宋天增,李 杰，馬金英, 蔣 婧，王高富， 付 琳，周 鵬，馬友記，任航行

(1. 西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，拉薩 850009； 2. 重慶市畜牧科學(xué)院 草食牲畜研究所 重慶榮昌 402460；3.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，蘭州 730070)

骨骼肌的形成是一個(gè)非常復(fù)雜的生物學(xué)過程，包括成肌決定，成肌細(xì)胞增殖，細(xì)胞周期的退出，肌肉特異性基因的表達(dá)，肌細(xì)胞融合形成多核肌管，多核肌管再經(jīng)過一系列發(fā)育變化，最后分化成為具有功能的成熟肌纖維[1-2]。這些復(fù)雜過程的順利進(jìn)行不僅受許多編碼蛋白的因子調(diào)節(jié)，如成肌調(diào)節(jié)因子家族(MRFs)、肌細(xì)胞增強(qiáng)子因子2家族(MEF2)和對(duì)框基因(Pax)家族，而且還受到非編碼RNAs的調(diào)控，如microRNAs(miRNAs)。由基因組中的非蛋白質(zhì)編碼區(qū)或內(nèi)含子所編碼的miRNAs在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)，并在肌細(xì)胞的增殖和分化過程中發(fā)揮重要作用[3-5]。調(diào)控成肌分化的miRNAs可以分為兩類：一類是促進(jìn)分化，包括miR-1[6]、miR-133[7]、miR-206[8]、miR-486[8]、miR-181[9]、miR-148a[10]、miR-214[11]、miR-26a[12]、miR-27b[13]、miR-378[14]和miR-322/424/503[15]等。另一類是抑制分化，包括miR-125b[16]、miR-155[17]、miR-199a-3p[18]、miR-186[19]、miR-221/222[20]和miR-669a/669q[21]等。但這些僅僅是非編碼RNA的冰山之一角，大量未知功能的miRNAs亟需鑒定。筆者前期用高通量測(cè)序(RNA-Seq)法對(duì)Texel羊(MSTN突變型)與烏珠穆沁羊(MSTN野生型)胎兒骨骼肌中的miRNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，分析發(fā)現(xiàn)miR-127-3p與miR-1/206/133均屬骨骼肌高表達(dá)miRNAs，且miR-127-3p在 2 個(gè)品種羊骨骼肌中差異表達(dá)[22]，暗示miR-127-3p可能參與羊骨骼肌的生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控。Yang 等[23]和Li等[24]的研究結(jié)果表明，miR-127-3p參與骨骼肌細(xì)胞的分化調(diào)控，但miR-127-3p調(diào)節(jié)成肌分化的作用機(jī)制還不清楚。本研究以表達(dá)miR-127-3p的慢病毒載體轉(zhuǎn)染分化期的C2C12成肌細(xì)胞，旨在探究miR-127-3p表達(dá)變化對(duì)C2C12細(xì)胞生肌分化的作用，及其在轉(zhuǎn)錄組水平上對(duì)基因表達(dá)的影響效應(yīng)，為進(jìn)一步闡明miRNA的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、馬血清(HS)、青鏈霉素雙抗、25 g/L胰酶、D-PBS均購(gòu)自Gibco；6孔板、培養(yǎng)皿、15 mL離心管購(gòu)自Corning；Lipofectamine 2000：美國(guó)Invitrogen公司；DAPI：瑞士Roche公司; SuperScript First-Strand Synthesis System for RT-qPCR 和SuperScript Ⅲ Platinum SYBR Green One-Step qRT-PCR Kit：美國(guó)Invitrogen公司；TaqMan MicroRNA Reverse Transcription，TaqMan MicroRNA Assays和TaqMan Universal qPCR Master Mix Ⅱ：美國(guó)ABI公司；miR-127-3p 慢病毒表達(dá)載體：美國(guó)ABI公司；Trizol試劑：美國(guó)Invitrogen公司；倒置熒光相差顯微鏡：日本Olympus公司；Countess Ⅱ FL全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(Life Technologies)。C2C12 細(xì)胞購(gòu)買于中國(guó)中科院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.2 C2C12細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染miR-127-3p 慢病毒載體

