朱恩宇, 鄭斯卓, 高 凱※, 石 剛，張 睿

(1.遼寧省中醫(yī)藥研究院 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院外科,沈陽 110034； 2.遼寧省監(jiān)獄管理局總醫(yī)院內(nèi)科,沈陽 110045； 3.中國醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院 遼寧省腫瘤醫(yī)院結(jié)直腸外科，沈陽 110042)

近年來，結(jié)腸癌發(fā)病率呈上升趨勢并趨于年輕化，但在消化系統(tǒng)惡性腫瘤中，隨著治療觀念的改變及靶向治療的發(fā)展，晚期結(jié)腸癌的治愈率及生存率均獲得明顯提高[1]。對結(jié)腸癌分子生物學(xué)機制研究的目的在于對結(jié)腸癌進行早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷、預(yù)后分析及探索治療靶點。L1細胞黏附因子(L1 cell adhesion molecule,L1CAM)在子宮內(nèi)膜癌、食管癌、結(jié)腸癌、胰腺癌等惡性腫瘤中高表達，對腫瘤的轉(zhuǎn)移、浸潤及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等具有調(diào)控作用[2-4]。微RNA(microRNA,miRNA)是一類長18～22 nt單鏈非編碼RNA，可特異性識別并與靶信使RNA(messenger RNA，mRNA)的3′非翻譯區(qū)(untranslated region,UTR)結(jié)合，調(diào)控靶mRNA降解，阻礙翻譯過程，調(diào)控惡性腫瘤的生物學(xué)功能[5]。本研究對miR-346及L1CAM在結(jié)腸癌組織中的表達進行檢測，評價其與臨床病理特征的關(guān)系及兩者的相關(guān)性，目的在于探討其在結(jié)腸癌中的生物學(xué)行為及對結(jié)腸癌預(yù)后的評估作用。

1 材料與方法

1.1實驗材料 選取2016年5月至2017年5月于中國醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院病理標(biāo)本庫保存的手術(shù)切除結(jié)腸癌手術(shù)標(biāo)本68例，包括結(jié)腸癌組、癌旁組織及正常結(jié)腸組織。BCA蛋白定量試劑盒購自上海碧云天科技有限公司，L1CAM多克隆抗體購自美國Sigma公司。實時定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自立陶宛Fermentas公司，miRNA提取分離試劑盒、All-in-OneTMqPCR Mix試劑盒購自美國Abcom公司。引物由大連寶生生物技術(shù)有限公司設(shè)計及合成。

1.2免疫組織化學(xué) 組織標(biāo)本置于10%甲醛中固定24 h，脫水后石蠟包埋，4 μm切片，烘干、脫水、脫蠟、抗原修復(fù)。在3% H2O2每片50 mL及37 ℃烤箱25 min，采用磷酸緩沖鹽溶液洗3次，每次5 min。加入1∶500一抗后濕盒4 ℃孵育過夜。在室溫條件下復(fù)溫20 min，磷酸緩沖鹽溶液洗3次，每次5 min，加二抗37 ℃孵育30 min后二氨基聯(lián)苯胺顯色，蘇木素復(fù)染5～10 min。自來水洗凈后鹽酸酒精分化10～20 s，流水沖洗30 min。脫水后透明。二甲苯干燥、中性樹膠封片。

1.3實時定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng) 取結(jié)腸癌組織標(biāo)本，按RNA分離試劑盒以及Trizol試劑盒操作說明書提取及純化總RNA，將RNA樣本稀釋至濃度為1 g/L，采用紫外吸收法檢測RNA濃度及純度。應(yīng)用變性瓊脂糖凝膠電泳法測定RNA完整性。合成樣品互補DNA，進行梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品的管家基因(β-actin)實時定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)檢測，繪制梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線DNA模板，實時定量聚合酶鏈反應(yīng)進行待測基因的檢測，反應(yīng)體系如下：SYBR Green 1染料10 μL,上游引物1 μL,下游引物1 μL,脫氧腺苷三磷酸 1 μL,Taq聚合酶2 μL,待測樣品互補DNA 5 μL,雙蒸餾水30 μL,總體積50 μL。將配制好的聚合酶鏈反應(yīng)溶液置于實時聚合酶鏈反應(yīng)儀上進行聚合酶鏈反應(yīng)擴增反應(yīng)。反應(yīng)條件：93 ℃預(yù)變性2 min，之后94 ℃ 1 min，56 ℃ 1 min，73 ℃ 1 min，共40個循環(huán)，最后73 ℃ 7 min延伸。采用ΔΔCt法分析溶解曲線。以miR-346/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)吸光度比值進行分析。

