，

(天津工業(yè)大學(xué) 環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，天津 300387)

鹽酸阿考替胺由日本Zeria公司和Astellas公司共同研發(fā)[1]，是一種用于治療功能性消化不良(FD)的新型上消化道(GI)運(yùn)動調(diào)節(jié)劑和應(yīng)激調(diào)節(jié)劑[2]，國外臨床應(yīng)用廣泛，對餐后飽脹、腹脹、早飽等癥狀具有改善作用[3]?，F(xiàn)國內(nèi)鹽酸阿考替胺生產(chǎn)企業(yè)較少，主要以原料合成為主。本文作者以2,4,5-三甲氧基苯甲酸為原料，經(jīng)酰氯化后與氨基噻唑烷基酯縮合，選擇性脫甲基化，與二異丙基乙二胺胺解、酸化，得到目標(biāo)產(chǎn)物[4-7]。在合成鹽酸阿考替胺過程中發(fā)現(xiàn)，2-[N-(4,5-二甲氧基-2-羥基苯甲?；?氨基]-4-(烷氧羰基)-1,3-噻唑(Int2)HPLC譜圖中主峰后出現(xiàn)未知色譜峰，對鹽酸阿考替胺成品檢測，未知色譜峰仍可見，測試樣品HPLC面積歸一化顯示，未知雜質(zhì)表觀含量可達(dá)0.1%，有必要進(jìn)行單獨(dú)控制。

本文針對兩種未知雜質(zhì)，分析了其可能來源，定向合成兩種雜質(zhì)單體，通過UV、IR、MS、NMR、元素分析等手段對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征確認(rèn)。為下一步提高阿考替胺純度、控制阿考替胺成品質(zhì)量提供了有力支持。

1 儀器與試藥

嘉鵬ZF-6三用紫外線分析儀；賽默飛Nicolet is50傅立葉紅外光譜儀；沃特世E2695高效液相色譜儀；耐馳QMS403C型質(zhì)譜儀；Bruker 400M型核磁共振儀；Vario EI cube元素分析儀。

甲醇(色譜純，F(xiàn)ISHER)，乙腈(色譜純，Kermel)，鹽酸(分析純，天津風(fēng)船)，磷酸(分析純，阿拉丁)。

2 雜質(zhì)初步分析

圖1 鹽酸阿考替胺樣品雜質(zhì)檢測HPLC圖

Fig.1 HPLC chromatogram of impurity detection of Acotamine hydrochloride sample

目前鹽酸阿考替胺合成路線較多，但相關(guān)雜質(zhì)分析表征卻鮮有報(bào)道。專利[8]介紹了七種雜質(zhì)的HPLC檢測方法，依照專利方法對樣品溶液進(jìn)行測定(圖1)，并比較專利附圖相關(guān)雜質(zhì)相對保留時間(RRT)，未知雜質(zhì)并非報(bào)道雜質(zhì)?？紤]到未知雜質(zhì)色譜峰首次出現(xiàn)在Int2檢測過程，并結(jié)合本文作者合成鹽酸阿考替胺路線，2-[N-(2，4，5-三甲氧基苯甲酰基)氨基]-4-(乙氧基羰基)-1,3-噻唑(Int1)選擇性脫甲基化制備2-[N-(2-羥基-4,5-二甲氧基苯甲?；?氨基]-4-(乙氧基羰基)-1,3-噻唑(Int2)(圖2)反應(yīng)條件：在酸性環(huán)境中進(jìn)行，反應(yīng)溫度超過100℃，回流時間6h，推測未知雜質(zhì)是由Int1及Int2水解造成。對相同樣品進(jìn)行液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)檢測，同時掃描一級質(zhì)譜。樣品溶液譜圖中出現(xiàn)3個主要色譜峰(圖3)，其中保留時間為3.09min色譜峰其準(zhǔn)分子離子[M+H]+的m/z為451，則相對分子質(zhì)量為450，與鹽酸阿考替胺樣品[9]相對分子質(zhì)量一致；保留時間為3.38色譜峰其準(zhǔn)分子離子[M+H]+的m/z為325，則相對分子質(zhì)量為324，與Int2水解產(chǎn)物相對分子質(zhì)量一致；保留時間為3.45色譜峰其準(zhǔn)分子離子[M+H]+的m/z為339，則相對分子質(zhì)量為338，與Int1水解產(chǎn)物相對分子質(zhì)量一致。由此推測雜質(zhì)產(chǎn)生路線如圖4～5，并暫將Int1水解雜質(zhì)命名為IMPA，Int1水解雜質(zhì)命名為IMPB。LC-MS測試樣品一級質(zhì)譜圖詳見圖6。

