呂望 王勝男 金煥治 林岳 陳新國

近年來對肺動脈高壓（pulmonary arterial hypertension，PAH）的認識發(fā)生明顯轉(zhuǎn)變。PAH曾經(jīng)被認為是由血管收縮張力增加引起的，然而血管擴張劑沒有達到令人滿意的臨床結(jié)果?，F(xiàn)在認為PAH的特征性血管異常

主要表現(xiàn)為遠端肺小動脈的內(nèi)膜增厚，進而導(dǎo)致PAH的發(fā)生，最終右心衰竭是患者主要的死亡原因[1]。炎癥在驅(qū)動血管平滑肌細胞的過度增殖以及隨后血管結(jié)構(gòu)變化中發(fā)揮了重要的作用。含核苷酸結(jié)構(gòu)域的Nod樣受體家族3（NLRP3）炎性小體是一種存在于細胞內(nèi)的多蛋白復(fù)合物，可被多種病原體或危險信號所激活，通過活化半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶-1、IL-1、IL-18等促炎細胞因子的成熟和分泌，調(diào)節(jié)免疫和炎癥反應(yīng)。芒柄花素是黃芪根中的O-甲基化異黃酮植物雌激素，具有多種生物學(xué)效應(yīng)，包括抗氧化、抗炎、抗腫瘤和抗癌等作用[2-4]。近年來研究提示在多種心血管疾病中也具有重要作用[5-6]，但在PAH中的作用及機制尚不明確。因此本實驗通過皮下注射野百合堿（monocrotaline，MCT）建立大鼠PAH模型，觀察芒柄花素對血管壁增厚的影響及可能的分子機制，現(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 MCT（美國Sigma-Aldrich）；芒柄花素 HE染色試劑盒（武漢博士德公司）；抗α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA） 抗體（美國 Sigma-Aldrich）；抗NLRP3抗體、鼠兔二抗（美國Cell Signaling Technology公司）；抗β-actin抗體（武漢博士德公司）；TNF-α、IL-1和IL-6的ELISA試劑盒（英國Abcam公司）；RIPA裂解液和蛋白酶抑制劑（中國碧云天公司）。

1.2 動物分組與模型制備 32只SD雄性大鼠（體重180～220g）購自浙江省醫(yī)學(xué)實驗動物中心。動物實驗開始前適應(yīng)性喂養(yǎng) 2～3d，自由飲食飲水，每籠飼養(yǎng) 4只。將32只大鼠隨機分為對照組、MCT組、芒柄花素低劑量組（25mg/kg）和芒柄花素高劑量組（50mg/kg），每組8只。除對照組外，其余各組大鼠一次性皮下注射60mg/kg MCT（將0.2g MCT溶解于1mol/L鹽酸中，先加入1mol/L氫氧化鈉調(diào)整pH至7.35～7.45，再加入0.9%氯化鈉注射液定容至10ml）；對照組大鼠注射相同劑量的0.9%氯化鈉注射液；芒柄花素低劑量和高劑量組大鼠于MCT注射2周后予芒柄花素（用橄欖油溶解，0.2mg/ml）灌胃，劑量分別為25mg/kg和50mg/kg，1次/d，連續(xù)14 d。對照組及MCT組大鼠予等量橄欖油灌胃。

1.3 血流動力學(xué)和心室重量測定 造模4周后，將大鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉60mg/kg麻醉，切開右側(cè)頸部組織，分離出右頸外靜脈，將3.5號臍靜脈導(dǎo)管從右頸外靜脈插入右心室，可見振幅明顯的右心室波，記錄并分析右心室收縮壓（right ventricular systolic pressure，RVSP），處死大鼠后取出心肺，分離心臟，剪去心房，沿室間隔邊緣剪出右心室，留下室間隔和左心室，沿室間隔邊緣修剪，均由同一人員操作。稱量右心室重量（RVW）、左心室及室間隔的重量（LV+s），計算右心肥厚指數(shù)（RVHI）=RV/（LV+s）。

1.4 肺小動脈結(jié)構(gòu)觀察 切取肺組織，石蠟包埋后切片3μm，按常規(guī)方法脫蠟至水，然后將切片行HE染色，選取外徑50～200μm的肌性小動脈，觀察動脈管壁厚度。

