高險亭 盧嶺 張瑩瑩 梁耕田 楊麗萍

S100B蛋白是神經(jīng)組織蛋白中的一種不含糖、脂和磷的酸性鈣結(jié)合蛋白，主要分布在中樞神經(jīng)和周圍神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、施旺細(xì)胞以及某些神經(jīng)元中[1]。研究發(fā)現(xiàn)，S100B蛋白在腦血管疾病、顱腦損傷、中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥、阿爾茨海默癥、精神分裂癥等患者體內(nèi)血清中表達(dá)升高，并與神經(jīng)癥狀的嚴(yán)重程度呈正比[2]。老年性聾的發(fā)病機理還不清楚，聽神經(jīng)退化原因尚未明確，有文獻(xiàn)報導(dǎo)幼、老年小鼠耳蝸內(nèi)S100B蛋白表達(dá)有差異[3]，S100B蛋白表達(dá)是否與螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞老化有關(guān)，值得研究。本實驗擬通過組織學(xué)方法，檢測2月齡和12月齡C57BL/6J小鼠螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(SGC)中S100B蛋白表達(dá)，探討S100B蛋白在老年性聾發(fā)病中的作用。

1 材料與方法

1.1實驗動物及分組 取SPF級C57BL/6J小鼠40只，雌雄各半。2月齡組20只，體重 l0～15 g； 12月齡組20只，體重25～40 g。所有動物正常飲食，排除中耳及內(nèi)耳疾病，行聽性腦干反應(yīng)(ABR)檢測后進行實驗。

1.2ABR閾值檢測 控制室溫20±2 ℃，動物用10%水合氯醛(330 mg/kg)腹腔注射麻醉后，采用Nicolet Compass系統(tǒng)的專用電阻檢測儀，安插針式電極，記錄電極刺入前顱頂正中穿透皮膚至顱骨骨膜，置于冠狀縫中點處，給聲耳及對側(cè)耳后皮下分別刺入?yún)⒖茧姌O和接地電極。TDH-39型耳機給聲，聲源距耳廓1 cm，誘發(fā)電位用信號處理機疊加處理，刺激聲為交替短聲，重復(fù)率10次/秒。帶通濾波為32～3 000 Hz，掃描時間10 ms，疊加512次；以引出可重復(fù)出現(xiàn)ABR波Ⅱ的最小刺激聲強度作為其反應(yīng)閾。

1.3血清標(biāo)本采集和處理 兩組各取10只小鼠內(nèi)眥靜脈取血，每次采血量0.8 ml左右，3 000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，取上清液，多次離心直至澄清，-20 ℃保存。嚴(yán)格按照小鼠血清S100B蛋白酶聯(lián)免疫試劑盒說明書的要求檢測各種濃度的標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線、求得回歸方程。采用ELISA法檢測血清S100B蛋白的吸光度，根據(jù)回歸方程和吸光度求得S100B蛋白濃度。

1.4石蠟切片制作 兩組各取小鼠10只快速引頸脫臼斷頭處死，迅速取出雙側(cè)顳骨，打開聽泡，暴露耳蝸，并在蝸尖鉆孔，于4%多聚甲醛溶液(pH 7.4)4 ℃冰箱內(nèi)固定20 h，PBS(pH 7.4)沖洗，10%EDTA(pH 7.4)X軸縱向切片(厚度4 μm)，烤干后行HE染色，光鏡下觀察螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞并計數(shù)。

1.5免疫組化染色檢測S100B蛋白表達(dá) 每張切片經(jīng)常規(guī)二甲苯脫蠟、梯度酒精至水化后，蒸餾水沖洗，用3%過氧化氫室溫孵育切片10 min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。將適量的枸櫞酸(pH=6.4)抗原修復(fù)液注入燒杯內(nèi)置于水浴鍋中加熱至90 ℃，15 min后室溫冷卻，PBS沖洗3 min。對經(jīng)過上述過程處理后的切片標(biāo)本，分別滴加濃度為1∶200兔抗鼠S100B多克隆抗體(abcom)，37 ℃孵育 2小時，4 ℃過夜；用PBS緩沖液洗2 min×3次，滴加非生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG輔助劑，室溫孵育15 min；PBS緩沖液洗2 min×3次，非生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG，室溫孵育15 min；PBS緩沖液洗2 min×3次；DAB鏡下控制顯色，水洗，復(fù)染，脫水，中性樹膠封片，用PBS緩沖液代替一抗作為標(biāo)本染色的陰性對照。

結(jié)果判斷：陽性染色為胞膜、胞漿及胞核中出現(xiàn)棕黃或者棕黑色顆粒。每張免疫組化切片取2個400倍視野，選取底回中著色的螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞所占的區(qū)域作為陽性表達(dá)面積，采用Image-Pro Plus6.0圖像分析儀測其陽性染色面積和平均光密度值(IOD)，每次結(jié)果計算三次求均值。

表1 兩組小鼠ABR反應(yīng)閾、血清S100B含量、SGC計數(shù)及其蛋白表達(dá)比較

注：*與2月齡小鼠比較，P<0.05

2 結(jié)果

2.1兩組ABR閾值 兩組小鼠ABR閾值見表1，可見12月齡組小鼠ABR閾值明顯高于2月齡小鼠，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，符合老年性聾。

2.2兩組血清S100B含量 兩組小鼠血清S100B含量見表1，可見12月齡小鼠血清中的S100B含量比2月齡高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.3兩組螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞HE染色結(jié)果 200倍鏡下觀察2、12月齡C57/BL6J小鼠耳蝸HE染色整體觀，SGC位于耳蝸內(nèi)，圖1a示2月齡組毛細(xì)胞排列整齊，血管紋清晰，圖1b示12月齡組毛細(xì)胞部分缺失，血管紋萎縮；800倍鏡下見2月齡組小鼠螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞較密集，形態(tài)完整，胞核大(圖1c)；12月齡小鼠SGC分布松散，胞核濃縮變小，呈萎縮性改變(圖1d)。經(jīng)IPP13計數(shù)，12月齡小鼠中SGC數(shù)量較2月齡組明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

