黃青華 沃銘毅 陳敏強(qiáng) 袁武鋒 趙嫣 費(fèi)鮮明
動脈粥樣硬化(AS)是冠心病等心腦血管疾病的主要病理基礎(chǔ)[1]。慢性炎癥反應(yīng)對AS的發(fā)展起著重要促進(jìn)作用,其中單核細(xì)胞與血小板聚集體(MPA)形成所誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)在AS的發(fā)生和發(fā)展中扮演重要的角色[2-3]。MPA可通過NF-κB信號通路誘導(dǎo)單核細(xì)胞活化而引起環(huán)氧化酶-2(COX-2)表達(dá)增高[4];筆者既往研究表明,木瓜蛋白酶可通過抑制中心因子AKT磷酸化而降低MPA誘導(dǎo)的單核細(xì)胞COX-2表達(dá),并抑制單核細(xì)胞粘附和分泌功能,提示單核細(xì)胞COX-2可能在AS及冠心病的發(fā)生、發(fā)展中扮演重要角色[5]。因此,單核細(xì)胞COX-2表達(dá)增高可能有助于預(yù)測AS及冠心病的發(fā)生,并可作為其風(fēng)險(xiǎn)標(biāo)志物。筆者通過觀察冠心病患者外周血單核細(xì)胞COX-2表達(dá),探討其與MPA形成和冠心病發(fā)生之間的關(guān)系,現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。
1.1 對象 收集2017年10月1日至12月31日在我院住院的冠心病患者66例,男41例,女25例,年齡34~78(46.0±25.0)歲;其中穩(wěn)定型心絞痛(SA)37 例,男24 例,女 13 例,年齡 34~72(47.6±18.3)歲;不穩(wěn)定型心絞痛(UA)29例,男 19例,女 10例,年齡 37~78(49.2±17.1)歲。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)AS 性心臟病患者;(2)符合冠心病診斷標(biāo)準(zhǔn);(3)首次入院確診者;(4)入院后治療前。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)急性心肌梗死;(2)急慢性感染或炎癥;(3)高血壓;(4)肝腎功能異常;(5)惡性腫瘤;(6)腦血管疾??;(7)動靜脈血栓史;(8)手術(shù)后;(9)孕婦;(10)2 周內(nèi)服用過任何藥物;(11)1個(gè)月內(nèi)使用過抗血栓藥物。收集同期在我院健康體檢者30例作為正常對照組,男20例,女 10 例,年齡 35~72(45±23)歲;均無常規(guī)血液學(xué)檢驗(yàn)、超聲、X線等檢查異常者。本研究均經(jīng)患者或其家屬以及體檢人員知情同意。各組間性別、年齡的比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P<0.05)。
1.2 主要試劑與儀器、材料 CD41-FITC及CD14-PE單克隆抗體(法國Immunotech公司),COX-2單克隆抗體(美國Cell Signaling生物技術(shù)公司),細(xì)胞裂解液和TEN緩沖液(自配),MCP-1 ELISA試劑盒(美國Bioscience公司),淋巴細(xì)胞分離液(北京鼎國昌盛生物技術(shù)公司),RPMI1640培養(yǎng)液(上海佳和生物科技有限公司)。FBS(美國Hyclone公司)。FC500-MCL流式細(xì)胞儀(美國Beckman-Coulter公司)、Mindray BC-6800血細(xì)胞分析儀和CRP-M100分析儀(中國邁瑞醫(yī)療公司),酶標(biāo)儀(美國BIO-RAD公司)、改良Neubauer計(jì)數(shù)板。
1.3 MPA水平和炎癥指標(biāo)測定 清晨空腹采集冠心病患者和志愿者靜脈血。采集枸櫞酸三鈉1∶9抗凝血2.7ml,加入CD14和CD41單克隆抗體,以流式細(xì)胞儀檢測同時(shí)表達(dá)CD41和CD14的血小板比例,即MPA水平(%);采集EDTA-K2抗凝血2ml,以血細(xì)胞分析儀測定WBC、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞,并計(jì)算中性粒細(xì)胞-淋巴細(xì)胞比值(NLR),以CRP-M100分析儀測定超敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)濃度;采集無抗凝血 3ml,1 500g離心分離血清,采用單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)ELISA試劑盒測定MCP-1水平。操作均嚴(yán)格按照儀器和試劑盒說明書進(jìn)行。