1.5 α-SMA和NLRP3表達的檢測 采用Westem blot法。提取肺動脈總蛋白，蛋白變性，使用12%SDS-PAGE分離蛋白；采用半干轉(zhuǎn)方法將蛋白轉(zhuǎn)印至NC膜上，使用5%脫脂牛奶室溫封閉NC膜1h；封閉完成后，漂洗NC膜，并在其上加入α-SMA和NLRP3的一抗于4℃過夜；次日清晨漂洗NC膜，加入鼠二抗室溫1h；二抗孵育結(jié)束后顯色，定影后通過凝膠圖像儀處理，將膠片進行掃描，再系統(tǒng)分析目標帶的分子量和凈光密度值。根據(jù)條光帶密度值除以β-actin作歸一化處理，得到α-SMA和NLRP3蛋白的表達水平。

1.6 NLRP3 mRNA表達水平的檢測 采用Trizol法提取肺動脈總RNA，將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用實時熒光定量PCR檢測mRNA水平。引物序列如下：NLRP3：5′-ACAGACAAGATTTGAAAGAAGCGGTGA，3′-TCCGAAGTTGGTGG G CCAGA，β-actin：5-CTGCCTGACGGCCAAGTC，3′-CAAGAAGGAAGGCTGGAAAAGA。以β-actin作歸一化處理后，得到NLRP3 mRNA的表達水平。

1.7 炎癥因子檢測 大鼠麻醉后，用5ml注射器在腹主動脈抽取動脈血，3 000r/min離心10min，并儲存于-80℃保存。采用ELISA法檢測血清中TNF-α、IL-1和IL-6水平。具體操作按照試劑盒的說明。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Dunnet-t法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.14 組大鼠RVSP、RVW、RVHI的比較 與對照組相比，MCT 組RVSP、RVW、RVHI均顯著增加（均P＜0.05）；與MCT組比，芒柄花素低劑量組和芒柄花素高劑量組RVSP、RVW、RVHI均顯著降低（均P＜0.05），見表 1。

2.2 4組大鼠肺血管壁增厚以及α-MSA表達的比較HE染色結(jié)果表明，與對照組比較，MCT組的肺動脈管壁明顯增厚，管腔明顯狹窄，而芒柄花素低劑量組和芒柄花素高劑量組可明顯改善這一病理變化，詳見圖1（見插頁）。與對照組相比，MCT組α-SMA的表達明顯上調(diào)（P＜0.05），而芒柄花素低劑量組和芒柄花素高劑量組α-SMA顯著降低（P＜0.05），詳見圖2和表2。

表14組大鼠RVSP、RVW、RVHI的比較

圖2 4組大鼠肺組織α-SMA蛋白表達電泳圖

表2 4組大鼠α-SMA蛋白表達水平的比較

2.3 4組大鼠血清 TNF-α、IL-1、IL-6、水平的比較 與對照組相比，MCT 組血清 TNF-α、IL-1、IL-6、水平均明顯增加（均P＜0.05），而芒柄花素低劑量組和芒柄花素高劑量組TNF-α、IL-1、IL-6、水平均顯著降低（均P＜0.05），見表 3。

表3 4組大鼠血清TNF-α、IL-1、IL-6水平的比較（pg/ml）

2.4 4組大鼠NLRP3 mRNA以及蛋白表達水平的比較與對照組相比，MCT組NLRP3 mRNA和蛋白表達水平均明顯上調(diào)（均P＜0.05），而芒柄花素低劑量組和芒柄花素高劑量組NLRP3 mRNA水平以及蛋白表達水平均顯著降低（均P＜0.05），見表4。

