，RT-PCR和Western blot實驗結果提示，與對照組（0 μg/mL）比，LPS處理組中KIM-1基因和蛋白的表達均上調(diào)，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。在LPS處理組中IL-6在mRNA和蛋白水平也出現(xiàn)上調(diào)表達，同時Western blot實驗結果與RT-PCR結果一致，見圖2。

2.3 細胞凋亡 HK-2經(jīng)100 μg/mL的LPS處理48 h后，用胰蛋白酶消化并進行Hoechst33342/PI染色，熒光顯微鏡下觀察細胞的熒光強度，實驗結果顯示對照組中Hoechst33342和PI都呈弱陽性，而在LPS處理組細胞中，Hoechst33342染色呈強陽性，PI染色呈弱陽性，提示LPS處理組細胞主要為細胞凋亡狀態(tài)，見圖3。

2.4 靶向KIM-1基因siRNA轉(zhuǎn)染 HK-2細胞鋪種于6孔板，次日轉(zhuǎn)染靶向KIM-1基因的siRNA，6 h后更換含有100 μg/mL的LPS的完全培養(yǎng)基，細胞培養(yǎng)48 h后，RT-PCR和Western blot實驗結果顯示在siRNA轉(zhuǎn)染組中，KIM-1基因的表達水平明顯低于siRNA-NC組，同時IL-6的表達水平也明顯低于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖4。

2.5 靶向KIM-1基因siRNA轉(zhuǎn)染對增殖的影響 轉(zhuǎn)染靶向KIM-1基因的siRNA的HK-2細胞加入100 μg/mL的LPS后分別培養(yǎng)24 h和48 h，CCK-8實驗結果顯示在siRNA轉(zhuǎn)染組中，處理24 h和48 h后siRNA-1和siRNA-2組細胞增殖能力均強于siRNA-NC組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖5。

圖2 不同濃度LPS處理HK-2細胞后對KIM-1和IL-6基因表達的影響

圖3 Hoechst33342染色觀察LPS處理對HK-2細胞凋亡的影響

2.6 靶向KIM-1基因siRNA轉(zhuǎn)染對細胞凋亡的影響 轉(zhuǎn)染靶向KIM-1基因的siRNA的HK-2細胞加入100 μg/mL的LPS后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，胰蛋白酶消化細胞成單細胞懸液，按照試劑盒說明書進行Hoechst33342染色，熒光顯微鏡下觀察細胞的熒光強度并拍照，結果顯示siRNA-1和siRNA-2組中Hoechst33342染色強度均低于siRNA-NC組，提示靶向KIM-1基因siRNA轉(zhuǎn)染可以抑制LPS誘導的細胞凋亡，見圖6。

3 討論

KIM-1是一種跨膜糖蛋白，在各種誘因?qū)е碌哪I損傷過程中表達上調(diào)，并且還與腎損傷修復、炎癥細胞浸潤及及腎纖維化過程有關。在膿毒癥誘導的免疫應答過程中KIM-1出現(xiàn)表達上調(diào)，可能作為炎癥介導因子參與多種慢性炎癥疾病的發(fā)生發(fā)展。KIM-1是一種由上皮細胞受損后表達于細胞表面的免疫球蛋白超家族成員之一。KIM-1在受傷的上皮細胞中表達增加，并將上皮細胞轉(zhuǎn)移至巨噬細胞處以清除細胞凋亡和壞死細胞，由KIM-1上調(diào)表達介導的受損細胞被吞噬細胞所吞噬將影響AKI嚴重程度[6]。