圖2 Int1選擇性脫甲基化制備Int2

Fig.2 The process of Int1 selective demethylation to prepare Int2

圖3 鹽酸阿考替胺LC-MS圖

圖4 IMPA產(chǎn)生過程

圖5 IMPB產(chǎn)生過程

圖6 鹽酸阿考替胺不同保留時間質(zhì)譜圖

3 未知雜質(zhì)定向合成

3.1 IMPA的合成

向帶有攪拌裝置的三口瓶中加入20g Int1，80 mL甲醇溶液，油浴攪拌，同時滴加80 mL氫氧化鈉溶液(1 moL/L)，滴畢，測試溶液pH值，待Int1全部溶解，攪拌30min，滴加80 mL鹽酸溶液(1 mol/L)，繼續(xù)攪拌1h，靜置，待晶體析出減壓抽濾，收集晶體50℃鼓風(fēng)干燥10 h即得IMPA。

3.2 IMPB的合成

將Int2 20g置于三口瓶中，甲醇溶液30mL，油浴攪拌，同時滴加30mL氫氧化鈉溶液(1moL/L)，滴畢，測試溶液pH值，攪拌30min，滴加1mol/L鹽酸溶液60mL，繼續(xù)攪拌30min，靜置，待晶體析出減壓抽濾，收集晶體，50℃鼓風(fēng)干燥10h即得IMPB。

4 未知雜質(zhì)結(jié)構(gòu)確認(rèn)

4.1 UV分析

將IMPA、IMPB配成20 μg/mL溶液，在200～400 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行紫外分光光度掃描。IMPA及IMPB分別在322 nm、325 nm有較強(qiáng)吸收，為碳氧雙鍵特征峰，在278 nm、279 nm處吸收峰可知分子中存在芳環(huán)類結(jié)構(gòu)，224 nm、222 nm處吸收峰為碳氮雙鍵特征峰。

4.2 IR分析(Kbr)

IMPA紅外光譜(圖7)數(shù)據(jù)分析：3024、2942、1606 cm-1為甲基吸收峰，2713cm-1為甲氧基的C-H的伸縮振動峰；3308、1661、1551、573、517 cm-1為仲酰胺的伸縮振動和彎曲振動峰；3133、1497、1194、801、728 cm-1為苯環(huán)以及取代苯環(huán)的伸縮振動峰。IMPB紅外光譜(圖8)數(shù)據(jù)分析：2945、1432、2624cm-1為甲基吸收峰，2840cm-1為甲氧基的C-H的伸縮振動峰；3220、1683、1625、609、523cm-1為仲酰胺的伸縮振動和彎曲振動峰；3040、1511、1189、899、735 cm-1為苯環(huán)以及取代苯環(huán)的伸縮振動峰。

圖7 IMPA紅外光譜圖

圖8 IMPB紅外光譜圖

4.3 元素分析

稱取供試樣品約2 mg，平行測定兩次。IMPA測試數(shù)據(jù)見表1，IMPB測試數(shù)據(jù)見表2。

表1 IMPA元素分析測試結(jié)果與理論計(jì)算值比較

供試樣品C、H、N、S實(shí)測值與理論計(jì)算值誤差均小于0.3%，可知IMPA碳、氫、氮、硫元素與理論計(jì)算值一致。

表2 IMPB元素分析測試結(jié)果與理論計(jì)算值比較

供試樣品C、H、N、S實(shí)測值與計(jì)算值誤差均小于0.3%，可知IMPB碳、氫、氮、硫元素與理論計(jì)算值一致。

4.4 MS分析

將已純化的Int1、Int2、IMPA和IMPB進(jìn)行質(zhì)譜分析(圖9)，結(jié)果顯示相應(yīng)[M+H]+的m/z為367、339、353、325，則相對分子質(zhì)量依次為366、338、352、324。表明IMPA及IMPB相對分子質(zhì)量與推測路線相對分子質(zhì)量均一致，Int1與IMPA相對分子質(zhì)量差值及 Int2與IMPB相對分子質(zhì)量差值均與推測路線差值一致。

