李鴻鵬，李鐵軍

(1.清華大學醫(yī)學院，北京 100084； 2.大連醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院皮膚科，遼寧 大連 116011)

近年來，冷凍治療已經(jīng)用于各種皮膚病變的治療，成為無法通過手術切除實體腫瘤治療的重要手段。冷凍治療作為一種新型局部治療方法，具有消融能力大、消融部位精確等超越射頻消融術、熱療等其他治療方法的優(yōu)點，可直接通過細胞壞死和凋亡、改變局部微循環(huán)和調節(jié)免疫等摧毀病變細胞，進而清除皮膚病變和惡性腫瘤。冷凍治療不良反應少，組織修復治療效果較好[1]。隨著冷凍治療設備的發(fā)展、冷凍消融技術的完善以及臨床經(jīng)驗的不斷積累，冷凍治療在皮膚病和腫瘤治療中占據(jù)越來越重要的地位。冷凍治療的適用領域不斷擴展，現(xiàn)通過闡述冷凍治療設備的發(fā)展與制冷劑使用的現(xiàn)狀，對目前廣泛使用的氬氦刀和新上市的康博刀冷凍治療原理和特點進行對比，對國內外冷凍治療的研究予以綜述，以期促進冷凍技術治療效果的提高和治療領域的擴大。

1 冷凍治療設備與制冷劑

1.1冷凍治療設備的發(fā)展 目前，臨床主要使用由一個儲冷罐和一個噴嘴組成的手持液氮噴霧設備，實施皮膚疾病的噴霧冷凍手術。隨著冷凍手術的廣泛應用，現(xiàn)已開發(fā)自動化多探針冷凍設備。1998年美國Endocare公司成功研制出腫瘤治療設備-美國氬氦刀。在CT或B超引導下將氬氦刀頭經(jīng)皮準確穿入腫瘤組織中心，可籍氬氣在刀尖急速絕熱制冷使腫瘤組織降至-100 ℃；隨即可籍氦氣在刀尖急速制熱使冰球解凍并急速升溫至50 ℃[2]。劉靜教授團隊聯(lián)合海杰亞(北京)醫(yī)療器械有限公司自主研發(fā)出大型腫瘤治療設備——康博刀。康博刀治療系統(tǒng)最低溫度可達-196 ℃，最高溫度可達80 ℃以上[3]?？挡┑杜c氬氦刀都是通過高強度冷熱快速切換的方法，達到殺死癌細胞的目的，但康博刀的整體工作性能顯著優(yōu)于氬氦刀，且探針與液氮的成本均較低[4]。目前，各種不同類型的冷凍治療設備均可用于臨床治療。

1.2制冷劑 雖然液態(tài)二氧化碳、一氧化二氮、氟利昂或氬作為制冷劑亦可用于臨床治療，但液氮仍是最常用的現(xiàn)代制冷劑。液態(tài)氬是在300個大氣壓下用焦耳-湯姆遜(Joule-Thomson，J-T)效應冷卻探針尖端，即在探頭的熱交換室中通過1個限制孔的壓力來傳遞氣體。在J-T型裝置中，液態(tài)氬比液態(tài)氮的冷卻速度快，但溫度只有-130～-135 ℃，且冷凍后氣體回流會迅速加熱探針。在治療腫瘤的過程中，由于液態(tài)氬的冷凍能力較低，相較于液態(tài)氮的冷凍直徑，液態(tài)氬需要2倍的探針才能達到相同冷凍效果。但加壓氬氣冷卻的J-T型裝置不需要液氮真空絕緣材料儲存罐。氬氦刀屬于J-T型裝置，在300～500個大氣壓下工作的氬氣為稀有性超高壓氣體，獲取受限，手術實施中存在安全隱患；而康博刀為相變制冷型裝置，使用運行壓力2～5個大氣壓的液氮，易于獲取，安全性和可操作性好[5]。J-T型設備中常用的另外兩種冷凍劑是液態(tài)二氧化碳和液態(tài)一氧化二氮，雖然已臨床使用多年，但缺乏足夠用于治療侵襲性癌癥或多探頭設備的冷凍能力。

