朱碎永，金方思，施順秋，裘曉樂，鄭婷婷

（溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院 輸血科，浙江 溫州 325027）

ABO血型系統(tǒng)是臨床上最重要的血型系統(tǒng)，它在輸血、生物學、遺傳學、法醫(yī)學和人類學等方面被廣泛應用[1-2]。常見ABO血型有A、B、O、AB 4種表型，人群中也發(fā)現(xiàn)一定數(shù)量的ABO變異型，這些ABO變異型血型表現(xiàn)為凝集強度改變或正反定型不一致，用鹽水試管法和微柱凝膠血型卡檢測易出現(xiàn)漏檢現(xiàn)象[3-6]。為提高微柱凝膠法的檢測敏感度，避免出現(xiàn)漏檢，本研究通過改變微柱凝膠法離心方式，增加孵育時間，調(diào)整孵育溫度，建立改良微柱凝膠法，現(xiàn)報告如下。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2016年11月至2018年5月溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院、溫州市人民醫(yī)院和瑞安市人民醫(yī)院ABO血型凝集強度改變或正反定型不一致的患者12例，男7例，女5例，年齡21～69歲。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準，血液采集均征得本人及家屬的知情同意。

1.2 試劑和儀器 ABO血型定型血清（北京金豪生物試劑有限公司、上海血液生物醫(yī)藥有限責任公司）；抗A抗H（上海血液生物醫(yī)藥有限責任公司）；A、B、O試劑紅細胞（江蘇力博生物技術有限公司）；1%O型混合紅細胞20例（本課題組自制，每例取3份同1名獻血員紅細胞混合后洗滌4次）；基因組DNA提取試劑盒、基因分型檢測試劑盒和人類紅細胞類孟買血型基因分型檢測試劑盒（天津秀鵬生物技術開發(fā)有限公司）；微柱凝膠血型卡（ABO、RhD血型抗原檢測卡，江蘇力博生物技術有限公司）；醫(yī)用低速離心機（江蘇力博生物技術有限公司）；PCR擴增儀（美國ABI公司）；3730基因測序儀（美國ABI公司）；醫(yī)用冷藏箱（青島海爾特種電器有限公司）。所有試劑均在有效期內(nèi)使用。

1.3 方法

1.3.1 ABO血型檢測：ABO正反定型采用單克隆抗A、抗B血型定型試劑、ABO標準紅細胞進行鹽水試管凝集法檢測；H抗原用抗H血清鹽水試管凝集法檢測。

1.3.2 ABO血型復核：將待測標本用0.9%氯化鈉溶液配制成1%紅細胞懸液，加入微柱凝膠血型卡腔中，置離心機，按說明書要求離心，觀察結果。

1.3.3 吸收放散試驗：取待測標本壓積紅細胞1 mL，用0.9%氯化鈉溶液洗滌3次后加入等量抗A或抗B血清，4 ℃吸收1 h，0.9%氯化鈉溶液洗滌3次（末次洗滌液檢測不到抗體），加入1/2體積0.9%氯化鈉溶液，置56 ℃放散10 min，離心取放散液，加A或B型試劑紅細胞離心檢測[7]。

1.3.4 分子生物學鑒定：用DNA試劑盒對標本進行基因DNA提取，用序列特異性引物-聚合酶鏈式反應（sequence specific primers polymerase chain reaction，PCR-SSP）法進行基因分型，嚴格按照其儀器試劑說明書進行。

1.3.5 改良微柱凝膠法建立：①離心方式的調(diào)整。取1% O型紅細胞懸液50 μL加入微柱凝膠血型卡中，900 r/min分別離心0.5、1、1.5、2、2.5、3 min，使紅細胞進入抗血清中而不進入凝膠中為最適離心時間1，分別置4 ℃冰箱15、30、45、60 min，1500 r/min分別離心2、2.5、3、3.5、4 min，紅細胞全部進入凝膠底部的最短時間為最適離心時間2。②孵育溫度的選擇。選IgM抗體和ABO血型抗原反應最適溫度4 ℃為孵育溫度。③孵育時間的確定。取1%已知ABO變異型血型標本紅細胞50 μL加入微柱凝膠血型檢測卡中，900 r/min最適離心時間1離心，分別置4 ℃冰箱15、30、45、60 min，1 500 r/min最適離心時間2離心，以最短時間凝集最強者為最適孵育時間。

2 結果

2.1 患者ABO血型血清學和基因檢測 對12例凝集強度改變或正反定型不一致的標本，采用血型血清學檢查及部分標本血型基因檢測結合臨床表現(xiàn)確認其ABO血型，結果顯示，12例標本中A3亞型1例，B（A）型3例，A類孟買型（Amh）1例，B類孟買型（Bmh）2例，A抗原減弱3例，B抗原減弱2例。見表1。

2.2 微柱凝膠法復核 全部標本用微柱凝膠血型卡檢測，同鹽水試管法比較，2種方法檢測敏感度相似，在12例標本中只檢出1例A3亞型和1例B（A）型紅細胞上的A抗原，檢出比例為2/12。見表1-2。

2.3 改良微柱凝膠法的建立

2.3.1 確定離心方式：對20例O型標本測試確定孵育前離心時間為900 r/min離心2 min，4 ℃孵育后1 500 r/min離心3 min。

2.3.2 確定孵育時間：對1例A3亞型和1例A抗原減弱標本紅細胞進行檢測，4 ℃孵育15、30、45、60 min檢測敏感度分別為±、1+、1+、1+，重復測試10次，結果一致?？梢?，4 ℃孵育30 min是理想的最短有效時間。