小鼠 C2C12 細(xì)胞培養(yǎng)在生長(zhǎng)培養(yǎng)基 GM(DMEM+10%FBS+1% 雙抗)，待細(xì)胞匯合度至 80%左右時(shí)，加入配制的分化培養(yǎng)基 DM(DMEM+2%HS+1% 雙抗)，隔天更換新鮮培養(yǎng)基。在 37 ℃，φ=5% CO2的條件下連續(xù)培養(yǎng) 5 d。首先用適量 opti-MEM 溶解 miR-127-3p 慢病毒表達(dá)載體或陰性對(duì)照(miR-NC)，保持其濃度為 100 nmol/L，按照 Lipofectamine 2000 的說明書稀釋脂質(zhì)體。選擇生長(zhǎng)狀態(tài)良好的分化細(xì)胞，顯微鏡下觀察其狀態(tài)并統(tǒng)計(jì)細(xì)胞數(shù)目，確保初始階段處理組與對(duì)照組的細(xì)胞數(shù)一致。轉(zhuǎn)染具體步驟：首先將轉(zhuǎn)染試劑 Lipofectamine 2000 與 Opti-MEM 2 種溶液輕輕吹打至混勻，室溫孵育 5 min 后，將慢病毒表達(dá)載體與對(duì)照載體分別加入脂質(zhì)體混合液，輕輕吹打，使脂質(zhì)體充分接觸載體并將其完全包裹，均勻分布。待室溫靜置 20 min 后，逐滴加入培養(yǎng)皿中，輕微搖晃，使混合物分布均勻。為減少轉(zhuǎn)染試劑的毒性，轉(zhuǎn)染 12 h 后更換新鮮培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染 48 h 后即可進(jìn)行后續(xù)相關(guān)試驗(yàn)。轉(zhuǎn)染過程及試劑用量按照 Lipofectmaine 2000 轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行。

1.3 RNA-Seq測(cè)序及數(shù)據(jù)處理

收集分化第5天處理組(OE)與陰性對(duì)照組(NC)的C2C12細(xì)胞，每個(gè)處理取3份細(xì)胞RNA樣品。TRIzol 法提取細(xì)胞總RNA，10 g/L瓊脂糖電泳和分光光度計(jì)(Implen, Los Angeles, CA, USA)檢測(cè)RNA質(zhì)量，質(zhì)量合格后委托北京諾禾致源科技有限公司在Illumina Hiseq 2000 平臺(tái)進(jìn)行RNA-Seq測(cè)序分析。6 個(gè)樣品構(gòu)建的測(cè)序文庫(kù)所得的原始數(shù)據(jù)經(jīng)過濾(包括去掉接頭序列、含10% 以上未知堿基的Reads，及低質(zhì)量的Reads)，計(jì)算過濾后每個(gè)測(cè)序文庫(kù)的Phred值(Q20，Q30) 和GC含量，得到有效數(shù)據(jù)(Clean reads)用于后續(xù)分析。對(duì)所得的Clean reads在小鼠參考基因組上應(yīng)用TopHat v2.0.9[25-26]和Scripture(Beta2)[27]進(jìn)行比對(duì)和定位，應(yīng)用Cuffdiff(v2.1.1)軟件計(jì)算每個(gè)基因的表達(dá)量(FPKM，F(xiàn)ragments per kb for a million reads)[28]。用DESeq軟件鑒定處理組與對(duì)照組細(xì)胞的差異表達(dá)基因，篩選標(biāo)準(zhǔn)為校正后的P值(padj )< 0.05。

1.4 Real-time qPCR

用Trizol法從C2C12細(xì)胞中提取總RNA，mRNA和miRNA分別用SuperScript First-Strand Synthesis System for RT-qPCR和TaqMan MicroRNA Reverse Transcription試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再分別進(jìn)行qRT-PCR分析。miR-127-3p按探針法miRNA定量試劑盒說明操作，U6為內(nèi)參基因，體系如下:50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品做3次重復(fù)。成肌分化標(biāo)志基因MyoD(F:GGC- TCTCTCTGCTCCTTTGA，R:GTAGGGAAG- TGTGCGTGCTC)、MyoG(F：GCAGGCTCAAGAAAGTGAATG，R:AGGCGCTCAATGTACTGGAT)和Myosin(F:AGGCACCTGCTGAAGAAGAC，R:CCTCGAAGGTCTGTGACTCC)的定量以GAPDH(F:TCAAGAAGGTGGTGAAGCAG，R:AGGTGGAA-GAGTGGGAGTTG)為內(nèi)參基因。mRNA與miRNA的相對(duì)定量表達(dá)均采用2-ΔΔCt法計(jì)算。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法