KIM-1作為一種指標，應用于近端腎小管損傷的早期檢測，臨床研究發(fā)現(xiàn)在確診AKI患者的血清和尿液中KIM-1含量升高，較敏感，可以做為膿毒癥AKI在早期診斷的指標。國內(nèi)學者通過高糖條件體外培養(yǎng)大鼠腎小管上皮細胞，研究發(fā)現(xiàn)高糖組細胞KIM-1的mRNA和蛋白水平于12 h處理后明顯上升，KIM-1基因的siRNA轉(zhuǎn)染組細胞中單核細胞趨化蛋白1和纖維連接蛋白表達明顯減少，研究結果提示KIM-1可能參與了糖尿病腎病腎間質(zhì)纖維化進程[7]。還有研究證實HK-2細胞在缺氧復氧模型中KIM-1的表達與HIF-1α相關，而且HIF-1α可以與KIM-1基因啟動子區(qū)相結合參與基因在轉(zhuǎn)錄調(diào)控，因此推測KIM-1作為HIF-1α下游分子參與腎損傷和修復過程[8]。

圖4 LPS處理的HK-2細胞轉(zhuǎn)染siRNA后對KIM-1和IL-6基因表達的影響

圖5 siRNA轉(zhuǎn)染和LPS處理不同時間對HK-2細胞增殖的影響

本研究通過體外實驗建立LPS誘導HK-2細胞炎癥模型，研究KIM-1在LPS介導的炎癥過程中可能發(fā)揮的生物學作用及參與的信號途徑。結果顯示，LPS處理的HK-2細胞出現(xiàn)KIM-1基因mRNA和蛋白水平的上調(diào)表達，但是參與的信號途徑尚未闡明，不過有報道指出腎素-血管緊張素系統(tǒng)（RAS）和MAPK活化誘導的腎損傷可介導KIM-1的表達，并且RAS阻斷劑和p38 MAPK激酶抑制劑可以調(diào)節(jié)KIM-1的表達[9]。LPS通過誘導MAPK信號途徑活化介導下游分子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控已經(jīng)得到廣泛的研究，大腸桿菌LPS通過MAPK活化誘導腸道上皮細胞熱休克蛋白25的表達[10]，LPS通過激活PI3K/Akt和MAPK信號途徑激活Smad途徑，通過誘導肝星狀細胞轉(zhuǎn)化從而發(fā)揮促肝纖維化作用[11]，LPS誘導小鼠牙周膜成纖維細胞表達MMP-13需要先通過活化p38信號途徑，從而介導轉(zhuǎn)錄調(diào)控[12]。因此，可以推測LPS可能通過誘導p38 MAPK激酶信號途徑活化介導KIM-1的轉(zhuǎn)錄翻譯調(diào)控。

圖6 siRNA轉(zhuǎn)染對經(jīng)LPS處理的HK-2細胞凋亡的影響

IL-6是一種促炎細胞因子，可通過與細胞中IL-6受體結合可溶性刺激靶細胞并介導缺血性AKI和AKI小鼠肺損傷[13-14]。IL-6在缺血性AKI中的作用機制可能與腎小管細胞中反式信號轉(zhuǎn)導和STAT3激活有關[15]。在通過藥物干預炎癥反應的研究中，有學者報道深低溫治療可以通過抑制STAT-3的磷酸化以及下游IL-6和TNF-α的表達，從而緩解由LPS誘導的小膠質(zhì)細胞炎癥反應，有效保護神經(jīng)功能[16]。吡格列酮通過調(diào)節(jié)NF-κB/STAT3、CREB/BDNF途徑和中樞5-羥色胺能神經(jīng)傳遞，從而減輕LPS誘導的抑郁樣行為[17]。在本研究中，LPS處理的HK-2細胞表現(xiàn)出增殖受抑制，并且伴隨KIM-1和IL-6 mRNA和蛋白水平的上調(diào)表達，但是尚未對其是否存在轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用及其分子機制做相關研究，根據(jù)文獻報道可能是通過由LPS激活NF-κB/STAT3信號途徑活化所介導。本研究實驗結果顯示KIM-1的下調(diào)表達對IL-6的表達水平具有一定的干預作用，但是IL-6的表達水平是否依賴于KIM-1目前尚未見報道，涉及到的信號途徑以及轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制需進一步研究。