圖9 雜質(zhì)和中間體質(zhì)譜圖

4.5 NMR分析

4.5.1 測試條件

取高純度IMPA、IMPB適量，在DMSO-d6中溶解制成濃度約為40mg/mL溶液，以TMS為內(nèi)標(biāo)測試氫譜、碳譜。

4.5.2 IMP A核磁共振氫譜(1HNMR)

1HNMR圖譜(圖10)出現(xiàn)8組峰(溶劑峰除外)，共14個質(zhì)子，其積分比為3∶3∶3∶1∶1∶1∶1∶1，與推測分子質(zhì)子一致。由譜圖化學(xué)位移值可知：δ3.77ppm,3.89ppm和4.02ppm，單峰，苯環(huán)相連三個甲氧基質(zhì)子(H1，H8，H15)；δ6.84ppm，單峰，為苯環(huán)上靠近甲氧基連接碳相鄰質(zhì)子(H1)；δ7.43ppm，單峰，為苯環(huán)上羰基連接碳鄰位質(zhì)子(H4)；δ8.02ppm，單峰，噻唑環(huán)質(zhì)子(H11)；δ12.88ppm，單峰，羧基質(zhì)子(H14)；δ11.52ppm，單峰，酰胺質(zhì)子(H16)；上述數(shù)據(jù)表明：供試品結(jié)構(gòu)中存在一個次甲基、三個甲氧基、芳香環(huán)、一個酰胺氫和一個羥基氫。

圖10 IMPA氫譜

Fig.10 The1HNMR spectrum of IMPA

4.5.3 IMP B核磁共振氫譜(1HNMR)

1HNMR圖譜出現(xiàn)8組峰(溶劑峰除外)，共12個質(zhì)子，其積分比為3∶3∶1∶1∶1∶1∶1∶1，與推測分子質(zhì)子一致，質(zhì)譜圖見圖11。由譜圖化學(xué)位移值可知：δ3.78ppm和3.85ppm，單峰，苯環(huán)相連甲氧基質(zhì)子(H7，H8)；δ6.61ppm，單峰，為苯環(huán)靠近酚羥基連接碳鄰位質(zhì)子(H4)；δ7.62ppm，單峰，為苯環(huán)靠近酰胺連接碳鄰位質(zhì)子(H1)；δ8.04ppm，單峰，噻唑環(huán)上質(zhì)子(H11)；δ11.42ppm，單峰，羧基質(zhì)子(H14)；δ12.34ppm，單峰，酰胺質(zhì)子(H16)； δ13.34ppm為羥基質(zhì)子(H15)。上述數(shù)據(jù)表明：供試品結(jié)構(gòu)中存在一個次甲基、兩個甲氧基、芳香環(huán)、一個酰胺氫，一個羥基氫、一個酚羥基氫。

圖11 IMPB氫譜

4.5.4 IMPA核磁共振個碳譜(1CNMR)

樣品圖譜(圖12)中有14個峰，對應(yīng)本品分子中14個碳，分子無對稱結(jié)構(gòu)。由位移值數(shù)據(jù)綜合分析可知：δ56.54ppm，55.70ppm，57.65ppm，苯環(huán)相連甲氧基碳信號(C7，C8，C15)；δ98.28ppm，苯環(huán)甲氧基相連碳的鄰位碳信號(C1)；δ110.73 ppm，苯環(huán)上羰基相連碳信號(C4)；δ113.65 ppm，苯環(huán)羰基相連碳鄰位碳信號(C5)；δ123.47ppm，噻唑環(huán)上S鄰位碳信號(C11)；δ142.74ppm噻唑環(huán)上N鄰位碳信號(C6)；δ143.52ppm，苯環(huán)羰基相連碳間位碳信號(C12)；δ154.05ppm，苯環(huán)羰基相連碳及甲氧基相連碳共同鄰位碳信號(C3)；δ154.44ppm，苯環(huán)羰基相連碳對位碳信號(C2)；δ158.21ppm，噻唑環(huán)相連羰基碳信號(C10)；δ163.03ppm，噻唑環(huán)碳信號(C9)；δ163.73ppm，苯環(huán)相連羰基碳信號(C13)。上述數(shù)據(jù)表明，碳譜中共出現(xiàn)14個碳信號，分別代表3個伯碳、3個叔碳和8個季碳。據(jù)此推測，其結(jié)構(gòu)中含有14個碳原子。樣品數(shù)據(jù)與推測分子一致。