1.4結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) 采用陽性細胞著色強度與染色陽性細胞百分比綜合結(jié)果進行判斷結(jié)果[6]。根據(jù)陽性細胞占一個400倍視野中所有細胞總數(shù)的百分比：陽性細胞數(shù)≤10%計1分；陽性細胞數(shù)>10%～50%計2分；>50%～70%計3分；>70%計4分。顯色程度依據(jù)陽性強度進行判斷：無染色計0分；淺染棕黃色計1分；較深棕黃色計2分；深棕黃色并且有濃染顆粒計3分。兩項分?jǐn)?shù)之和可定為4個級別：1分計陰性(-)；2～3分計弱陽性(+)；4～5分計中度陽性(++)；6～7分計強陽性(+++)。最終結(jié)果以3～7分計為陽性染色。評分由三名具有主任醫(yī)師資格的高年資病理科醫(yī)師采用盲法完成。腫瘤根據(jù)最后結(jié)果分為兩組：低表達組包括陰性(-)和陽性(+)；高表達組包括中度陽性(++)和強陽性(+++)。

2 結(jié) 果

2.1miR-346、L1CAM mRNA及L1CAM蛋白在組織中的表達 結(jié)腸癌組織miR-346表達高于癌旁組織及正常結(jié)腸組織(1.272±0.501比0.621±0.168、0.201±0.078)(F=6.524,P<0.001)，癌旁組織與正常結(jié)腸組織比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.905)。結(jié)腸癌組織L1CAM mRNA表達高于癌旁組織及正常結(jié)腸組織(1.035±0.592比0.452±0.122、0.246±0.085)(F=5.183,P<0.001),癌旁組織與正常結(jié)腸組織比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.745)。L1CAM蛋白表達于結(jié)腸癌細胞膜(圖1a)，在癌旁組織(圖1b)及正常結(jié)腸組織(圖1c)中無表達，結(jié)腸癌組織中L1CAM蛋白陽性表達率為74.6%(47/68)。結(jié)腸癌組織中miR-346與L1CAM mRNA表達呈正相關(guān)(r=0.731，P<0.001)，見圖2。

2.2不同臨床病理特征結(jié)腸癌患者癌組織中miR-346及L1CAM蛋白表達的比較 不同年齡、性別、腫瘤位置、腫瘤直徑、病理分型、病理類型患者結(jié)腸癌組織中miR-346及L1CAM蛋白的表達比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，而在腫瘤浸潤T3～T4、遠處轉(zhuǎn)移M1、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性、血管浸潤陽性、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期及腫瘤分化程度低分化中表達更高(均P<0.05),見表1。

1a:L1CAM蛋白在結(jié)腸癌組織高表達；1b:L1CAM蛋白在正常結(jié)腸組織無表達；1c:L1CAM蛋白在癌旁組織無表達

圖2 L1CAM mRNA與miR-346的相關(guān)性

3 討 論

目前結(jié)腸癌發(fā)病率呈上升趨勢,早期病情隱匿,難以診斷[7-9]。近年來，隨著對Ⅳ期結(jié)腸癌治療方案的改進及靶向藥物的研發(fā)，晚期結(jié)腸癌治愈率及生存率均得到一定程度的提高，對靶向藥物的探索是結(jié)腸癌生存率進一步提高的主要研究方向。隨著分子生物學(xué)及基因檢測的發(fā)展，為結(jié)腸癌的診斷及治療提供了更多的腫瘤標(biāo)志物、預(yù)測靶點及治療靶點[10-12]。L1CAM是跨膜糖蛋白的一種，是免疫球蛋白超家族L1家族中的一員。L1家族成員有L1CAM(CD171)、神經(jīng)束蛋白、L1CAM相近同系物等[13]。研究顯示,L1CAM參與多種惡性腫瘤發(fā)生及發(fā)展，調(diào)控惡性腫瘤細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移及化療耐藥等過程，對惡性腫瘤的預(yù)后具有預(yù)測價值[14]。miRNA作為非編碼RNA，通過特異性識別并結(jié)合靶mRNA 的3′-UTR參與多種腫瘤發(fā)生、發(fā)展的多個環(huán)節(jié)的調(diào)控。