2 冷凍治療技術

2.1冷凍治療方法 冷凍治療方法主要有棉簽涂抹、定點噴霧和探針介入3種，前兩種方法主要用于治療各種皮膚病，探針介入主要治療各種腫瘤。由于病毒可能在液氮中生存而污染制冷劑，故棉簽涂抹需要為每例患者單獨分配制冷劑，避免交叉?zhèn)魅綶6]。此外，棉簽涂抹的最大冷凍深度為2～3 mm，故不能用于深層病變的治療。定點噴霧是使用手持液氮噴霧單元實施的噴霧治療，主要有直接模式(直接噴灑病變中心)、螺旋模式(從病變的中心螺旋向外)和“畫筆”模式(將噴嘴從一側像漆墻一樣移至其他損傷部位)3種方式。手持絕熱塑料錐是對定點噴霧治療方法的改進，將適當大小的圓錐直接放置于病變區(qū)域，使制冷劑的噴霧區(qū)域限制于尖端暴露的部位，較單獨使用噴霧劑的凍結深度加深，制冷劑直接作用于目標組織，可使冷卻速度較慢的制冷劑獲得深度冷凍和大面積冷凍的治療效果[7]。圓錐尖端的大小形狀各異，可在目標組織形成多種凍塊。探針介入是采用探針進行冷凍手術的治療方法，在腫瘤的深層組織中插入一根或多根探針，冷凍劑通過該針在壓力和湍流作用下回收，導致被治療的腫瘤深層組織內形成冰球，經(jīng)過2次凍融循環(huán)，可消融85%的實體腫瘤，更深層或直徑更大的腫瘤則需進行多次冷凍?？挡┑杜c氬氦刀均為探針介入治療。

2.2冷卻速率 冷凍治療中，快速冷凍(>50 ℃/min的降溫速度)只發(fā)生在冷凍探針附近，距探針越遠冷卻速率越低。距噴霧中心約1 cm處，冷卻速率只有10～20 ℃/min，且與噴頭溫度有關。冷凍治療腫瘤直徑>2 cm時，大多數(shù)組織不會被快速冷卻，但低冷卻速率似乎并不改變治療結果[8]。Farrant和Walter[9]認為，決定細胞生存的主要因素是細胞在不同時間接觸到不同的熱量變化，而并不是冷卻速率。不同病變組織的冷凍時間亦有較大差別。

2.3溫度控制 細胞內水體積很小，電解質多樣性導致凝固點不同，甚至凝固點可低至-54.9 ℃(氯化鈣溶液的最低凝固點)。在腫瘤治療或其他情況下，必須通過低溫保證組織破壞，考慮臨床應用的誤差范圍，-50 ℃對所有腫瘤組織最安全。若使組織處于低于-50 ℃，冷凍持續(xù)時間無要求，而冰凍狀態(tài)(如高于-40 ℃)將會增加組織破壞。組織溫度高于-40 ℃時，解凍時間越長，溶質效應和冰晶體生長越明顯，對細胞的損傷越強[8]。

2.4凍融循環(huán) 反復凍融對腫瘤組織的破壞性更強，但對冷凍融化循環(huán)的具體間隔時間目前還未確定。Whittaker[10]在倉鼠口腔黏膜的周期性重復冷凍實驗中發(fā)現(xiàn)，細胞內冰晶在每次凍融循環(huán)的間隔時間中均會增加，從而提出較長間隔時間可增加冷凍效果，較長解凍時間會使細胞內冰晶再晶體化而誘導細胞膜的滲透破壞。同時，持續(xù)的解凍將使組織處于低溫狀態(tài)，可為微循環(huán)的停滯提供足夠的時間。當這一冷凍區(qū)域的熱量發(fā)生損耗，第2個凍融周期將會更加有效。但臨床實踐中，由于工作量較大，很難等待冰晶完全融解的長時間間隔。總之，最理想的破壞病變組織技術是快速冷凍組織，使其達到適當?shù)牡蜏兀ㄟ^緩慢解凍延長持續(xù)時間，并重復凍融循環(huán)。