應(yīng)用SAS 8.0軟件中的t-test方法檢驗(yàn)qPCR分析結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 miRNA表達(dá)載體的轉(zhuǎn)染效率及其對(duì)C2C12細(xì)胞分化的效應(yīng)

研究結(jié)果表明，miRNA載體的轉(zhuǎn)染效率達(dá)到95%(P<0.01) (圖1-A)，說明miR-127-3p 載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞效率較高，可以用于后續(xù)試驗(yàn)；基因表達(dá)與細(xì)胞形態(tài)學(xué)分析表明，過表達(dá)miR-127-3p可顯著提高細(xì)胞成肌分化標(biāo)志基因MyoG和Myosin的表達(dá)(P<0.01)(圖1-B)，促進(jìn)細(xì)胞的成肌分化(圖1-C)。

qRT-PCR法檢測(cè)miR-127-3p(A)與成肌標(biāo)志基因MyoD，MyoG和Myosin(B)的表達(dá)。數(shù)據(jù)表示為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”(n=3),*P<0.05, **P<0.01。在分化第5天分別觀察C2C12細(xì)胞的形態(tài)學(xué)情況，比例尺= 100 μm(C) MiR-127-3p(A), myogenic marker genesMyoD，MyoGandMyosin(B) expression were measured by qRT-PCR.The data are the “mean+SD”(n=3). *P<0.05, **P<0.01 .Morphological features of myotubes at 5th day of differentiating C2C12 cells. Scale bar = 100 μm(C)

圖1miRNA載體轉(zhuǎn)染效率及其對(duì)C2C12細(xì)胞的分化效應(yīng)
Fig.1TheefficiencyandeffectofmiRNAexpressionvectoronmyogenicdifferentiationinC2C12cells

2.2 過表達(dá)miR-127-3p對(duì)C2C12細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的影響

在分化介質(zhì)中，C2C12成肌細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染miR-127-3p 表達(dá)載體和對(duì)照組(NC)慢病毒載體后第 5 天，對(duì)兩組細(xì)胞總RNA在Illumina平臺(tái)進(jìn)行RNA-seq深度測(cè)序。6 個(gè)文庫(kù)(每組 3 份細(xì)胞樣本)的測(cè)序原始數(shù)據(jù)(Raw reads)經(jīng)過濾后共獲得 21 Gb的有效數(shù)據(jù)(Clean reads)，數(shù)據(jù)質(zhì)控檢驗(yàn)合格(平均Q20>96%，Q30>92%)，說明本次測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量較高，可用于后續(xù)差異基因分析。基因表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，11 761 個(gè)基因在過表達(dá)組(OE)與對(duì)照組(NC)細(xì)胞共同表達(dá)，189 個(gè)基因在過表達(dá)組特異表達(dá)，223 個(gè)基因在對(duì)照組特異表達(dá)。

應(yīng)用DEseq軟件共鑒定到 30 個(gè)差異基因，全部為下調(diào)基因(圖2，表1)。Gene Ontology功能聚類分析發(fā)現(xiàn)，免疫反應(yīng)與能量代謝類基因顯著富集(圖3)，暗示此階段過表達(dá) miR-127-3p 可能會(huì)影響成肌分化進(jìn)程。此外，鑒定得到 20 個(gè)顯著富集的經(jīng)典KEGG信號(hào)通路(圖4)，其大部分信號(hào)通路的功能主要與病毒感染與免疫疾病相關(guān)。但信號(hào)通路Viral myocarditis、Cell adhesion molecules(CAMs)值得關(guān)注，這些差異基因同樣是成肌分化過程中的重要功能基因。

圖中紅色點(diǎn)表示有顯著性差異表達(dá)的上調(diào)基因，綠色點(diǎn)表示有顯著性差異表達(dá)的下調(diào)基因, 藍(lán)色為差異基因篩選閾值padj<0.05以下的基因 Red dot indicates the differential gene was expressed increasingly, whereas blue one refers to the down-regulated differential gene in OE group, compared with that in the NC group. The significance of threshold is padj<0.05