表1 不同臨床病理特征結(jié)腸癌患者癌組織中miR-346及L1CAM蛋白表達的比較

L1CAM：L1細胞黏附因子；a為F值，余為t值

本研究結(jié)果顯示,miR-346在結(jié)腸癌組織中表達高于癌旁組織及正常結(jié)腸組織。L1CAM mRNA在結(jié)腸癌組織中的表達高于癌旁組織及正常結(jié)腸組織L1CAM蛋白表達于結(jié)腸癌細胞膜，在癌旁組織及正常結(jié)腸組織中無表達。結(jié)腸癌組織中L1CAM蛋白陽性表達率為74.6%。結(jié)腸癌組織中miR-346與L1CAM mRNA表達量呈正相關(guān)。這表明，miR-346可能通過調(diào)控L1CAM表達介導(dǎo)結(jié)腸癌惡性行為。另有研究顯示，L1CAM在子宮內(nèi)膜癌、結(jié)腸癌、食管癌及胰腺癌等惡性腫瘤中表達水平高于相應(yīng)正常組織，提示腫瘤的預(yù)后不良[2-5]。本研究進一步顯示，結(jié)腸癌組織中miR-346及L1CAM蛋白高表達者腫瘤浸潤深度、遠處轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血管浸潤、TNM分期及腫瘤分化程度均較差,腫瘤浸潤深度T3及T4、遠處轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血管浸潤、TNM分期差及腫瘤分化程度差的結(jié)腸癌組織中miR-346及L1CAM表達量高。這表明，在結(jié)腸癌中，miR-346及L1CAM高表達時，腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移惡性行為能力增強，可能對腫瘤惡性行為具有促進作用。miRNA通過靶基因?qū)Y(jié)直腸癌唾液酸化的調(diào)控作用，可能在結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移等惡性行為調(diào)控及化療耐藥方面具有重要作用。在中華地鼠卵巢細胞中，L1CAM通過磷脂酰肌醇-3-激酶及細胞外信號調(diào)節(jié)激酶通路調(diào)控糖化過程，調(diào)節(jié)細胞的增殖及轉(zhuǎn)移過程[14]。Ito等[15]通過小干擾RNA敲除胃癌細胞中L1CAM表達，在胃癌細胞株中，L1CAM是通過胞外信號調(diào)節(jié)激酶通路調(diào)控胃癌細胞的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移的惡性行為。Schirmer等[16]研究顯示，在子宮內(nèi)膜癌HEC1B細胞中，miR-34a過表達下調(diào)L1CAM表達，抑制細胞轉(zhuǎn)移。p53激活會導(dǎo)致miR-34a上調(diào)，L1CAM表達下調(diào),因此miR-34a對L1CAM具有調(diào)控作用。miR-34a可以結(jié)合到L1CAM mRNA的3′UTR端，L1CAM在轉(zhuǎn)錄水平受到miRNA調(diào)控[17]。通過TGGA數(shù)據(jù)挖掘、生物信息學(xué)檢索及文獻檢索發(fā)現(xiàn)，miR-346在惡性腫瘤中的研究較少，miR-346通過抑制乳腺癌轉(zhuǎn)移抑制因子1表達促進肝細胞癌進展[18]。有研究顯示，在肝細胞癌中miR-346通過SET和MYND域包含蛋白3依賴性通路抑制細胞增殖[19]。miR-346通過靶向作用于Krüppel樣因子4調(diào)節(jié)神經(jīng)干細胞增殖及分化[20]。

結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移及化療耐藥等的機制研究，目前以信號通路的研究及上下游調(diào)控基因的發(fā)掘為主要方向，靶向治療及免疫治療為腫瘤耐藥提供了新的有效治療方案，針對不同靶點的靶向藥物綜合治療可能是進一步提高晚期結(jié)直腸癌生存期的策略。因此，更多治療靶點的發(fā)現(xiàn)是進一步擴大靶向治療范圍的主要手段，本研究首先通過生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測miR-346與L1CAM可能具有相關(guān)性，L1CAM及miR-346在結(jié)腸癌中表達上調(diào),可能對結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移及侵襲等惡性行為具有調(diào)控作用,兩者可能具有靶向調(diào)控關(guān)系，成為結(jié)腸癌的腫瘤標(biāo)志物或預(yù)測因子，兩者可能具有上下游的調(diào)控關(guān)系，但兩者的上下游關(guān)系和作用機制及是否可以成為靶向治療的治療靶點需進一步通過實驗論證。