1.4 外周血單核細(xì)胞分離、處理和COX-2水平檢測按照筆者以往研究中的單核細(xì)胞分離、處理和Western blot檢測方法[5]。具體為:取健康人員和冠心病患者靜脈血3~5ml,肝素抗凝,F(xiàn)icoll密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC),用含10%FBS的RPMl1640培養(yǎng)液懸浮,置6孔板中培養(yǎng),37℃、5%CO2孵箱貼壁2h后,用預(yù)溫培養(yǎng)基洗去未黏附細(xì)胞,懸浮細(xì)胞可重復(fù)黏附,得到更多貼壁,以培養(yǎng)基重新懸浮貼壁細(xì)胞,以流式細(xì)胞儀檢測表達(dá)CD14的細(xì)胞比例,表達(dá)率>90%為符合要求。然后以Neubauer計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞數(shù)為5×105個(gè)/ml。以β-actin為內(nèi)參,前述單核細(xì)胞懸液以細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞,充分混勻后取等量標(biāo)本上樣以SDS-PAGE電泳;轉(zhuǎn)膜2h;脫脂奶粉封閉后COX-2單克隆抗體,孵育過夜;TBST漂洗膜;用HRP標(biāo)記的抗體孵育;ECL發(fā)光底物顯色后在Bio-Rad成像系統(tǒng)曝光。曝光結(jié)果用Image J軟件進(jìn)行光密度檢測。
1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示,組間比較采用成組t檢驗(yàn),相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān),危險(xiǎn)因素分析采用logistic回歸分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 各組炎癥指標(biāo)、MPA和COX-2水平的比較 冠心病組 hs-CRP、MCP-1、WBC和NLR水平均高于對照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01);UA組hs-CRP、MCP-1、WBC和NLR水平以及MPA和COX-2水平均高于SA組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)。見表1、圖1。
2.2 冠心病患者COX-2水平與MPA及各炎癥指標(biāo)水平的相關(guān)性 相關(guān)性分析顯示,COX-2表達(dá)水平與MPA、MCP-1、NLR 和 hs-CRP 均呈正相關(guān)(r=0.703、0.631、0.603、0.532,均P<0.01)。COX-2 水平升高的冠心病患者M(jìn)PA水平顯著高于COX-2水平正常的患者,MPA水平升高冠心病患者COX-2水平顯著高于MPA水平正常的患者(P<0.01);見圖2。
表1 各組炎癥指標(biāo)的比較
圖1 SA和UA組患者M(jìn)PA和COX-2水平比較(與對照組比較,*P<0.01;與 SA 組比較,**P<0.01)
2.3 冠心病患者logistic回歸分析結(jié)果 單因素回歸分析顯示COX-2、MPA、年齡、各炎癥指標(biāo)均為冠心病的危險(xiǎn)因素,多因素回歸分析顯示,除年齡、性別和WBC之外,其余各指標(biāo)均為冠心病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,COX-2比其余指標(biāo)具有更高的OR值;見表2。
圖2 冠心病危險(xiǎn)因素單核細(xì)胞COX-2水平與MPA水平的關(guān)系(與COX-2正常組、MPA正常組比較,**P<0.01)
表2 冠心病危險(xiǎn)因素logistic回歸分析結(jié)果
AS是一種慢性炎癥性病變過程,血小板和WBC參與的炎癥反應(yīng)在動脈硬化性血栓形成性疾病如冠心病的發(fā)生和發(fā)展中扮演重要角色[6]。眾多研究表明,炎癥在AS相關(guān)的心血管疾病發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要的作用[7];并且單核細(xì)胞誘導(dǎo)的慢性炎癥反應(yīng)及巨噬細(xì)胞形成在AS的早起過程中起著重要的作用[8]。慢性炎癥多以WBC增高和各種炎癥介質(zhì)分泌為基本現(xiàn)象,從而可以各炎癥指標(biāo)的水平作為其評價(jià)基礎(chǔ)。單核細(xì)胞活化是一個(gè)復(fù)雜的過程,體現(xiàn)為趨化、黏附功能增強(qiáng),并以炎癥因子如MCP-1分泌等為基本表征[9]。在本研究中,冠心病患者炎癥指標(biāo) MCP-1、hs-CRP、WBC和NLR水平明顯高于正常人群,顯示各炎癥指標(biāo)變化趨勢具有一致性,符合炎癥反應(yīng)的基本表現(xiàn)。以上結(jié)果一方面表明炎癥反應(yīng)與冠心病發(fā)生關(guān)系密切,同時(shí)也表明炎癥反應(yīng)增強(qiáng)可使患者AS風(fēng)險(xiǎn)增加,從而導(dǎo)致冠心病的發(fā)生。另外,UA患者比SA患者具有更高水平炎癥指標(biāo)表達(dá),表明多種因素所誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)可能與AS的進(jìn)展以及冠心病病情嚴(yán)重程度有關(guān)。因此,測定炎癥指標(biāo)水平可能有助于預(yù)測冠心病風(fēng)險(xiǎn)以及評估患者病情。