3 冷凍治療的簡單機制

3.1表觀現(xiàn)象 對皮膚病變實施冷凍噴霧時，在20～30 s的冷凍期后立即發(fā)生表觀變化，顯示白色冰場。在融化的幾分鐘內，冰場邊緣的皮膚出現(xiàn)紫紅色并集中運動，在皮膚表皮層和深層都與周圍健康皮膚有明顯界限，隨后深層組織變得更蒼白，表面形成的出血性水泡逐漸形成瘡痂，持續(xù)時間2～6周[11]。本質上，低溫冷凍和低溫噴霧治療后的變化沒有區(qū)別，冷凍時立即能夠看到冰晶，但當細胞質出現(xiàn)越來越多的嗜酸粒細胞時，第1次的細胞變化被延遲至大約30 min后；冷凍后1 h內，可能沒有明顯的細胞死亡，但隨后幾小時內可出現(xiàn)細胞核固縮、細胞質均質化[12]。

3.2細胞壞死與凋亡 細胞壞死或基因調控的細胞死亡(凋亡)是冷凍直接導致細胞損傷的一種機制。Forest等[13]將一種人類肺腺癌細胞注射到小鼠背區(qū)的冷凍活體實驗研究顯示，冷凍區(qū)域中心部分壞死，周圍區(qū)域有凋亡細胞，冷凍后2～8 h內，細胞凋亡逐漸增加，且細胞凋亡發(fā)生在壞死區(qū)域以外的區(qū)域，但兩者之間的邊界尚不清楚，并在4 d后觀察到第2次壞死。體內實驗說明了冷凍手術后細胞凋亡的時間，同時也闡明了體外和體內研究的直接聯(lián)系。細胞凋亡或繼發(fā)性壞死是由冷凍過程中腫瘤細胞內外微環(huán)境的變化導致的，如pH值改變、ATP 酶異常、線粒體損傷、電解質紊亂、細胞器及細胞核破裂等[14]。

3.3直接細胞損傷 冷凍部位鏡下顯示內質網(wǎng)脫粒。在組織學上，真皮表皮交界處出現(xiàn)水泡，表皮和相關黑色素細胞發(fā)生最大程度的死亡。胞外冰晶導致的細胞膜破壞，對固體腫瘤中緊密排列的細胞具有破壞作用。冷凍過程中，許多細胞內形成冰晶，破壞線粒體和內質網(wǎng)。細胞外冰的變化和細胞外水的減少與溶質濃度的增加有關。滲透壓的改變會導致細胞溶解、細胞體積減少和細胞膜破裂，其中一些破壞是不可逆轉的，且在融化過程中會加劇。盡管許多細胞剛解凍后看起來很正常，但很多細胞已經(jīng)死亡。大的冰晶比小的冰晶更具破壞性[12]。緩慢融化與冰的再晶化有關，比快速融化更具有破壞性。由于液態(tài)氮相對于其他制冷劑解凍緩慢，而緩慢解凍正是增加組織破壞的重要因素，故液態(tài)氮冷凍手術在臨床實踐中最有效。

3.4微循環(huán)停滯與再生 溫和的冷卻會使微血管的流動減少，在冬天皮膚變白時很容易觀察到，但這種效應在小動脈較小。液氮冷凍后血管收縮，但在深度冷凍后血管開始擴張，毛細血管和靜脈形成微血栓并逐漸固定在內皮細胞上，故最終根本不流動，且可在-15 ℃以下觀察到這種效果，由于血小板聚集、血流瘀滯形成微血栓，導致細胞缺血壞死，細胞缺血壞死的程度將取決于凍結深度和橫向擴散寬度[15]。臨床實踐中，靜脈和毛細血管可發(fā)生堵塞，但大動脈和小動脈很少發(fā)生。

組織被凍結，但基質可能沒有較大的變化，這種體系結構的保存對于修復非常重要。傷口愈合是活躍的過程，開始由于趨化因子引起的病變邊界處的炎癥反應，在促炎素、組胺和細胞因子等炎性介質的刺激下，早期發(fā)生中性粒細胞浸潤，隨后是單核細胞，且這種細胞浸潤緊隨著由冷凍組織的解凍導致的低溫和水腫而發(fā)生。有學者認為，炎性細胞浸潤有助于細胞凋亡和組織破壞的發(fā)展[16]。當肉芽組織逐漸形成，成纖維細胞分化成肌成纖維細胞，受損的膠原蛋白被新的膠原蛋白所取代。細胞浸潤有助于建立新的微循環(huán)系統(tǒng)，對組織的修復過程至關重要[17]。延遲愈合是低溫傷口的特征之一，無論是結痂還是吸收，清除壞死組織需要一定的時間。冷凍傷口愈合較切除傷口速度慢，但微循環(huán)系統(tǒng)得到了改善。