圖2不同處理組細(xì)胞的差異基因火山圖
Fig.2VolcanoplotofdifferentialgenesidentifiedbetweenOEandNCgroup

2.3 miR-127-3p靶基因預(yù)測(cè)

為了進(jìn)一步鑒定受miR-127-3p調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子，將差異表達(dá)基因(表1)與TFCat數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行匹配，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，即Irf7和Ddit3。這暗示轉(zhuǎn)錄因子Irf7和Ddit3表達(dá)的變化可引起下游多個(gè)受其調(diào)控的靶基因表達(dá)變化，進(jìn)而導(dǎo)致處理組與對(duì)照組的細(xì)胞表型變化。為了進(jìn)一步確定miRNA與潛在的靶基因之間是否存在直接堿基配對(duì)關(guān)系，對(duì)miR-127-3p與Ddit3基因序列進(jìn)行比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn) miR-127-3p 與Ddit3基因的蛋白編碼區(qū)(CDS)存在堿基互補(bǔ)配對(duì)關(guān)系(圖5)，暗示miR-127-3p可能通過堿基配對(duì)的方式影響Ddit3基因的表達(dá)。同時(shí)，該結(jié)果有助于完善miR-127-3p的成肌分化調(diào)控軸(圖6)，miR-127-3p與Ddit3基因的關(guān)系還需進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。

表1 miR-127-3p過表達(dá)與對(duì)照組細(xì)胞間的差異表達(dá)基因Table 1 Deferentially expressed genes between miR-127-3p overexpression and negative control group

圖3 不同處理組間的差異基因GO富集分析Fig.3 Enrichment analysis of differential genes between OE and NC group

圓圈的顏色表示每個(gè)信號(hào)通路相應(yīng)的顯著性P值，圓圈大小則表示每個(gè)信號(hào)通路上出現(xiàn)的差異基因個(gè)數(shù) Circle color indicates the significance of enriched KEGG pathway, while circle size refers to count of gene in the pathway

圖4不同處理組間的差異基因KEGG信號(hào)通路富集分析
Fig.4KEGGenrichmentofdifferentialgenesbetweenOEandNCgroup

紅色部分為本文研究結(jié)果，黑色部分為Alter等[36]已有研究 The red parts indicate findings in present study, and the black parts refer to the known findings of Alteretal[36]

圖5miR-127-3p成熟序列與轉(zhuǎn)錄因子Ddit3基因編碼區(qū)(CDS)序列比對(duì)
Fig.5AlignmentofmiR-127-3pwiththecodingsequence(CDS)ofDdit3inmouse

圖6 miR-127-3p的成肌分化調(diào)控軸Fig.6 Sketch of miR-127-3p regulating myogenic differentiation

3 討 論

骨骼肌的生長(zhǎng)發(fā)育主要表現(xiàn)為肌細(xì)胞數(shù)量的增加和體積的增大，這兩方面的順利進(jìn)行依賴于成肌細(xì)胞的增殖和分化[29]。MiRNAs在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)，在肌細(xì)胞的增殖和分化過程中發(fā)揮重要作用[30]。miR-1/miR-206/miR-133僅在肌肉組織中特異表達(dá)，而miR-127在動(dòng)物的多個(gè)組織廣泛表達(dá)，且在肌肉、皮膚和脾臟中表達(dá)較高[23-24]。筆者近期研究發(fā)現(xiàn) miR-127-3p 表達(dá)量隨 C2C12 肌細(xì)胞分化逐漸增高[24]，暗示 miR-127-3p 參與骨骼肌細(xì)胞分化的調(diào)控。此外，研究還發(fā)現(xiàn) miR-127 能夠抑制小鼠肝臟癌細(xì)胞的增殖[31]，且其在胎兒肺發(fā)育過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用[32]。以上研究說明，miR-127 在動(dòng)物早期發(fā)育及器官形成方面有重要調(diào)控作用。本研究結(jié)果表明，過表達(dá) miR-127-3p 導(dǎo)致 C2C12 細(xì)胞 30 個(gè)蛋白編碼基因顯著下調(diào)，這些基因主要富集于免疫反應(yīng)和能量代謝相關(guān)的生物學(xué)過程與信號(hào)通路(圖3，圖4)，說明 miR-127-3p 通過改變免疫反應(yīng)和能量代謝相關(guān)的生物學(xué)過程來影響 C2C12 細(xì)胞的成肌分化。Karpati 等[33]和Honda等[34]早期研究表明，包括主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ(MHCⅠ)等在內(nèi)的大量與免疫相關(guān)的基因在成肌分化過程中發(fā)揮重要作用，這些免疫類分子可能參與肌細(xì)胞融合為多核肌管階段的肌細(xì)胞間識(shí)別與互作過程。此外，O’Connor等[35]研究發(fā)現(xiàn)成肌細(xì)胞融合是一個(gè)高耗能(ATP)的生物學(xué)事件，小鼠初級(jí)成肌細(xì)胞培養(yǎng)物中補(bǔ)充磷酸肌醇可增加細(xì)胞能量的供給，進(jìn)而促進(jìn)肌管生成，這種促成肌效應(yīng)是通過肌酸激酶依賴的途徑發(fā)揮作用。以上分析表明，miR-127-3p 可能通過調(diào)節(jié)免疫類與能量代謝類基因的表達(dá)來調(diào)控肌細(xì)胞識(shí)別、融合及能量供給環(huán)節(jié)，進(jìn)而影響肌管生成。