表4 4組大鼠NLRP3 mRNA以及蛋白表達水平的比較

3 討論

PAH患者由于肺小血管阻力和壓力的逐漸增加損害右心室功能，導(dǎo)致右心衰竭，并最終導(dǎo)致患者死亡[7]。本研究中對于MCT誘導(dǎo)的PAH大鼠模型，芒柄花素治療使得反映肺動脈壓的RVSP明顯下降。右心室對壓力負荷增加的反應(yīng)被認為是提示預(yù)后的關(guān)鍵[8]。相比于對照組，MCT處理的大鼠肺小動脈管腔狹窄以及右心室肥厚，芒柄花素減輕MCT誘導(dǎo)的肺小動脈重構(gòu)和隨后出現(xiàn)的右心肥厚。金雀異黃素、白藜蘆醇已被證明可預(yù)防MCT誘導(dǎo)的大鼠PAH[9-10]，雖然這些研究已經(jīng)證明了天然抗氧化劑在PAH中的潛在益處，但其潛在機制尚未完全確定。本研究結(jié)果提示芒柄花素作為PAH的另一種潛在治療方法，并發(fā)現(xiàn)了PAH中抗炎劑的共同作用機制。

炎癥在人類PAH以及實驗?zāi)Ｐ椭卸计鹬P(guān)鍵作用[11-12]。對于外界損傷和應(yīng)激的反應(yīng)，肺血管細胞產(chǎn)生炎癥介質(zhì)，從而招募炎癥細胞。炎性細胞可能延長細胞因子和生長因子的釋放，形成正反饋回路。在PAH中這些過程可導(dǎo)致血管重塑、基質(zhì)重塑、膠原沉積、血管細胞增殖和遷移，最后肺阻力增加和右心衰竭。除了增加血管周圍和血管內(nèi)的積累外，某些細胞因子和趨化因子的循環(huán)水平異常升高。其中包括IL-1β、IL-6、IL-8、單核細胞趨化蛋白-1、FractAlgin、CcL5/RANTES 和 TNF-α[13]。這些細胞因子和趨化因子中的一些與PAH患者的不良臨床結(jié)果密切相關(guān)，并且可以作為疾病進展的生物標志物。在PAH的患者中觀察到IL-1β和TNF-α與細胞外基質(zhì)蛋白的積累有關(guān)，而其他的如IL-6與平滑肌細胞的增殖有關(guān)[14]。TNF-α相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體在許多PAH實驗?zāi)Ｐ椭幸驯蛔C實在內(nèi)皮細胞凋亡和平滑肌細胞增殖中起關(guān)鍵作用，其抑制與疾病病理的預(yù)防呈正相關(guān)。在骨形態(tài)發(fā)生蛋白和5-羥色胺和IL-1信號調(diào)節(jié)下，骨保護素在PAH患者的平滑肌細胞和血清中高表達，并能刺激其遷移和增殖[15]。本研究同樣發(fā)現(xiàn)MCT誘導(dǎo)的PAH使得血清TNF-α、IL-1和IL-6增加，而芒柄花素能抑制它們的增加，說明芒柄花素能通過抑制炎癥反應(yīng)，從而抑制肺小動脈的重構(gòu)。最終芒柄花素作為一種抗炎劑可以抑制肺動脈壓力的升高，防治右心衰竭。

NLRP3在多種類型的肺損傷中被激活。肺泡巨噬細胞NLRP3炎性小體可增加肺泡伸展性，誘導(dǎo)IL-1的釋放。在急性肺損傷模型中NLRP3缺陷小鼠表現(xiàn)出炎癥反應(yīng)的抑制和肺上皮細胞凋亡的減少。同樣的抑制NLRP3的表達可以降低TNF-α、IL-6以及減緩急性肺損傷[16]。多個抗炎劑在MCT誘導(dǎo)的PAH都展現(xiàn)了良好的作用，進一步提示諸如TNF-α、IL-1以及IL-6在PAH中也發(fā)揮了關(guān)鍵的作用[17-18]。本研究表明MCT可以誘導(dǎo)TNF-α、IL-1以及IL-6的升高和NLRP3炎性小體的激活?？紤]到TNF-α、IL-1以及IL-6在PAH發(fā)病機制中的作用，以及炎性體和炎癥因子的相互作用，我們認為抗炎劑對PAH的作用可能就是通過抑制NLRP3炎性小體來實現(xiàn)。

總之，芒柄花素通過抑制NLRP3信號通路減輕炎癥反應(yīng)，從而減少肺小動脈的重構(gòu)，最終治療PAH。炎癥是PAH發(fā)生、發(fā)展的重要過程。因此，本研究發(fā)現(xiàn)NLRP3炎癥通路在PAH中可能的重要作用，為PAH的防治提供了新的治療思路。