圖1 兩組螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞鏡下HE染色圖片 a、b分別示200倍鏡下觀察,2(a)、12(b)月齡組C57/6J小鼠耳蝸HE染色整體觀;c、d分別示800倍鏡下SGC染色,12月齡(d)小鼠SGC較2月齡組(c)明顯減少

2.4兩組S100B蛋白表達(dá)結(jié)果 S100B在小鼠耳蝸的螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞內(nèi)有表達(dá)，主要分布在細(xì)胞膜、細(xì)胞漿和細(xì)胞核中，2月齡組螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中見部分胞膜和胞漿染色(圖2a)，12月齡組胞核中見大量表達(dá)(圖2b)。由表1可見S100B在12月齡小鼠螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中的陽性表達(dá)面積較2月齡組大，平均光密度值也比2月齡小鼠大，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

3 討論

老年性聾是伴隨機體衰老而出現(xiàn)的以高頻聽力下降為主的雙側(cè)對稱性感音神經(jīng)性聾，其發(fā)病機理還不清楚，病理特點多以毛細(xì)胞缺失或螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞退化為主[4]。C57BL/6J小鼠是研究較成熟的一種老化性動物模型[5]，文中結(jié)果顯示，12月齡C57BL/6J小鼠ABR反應(yīng)閾較2月齡小鼠高，且12

圖2 兩組小鼠螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞S100B蛋白免疫組化染色圖片(×400) 2月齡SGC中部分胞膜和胞漿染色(a),12月齡組胞核中見大量表達(dá)(b)

月齡小鼠耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞部分缺失，血管紋萎縮，SGC計數(shù)減少；鏡下觀察，2月齡小鼠SGC胞漿小核大，分布密集，12月SGC胞大核小，核濃縮，某些呈空泡樣改變，是神經(jīng)細(xì)胞衰退的細(xì)胞學(xué)變化，與人類老年性耳蝸形態(tài)學(xué)改變一致。

近年來研究發(fā)現(xiàn)血清或腦脊液中S100B水平與神經(jīng)系統(tǒng)疾病具有相關(guān)性[6]，腦損傷后血液中升高的S100B可作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的監(jiān)測指標(biāo)之一；也有學(xué)者將S100B蛋白描述為腦的“C反應(yīng)蛋白”[7]。S100B蛋白作為鈣結(jié)合蛋白后來被發(fā)現(xiàn)為損傷相關(guān)模式分子(damage associated molecular patterns,DAMP)，DAMP被認(rèn)為是一系列與細(xì)胞死亡和組織損傷有關(guān)的細(xì)胞內(nèi)分子，可以作為內(nèi)源性危險信號來激活炎癥反應(yīng)[8]，生理濃度下它可推動神經(jīng)元發(fā)育和損失修復(fù)，而高濃度的S100B對神經(jīng)系統(tǒng)具有毒性作用[9]。在各種原因致神經(jīng)元損失過程中，反應(yīng)性的星型膠質(zhì)細(xì)胞增殖和活化，導(dǎo)致大量S100B生成，可通過引起鈣超載、升高一氧化氮濃度促使神經(jīng)纖維纏結(jié)等途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[10]。本實驗發(fā)現(xiàn)12月齡小鼠血清中S100B含量高于2月齡小鼠，結(jié)合兩組小鼠SGC形態(tài)學(xué)觀察，推測血清S100B含量低于0.2 μl/g可能為生理需要量，促進螺旋神經(jīng)元發(fā)育和修復(fù)，而相對高濃度0.80 μl/g可能通過某種信號傳導(dǎo)促進鈣超載，激活炎癥反應(yīng)誘導(dǎo)螺旋神經(jīng)細(xì)胞凋亡壞死，具體機制有待進一步研究。

C57BL/6J小鼠隨月齡增加螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞不同程度凋亡或壞死，符合人類衰老的進程，本實驗結(jié)果示12月齡鼠血清中S100B含量偏高，免疫組化示S100B蛋白在兩組小鼠耳蝸SGC均有表達(dá)，但分布部位和密度不同，2月齡組主要表達(dá)于胞膜和胞漿，12月齡組的胞核見大量表達(dá)，且S100B陽性表達(dá)面積較2月齡組大，表明老年鼠耳蝸SGC中S100B表達(dá)增多。細(xì)胞核是細(xì)胞的控制中心，在細(xì)胞的代謝、生長、分化中起著重要作用，推測S100B參與細(xì)胞抑制周期相關(guān)進程；既往研究表明[11]在正常人體內(nèi)晚期糖基化終產(chǎn)物受體(receptor for advanced glycation end-products,RAGE)隨著年齡增加不斷積累，說明RAGE與衰老之間有密切關(guān)系，并在一定度上影響了細(xì)胞凋亡的發(fā)生。已有研究證明隨年齡增大RAGE在SGC中的表達(dá)增多且參與老年性聾的發(fā)病過程[12]；此外，S100B激活神經(jīng)細(xì)胞中的Ras-MEK-ERK1 / 2-NF-κB通路，并導(dǎo)致GTP酶、Rac1/Cdc42和神經(jīng)突生長的激活[13]；S100B作為RAGE的配體之一[14]，是否為兩者的結(jié)合激發(fā)相關(guān)信號分子以促進衰老的進程，值得進一步探討。