Ddit3(DNA-damage inducible transcript 3)為一個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄因子，參與多個(gè)生物學(xué)過程的調(diào)控。Alter等[36]研究發(fā)現(xiàn)Ddit3可直接抑制MyoD基因轉(zhuǎn)錄進(jìn)而負(fù)調(diào)控成肌細(xì)胞分化。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-127-3p可能直接靶向轉(zhuǎn)錄因子Ddit3基因CDS區(qū)域(圖5)以調(diào)控其表達(dá)，并顯著促進(jìn)C2C12細(xì)胞的成肌分化(圖1)，這與前期對(duì)Ddit3成肌功能的研究結(jié)果一致。此外，侯金星等[37]認(rèn)為chi-miR-4110 對(duì)奶山羊Smad2基因有靶向調(diào)控作用。穆松等[38]確定出miRNA上的功能性SNP位點(diǎn)對(duì)miRNA的靶基因選擇和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定有很大影響，并最終通過miRNA來影響動(dòng)物表型的改變。因此，該結(jié)果有助于完善miR-127-3p的成肌分化調(diào)控軸(圖6)，但miR-127-3p與Ddit3基因的調(diào)控關(guān)系還需要進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。盡管miRNA靶向mRNA的蛋白編碼區(qū)(CDS)為miRNA的非主流調(diào)控方式，近年來也相繼出現(xiàn)不少研究報(bào)道，如 miR-148與DNMT3b[39]、miR-183與betaTrCP1[40]、miR-143與PTN[41]、 miR-375與 CIP2A[42]、miR-20a與PRKG1[43]、miR-128與MSTN[44]、miR-15/107與BRCA1[45]、miR-932與DNLG2[46]、MiR-193a-5p 與AP-2alpha[47]、miR-342-5p/miR-10aCVB3[48-49]、Cgi-miR-92d與CgLITAF3[50]。這些研究充分說明miRNA與其靶基因的CDS區(qū)形成堿基互補(bǔ)配對(duì)，也是 miRNA 發(fā)揮轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的一種重要方式。本研究有助于闡明 miR-127-3p 調(diào)節(jié)肌肉發(fā)育分化的分子機(jī)理，同時(shí)，也為人的肌類疾病的靶向治療提供理論依據(jù)。但還需進(jìn)一步通過熒光素酶報(bào)告載體鑒定 miR-127-3p 的靶基因及其對(duì)細(xì)胞成肌分化的影響效應(yīng)。

4 結(jié) 論

過表達(dá) miR-127-3p 顯著促進(jìn)C2C12細(xì)胞的成肌分化；在轉(zhuǎn)錄組水平上，miR-127-3p可能通過調(diào)控免疫與能量代謝類基因的表達(dá)來調(diào)節(jié)成肌細(xì)胞的分化；miR-127-3p可能直接靶向Ddit3基因CDS區(qū)域以調(diào)控其表達(dá)。