單核細(xì)胞與血小板黏附形成MPA并誘導(dǎo)兩者相互激活在AS發(fā)生中起著尤為重要的作用[8]。MPA及血小板源性細(xì)胞介質(zhì)協(xié)同誘導(dǎo)單核細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路活化、促使其分泌和表達(dá)多種活性因子、顯著增強(qiáng)其趨化及黏附能力并介導(dǎo)炎癥細(xì)胞黏附,從而放大或延長炎癥反應(yīng),是AS發(fā)生、發(fā)展的上游病理生理基礎(chǔ)[10]。這充分表明MPA及其誘導(dǎo)的單核細(xì)胞活化在AS性疾病的發(fā)生、發(fā)展的早期過程中具有極為重要的作用。MPA形成可顯著增強(qiáng)單核細(xì)胞功能,有利于活化單核細(xì)胞侵入損傷內(nèi)皮細(xì)胞參與炎癥反應(yīng),并轉(zhuǎn)化為巨噬細(xì)胞吞噬氧化型低密度脂蛋白(Ox-LDL),從而形成泡沫細(xì)胞,這是AS發(fā)生的關(guān)鍵[11]。因此,MPA形成和炎癥反應(yīng)與心血管疾病關(guān)系密切。MPA形成過程中PS/PSGL-1連接可激活MAPK,通過MAPK ERK/p38而使單核細(xì)胞COX-2表達(dá)升高,調(diào)控單核細(xì)胞活化和黏附[4]。其中,COX-2可調(diào)節(jié)前列環(huán)素的產(chǎn)生從而對慢性炎癥的發(fā)生具有重要促進(jìn)作用[4]。在筆者的前期研究中顯示,木瓜蛋白酶抑制COX-2蛋白表達(dá)的同時(shí),能降低單核細(xì)胞的黏附及其分泌炎癥蛋白MCP-1[5],表明抑制COX-2可有效抑制炎癥反應(yīng);因此,COX-2可能作為炎癥調(diào)控的靶點(diǎn),其表達(dá)增加可能是MPA形成并激活單核細(xì)胞參與炎癥反應(yīng)從而導(dǎo)致AS發(fā)生的關(guān)鍵物質(zhì),而若能有效抑制其表達(dá)可能有助于AS相關(guān)疾病的防治。盡管筆者在本研究中只檢測和觀察了單核細(xì)胞COX-2蛋白表達(dá)的改變,并未同時(shí)采用PCR法測定COX-2 mRNA表達(dá),但研究結(jié)果顯示,SA和UA患者均表現(xiàn)為MPA形成和單核細(xì)胞COX-2表達(dá)增加,并且UA患者比SA患者M(jìn)PA和COX-2具有更高水平,表明COX-2表達(dá)增加與MPA形成增多具有一致性。而進(jìn)一步研究顯示,冠心病患者單核細(xì)胞COX-2表達(dá)水平與MPA比例呈正相關(guān),并與炎癥指標(biāo)水平具有正相關(guān),進(jìn)一步揭示和證實(shí)以COX-2表達(dá)為代表的炎癥標(biāo)志物水平增加與MPA形成誘導(dǎo)單核細(xì)胞活化引起的炎癥反應(yīng)程度增高具有明顯相關(guān)性。結(jié)果同時(shí)也揭示了COX-2表達(dá)水平高低與冠心病進(jìn)展與否有密切的關(guān)系。因此,COX-2作為重要的炎癥調(diào)控分子,其在MPA誘導(dǎo)的單核細(xì)胞活化后的炎癥調(diào)控中扮演著重要角色,可能有助于冠心病的預(yù)測和病情評估。
炎癥標(biāo)志物水平在冠心病預(yù)測及其風(fēng)險(xiǎn)評估中具有重要價(jià)值[6]。報(bào)道顯示,hs-CRP、WBC和NLR對冠心病預(yù)測有較高價(jià)值,并與病情嚴(yán)重程度有關(guān);并且hs-CRP和NLR可作為急性冠脈綜合征的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[12-14]。因此,炎癥標(biāo)志物在冠心病診斷與預(yù)后中具有重要的意義。本研究在預(yù)測冠心病的各種炎癥指標(biāo)中,炎癥調(diào)控因子COX-2具有最高的OR值,單因素和多因素分析分別為7.812和6.332,表明患者單核細(xì)胞COX-2表達(dá)水平升高可顯著增加冠心病的風(fēng)險(xiǎn),并作為其獨(dú)立危險(xiǎn)因素有助于預(yù)測冠心病發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn);同時(shí)結(jié)果也進(jìn)一步提示并證實(shí)如有效抑制其表達(dá)可能有助于降低冠心病風(fēng)險(xiǎn)。
綜上所述,本研究通過對冠心病患者外周血單核細(xì)胞COX-2表達(dá)水平進(jìn)行評估,初步提示COX-2表達(dá)增高與MPA形成增多具有聯(lián)動關(guān)系,并可作為冠心病風(fēng)險(xiǎn)的獨(dú)立預(yù)測因子。在此基礎(chǔ)上,如能進(jìn)一步結(jié)合COX-2 mRNA檢測進(jìn)行研究,將更有利于臨床實(shí)際應(yīng)用。