4 冷凍治療疾病的現(xiàn)狀

4.1皮膚病的冷凍治療 對皮膚病進行冷凍治療已經(jīng)比較普遍，且治愈率較高，復發(fā)率在10%左右，見表1[18]。在小的基底和鱗狀細胞癌(直徑2 cm)治療中，Kuflik[19]總結了30年4 406種皮膚癌的臨床經(jīng)驗發(fā)現(xiàn)，冷凍治療的治愈率達98%。Nordin和Stenquist[20]對5年期間100例外耳冷凍手術治療結果的研究發(fā)現(xiàn)，只有1例復發(fā)，并認為外科手術切除后再對病灶進行冷凍治療是一種安全的治療方法。

4.2惡性腫瘤的冷凍治療 大多數(shù)腫瘤最好通過手術切除治療，便于進行外科檢查和評估，保守的手術治療是進行微創(chuàng)和消融治療(如冷凍手術)。冷凍手術是一種安全有效的治療多種腫瘤的方法，主要應用于全身各種實體腫瘤，包括肝癌、肺癌、前列腺癌、結直腸癌、膠質瘤、腎癌、骨骼的良惡性腫瘤、黑色素瘤、乳腺癌、胰腺癌、軟組織腫瘤、腎上腺癌、

表1 冷凍時間和良性、癌變前皮膚病的治療結果

腦膜瘤、子宮肌瘤等以及癌癥止痛等，現(xiàn)最常用于肝癌和肺癌[21-36]。癌變皮膚主要采用手持液氮噴霧設備治療，冷凍治療時間和治療結果見表2[37]。體內腫瘤冷凍治療主要是采用氬氦刀和康博刀。我國自1999年引進氬氦刀以來，已有2萬多例腫瘤患者接受氬氦刀冷凍消融治療，有效率達90%以上[38]。冷凍手術的有效率較高，但并不是最優(yōu)的。有研究表明，氬氦刀聯(lián)合應用化療藥物或多種免疫療法可明顯提高患者的生存率[39-40]。劉冰和張元昊[41]的研究表明，氬氦刀聯(lián)合自體細胞免疫療法治療腸癌肝轉移較單純冷凍治療和單純自體細胞免疫療法治療，肝轉移灶縮小更明顯。Liang等[42]研究表明，在治療復發(fā)性乳腺癌時，冷凍消融術、自然殺傷細胞療法和赫賽汀組合治療法聯(lián)用，較單獨冷凍消融術法或冷凍消融術與自然殺傷細胞組合療法，可更好地降低循環(huán)腫瘤細胞水平，減少癌胚抗原和糖類抗原15-3，顯著增強免疫功能。我國首創(chuàng)的康博刀已成功完成臨床試驗，可廣泛用于臨床實體腫瘤的冷凍治療，2018年7月13日在北京大學腫瘤醫(yī)院進行了首例臨床應用，目前還未與其他療法、藥物組合[43]。

5 小 結

冷凍治療適用范圍廣泛，具有很高的臨床應用價值。目前，對冷凍治療的冷卻速率、冷凍治療機制和適應證治療效果的研究已經(jīng)比較充分，尤其是氬氦刀冷凍治療，而對于應用時間較短的康博刀的臨床研究尚不充分。康博刀價格低、運營成本低、整體>AIDS：獲得性免疫缺陷綜合征工作性能優(yōu)于氬氦刀，更適合于我國臨床推廣應用。確定氬氦刀或康博刀聯(lián)合多種免疫療法的治療方案、聯(lián)合應用藥物類型和交付方式以及冷凍時間、復溫時間和凍融循環(huán)間的時間間隔，對提高臨床冷凍治療效果至關重要，但仍有待進一步深入研究。此外，冷凍治療手術后，細胞破壞釋放組織抗原導致的免疫耐受也亟待解決。冷凍免疫應答的深入研究，主要是細胞因子釋放和T細胞分化對基因層面表達的變化和相關信號通路的研究，對冷凍治療本質的認識具有重要意義。

表2 冷凍時間和癌變皮膚的冷凍治療結果