圖12 IMPA碳譜

4.5.5 IMPB核磁共振個碳譜(1CNMR)

樣品圖譜(圖13)中有14個峰，對應(yīng)本品分子中14個碳，峰值與碳原子一一對應(yīng)表明，分子無對稱結(jié)構(gòu)。由位移值數(shù)據(jù)綜合分析可知：δ56.37ppm，56.55ppm，苯環(huán)相連甲氧基碳信號(C7，C8)；δ101.28ppm，苯環(huán)上羥基相連碳的鄰位碳信號(C1)；δ105.96ppm，苯環(huán)上羰基相連碳信號(C4)；δ111.15ppm，苯環(huán)上羰基相連碳鄰位碳信號(C5)；δ123.57ppm，噻唑環(huán)S鄰位碳信號(C11)；δ142.54ppm，噻唑環(huán)N鄰位碳信號(C12)；δ143.91ppm，苯環(huán)上羰基相連碳間位碳信號(C3)；δ155.32ppm，苯環(huán)上羥基相連碳信號(C6)；δ155.88ppm，苯環(huán)上羰基相連碳對位碳信號(C2)；δ158.51ppm，噻唑環(huán)相連羰基碳信號(C10)；δ162.97ppm，噻唑環(huán)碳信號(C9)；δ166.47ppm，苯環(huán)相連的羰基碳信號(C13)。上述數(shù)據(jù)表明，碳譜中共出現(xiàn)13個碳信號，分別代表2個伯碳、3個叔碳和8個季碳。據(jù)此推測，其結(jié)構(gòu)中含有13個碳原子。樣品數(shù)據(jù)與推測分子一致。

圖13 IMPB碳譜

Fig.13 The1CNMR spectrum of IMPB

4.6 結(jié)構(gòu)確認(rèn)小結(jié)

由元素分析可知，IMPA及IMPB樣品C、H、N、S測試值與理論值相符，質(zhì)譜分析離子峰[M+H]+的m/z為353、325，推測IMPA樣品分子式為C14H14N2O6S，IMPB樣品分子式為C13H12N2O6S。結(jié)合UV、IR、NMR分析結(jié)果確定IMPA為2-[N-(2,4,5-三甲氧基苯甲?；?氨基]-4-羧基-1，3-噻唑(IMPA)(圖14)；IMPB樣品分子為2-[N-(4,5-二甲氧基-2-羥基苯甲?；?氨基]-4-羧基-1，3-噻唑(IMPB)(圖14)。其色譜保留行為與圖1一致(圖15)。

圖14 IMPA及IMPB結(jié)構(gòu)式

Fig.14 The chemical structures of the IMPA and IMPB

圖15 鹽酸阿考替胺雜質(zhì)系統(tǒng)適應(yīng)性HPLC色譜圖

5 討論

鹽酸阿考替胺合成過程中會產(chǎn)生多種雜質(zhì)，包括本文合成IMPA及IMPB。目前鹽酸阿考替胺雜質(zhì)研究報(bào)道較少，本文合成雜質(zhì)為阿考替胺合成關(guān)鍵步驟Int1選擇性脫甲基化制備Int2過程中產(chǎn)生，表征確認(rèn)其結(jié)構(gòu)有利于控制中間產(chǎn)品純度，亦有助于鹽酸阿考替胺成品質(zhì)量控制，對合成工藝、產(chǎn)品質(zhì)量提高將有所幫助。