2.3.3 改良微柱凝膠法的確立：取50 μL 0.8%～1%待檢紅細胞加入微柱凝膠血型卡中，900 r/min離心2 min，置4 ℃冰箱孵育30 min，1 500 r/min離心3 min。

2.4 改良微柱凝膠法檢測 全部標本用改良微柱凝膠法進行檢測，檢測結果顯示，改良微柱凝膠提高了檢測敏感度，12例標本中僅1例B抗原減弱檢測不出來，檢出比例為11/12。見表2。

表1 12例患者ABO血型血清學和血型基因檢測結果

表2 12例患者血清標本微柱凝膠法和改良微柱凝膠法檢測結果

3 討論

AB亞型、B（A）型、類孟買型、ABO抗原減弱型等ABO變異型均以抗原性弱為主要特征的ABO血型表型。在實驗室常規(guī)鹽水試管檢測中，ABO變異型紅細胞上ABH抗原凝集非常弱或檢測不到[8-9]。本研究12例標本中1例標本抗A血清檢測為混合凝集反應，難以判定血型；8例標本用抗A、抗B血清不能檢測出A或B抗原，血清中不能檢測出相應的抗體，正反定型不一致；1例標本抗A混合凝集反應，抗B強凝集，反定型檢出弱抗A，正反定型不一致，難以判定血型；2例標本抗A血型檢測不凝集，抗B強凝集，反定型檢出弱抗A，最容易檢測為B型。為確定ABO血型，本研究對12例標本做吸收放散試驗和H抗原檢測，以確定標本紅細胞上A、B和H抗原的存在，部分標本進一步檢查血型基因確定其ABO血型。然而對臨床急危重患者緊急用血時，吸收放散試驗操作繁瑣、費時，需經(jīng)驗豐富的操作人員操作；基因檢測操作更是復雜、耗時，這嚴重影響臨床及時輸血治療和輸血安全。經(jīng)吸收放散試驗和H抗原檢測結合部分基因檢測，本研究中12例標本血型分別為A3亞型1例，B（A）型3例，A類孟買型1例，B類買孟型2例，A抗原減弱3例，B抗原減弱2例?？梢姡Ｒ?guī)鹽水試管法難以勝任ABO變異型血型的篩查。微柱凝膠法能很好地把血型血清學技術與凝膠分子篩技術有機結合起來，具有操作簡便、易于自動化、標準化、結果可靠、特異性強、易于保存和核對等優(yōu)點，早在20世紀初歐美發(fā)達國家已將其作為常規(guī)紅細胞血型血清學檢測技術應用于臨床[10-11]，國內(nèi)一些醫(yī)院和血站在2000年左右開始用微柱凝膠法檢測ABO、RhD血型[12-14]。目前，微柱凝膠法檢測ABO、RhD血型已在市縣級甚至于鎮(zhèn)級醫(yī)院開展。然而該法在常溫下進行，微柱凝膠柱內(nèi)抗血清量有限（15 μL左右），且抗血清分布高度只有2～3 mm，故離心時紅細胞與柱內(nèi)抗血清實際接觸時間極短，鑒定時，如紅細胞上相應抗原位點減少，紅細胞和紅細胞之間來不及搭橋就直接被離心到柱底，因此敏感度不是非常高，抗原減弱型和亞型可出現(xiàn)漏檢[15-17]。本研究中12例ABO變異型血型用上述2種方法檢測發(fā)現(xiàn)，微柱凝膠法和常規(guī)鹽水試管法檢測敏感度相似，檢出比例為2/12，與文獻報道[18-19]相同，顯然微柱凝膠法也不適合于ABO變異型血型的篩查。

為提高ABO變異型血型的篩出率和盡量減少操作難度和時間，必須運用操作簡便而敏感度高的檢測方法。林海芬等[20]用加入抗血清的方法來提高檢測ABO血型的敏感度，此法雖能檢出ABO抗原減弱血型，但只能應用于已知個別標本的檢測，不能用于批量標本的鑒定。為此，本研究通過改變微柱凝膠法離心方式，增加孵育時間，調(diào)整孵育溫度，建立改良微柱凝膠法，使抗原和抗體在最適溫度下有較長的反應時間，以提高檢測敏感度。本研究中12例ABO變異型標本用改良微柱凝膠法檢測，結果顯示，1例A3亞型、3例B（A）型、3例A類孟買型、3例A抗原減弱型和1例B抗原減弱型均檢出A或B抗原，僅1例B抗原減弱型檢測不出B抗原，檢出比例高達11/12，明顯高于微柱凝膠法和常規(guī)鹽水試管法2/12的檢出比例?？梢?，改良微柱凝膠法通過延長孵育時間、調(diào)整孵育溫度，使抗原和抗體在最適反應溫度下有較長的反應時間，提高了對ABO變異型血型的檢測敏感度。

綜上所述，改良微柱凝膠法不改變微柱凝膠血型卡組成成分和批量標本的檢測，僅通過改變微柱凝膠血型卡的離心方式，增加孵育時間，調(diào)整孵育溫度，提高了檢測敏感度，適合ABO變異型血型的篩檢。