曹茜,楊玉倩,左晶,魏偉

(南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 眼科，江蘇 南京 210029)

年齡相關(guān)性黃斑變性(age related macular degeneration, AMD)是一組發(fā)生于50歲以上中老年人的病變累及黃斑區(qū)視網(wǎng)膜色素上皮、感光細(xì)胞層和脈絡(luò)膜多層組織從而造成視力進(jìn)行性損害的眼科疾病[1]。在我國,AMD居致盲原因的第3位[2]。

AMD的發(fā)病機(jī)制不明確，目前假說主要包括氧化刺激學(xué)說、老齡化學(xué)說、炎性免疫學(xué)說等[3- 5]。研究顯示，枸杞多糖(lyciumbarbarumpolysaccharide,LBP)對藍(lán)光照射或過氧化物誘導(dǎo)的氧化損傷模型的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(ARPE- 19)具有保護(hù)作用[6- 7]。

近年來，自噬在眼部疾病方面的研究不斷增加，干性AMD中，細(xì)胞溶酶體結(jié)構(gòu)破壞、氧化應(yīng)激等能激活免疫炎癥反應(yīng)，而細(xì)胞中自噬的異?？赡芗觿∵@一反應(yīng)，促進(jìn)干性AMD病變的發(fā)展[5,8]。在AMD的發(fā)生、發(fā)展過程中，視網(wǎng)膜的氧化應(yīng)激與細(xì)胞自噬之間相互作用，觸發(fā)并推動AMD[9]。因此，本研究將觀察氧化應(yīng)激與ARPE- 19細(xì)胞自噬之間的關(guān)系，并予以LBP進(jìn)行干預(yù)，觀察ARPE- 19細(xì)胞Beclin- 1、LC3B蛋白表達(dá)的變化，以期探討LBP的作用機(jī)制，為臨床運(yùn)用LBP防治AMD提供思路與依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物及試劑

LBP購自南京朗澤醫(yī)藥科技有限公司，過氧化氫(H2O2)購自美國Amresco公司。RPMI- 1640培養(yǎng)基及胎牛血清購自美國Hyclone公司，0.25%胰蛋白酶購自美國GIBCO公司，二甲基亞砜(DMSO)購自美國Sigma公司。蛋白質(zhì)印跡法中使用的自噬基因Beclin兔抗人單克隆抗體、LC3B單克隆抗體購自英國Abcam公司，抗β- Actin購自英國Bioworld Technology公司。ECL發(fā)光試劑盒購自英國GE Healthcare公司。

1.2 細(xì)胞系及細(xì)胞培養(yǎng)

ARPE- 19細(xì)胞購自美國ATCC公司。取對數(shù)生長期的ARPE- 19細(xì)胞，以密度為105個(gè)·mL-1接種于6孔板中，用RPMI- 1640培養(yǎng)液，置于37 ℃、5% CO2環(huán)境中培養(yǎng)。

1.3 主要儀器

電泳儀(美國Bio- Rad)、化學(xué)發(fā)光成像儀(美國Bio- Rad ChemiDoc XRS+)、核酸蛋白測定儀(美國ThermoNanodrop 2000)。

1.4 方法

1.4.1 透射電鏡觀察H2O2誘導(dǎo)ARPE- 19細(xì)胞自噬的情況 設(shè)未經(jīng)H2O2誘導(dǎo)的ARPE- 19細(xì)胞為對照組，經(jīng)H2O2誘導(dǎo)12 h的細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)組(H2O2濃度分別為200、400、600 μmol·L-1)，收取各組細(xì)胞置于3%戊二醛中固定、PBS洗滌、1%鋨酸固定、梯度乙醇丙酮脫水、包埋、聚合、超薄切片、鉛染后，采用透射電鏡觀察細(xì)胞自噬變化[10]。

1.4.2 蛋白質(zhì)印跡法檢測LBP對H2O2誘導(dǎo)ARPE- 19細(xì)胞自噬的影響 設(shè)未經(jīng)處理的ARPE- 19細(xì)胞為對照組，經(jīng)不同濃度H2O2處理的ARPE- 19細(xì)胞(H2O2濃度分別為200、400、600、800 μmol·L-1)，以及經(jīng)過H2O2(400 μmol·L-1)和LBP(10、100、1 000 μg·ml-1)共同處理后的ARPE- 19為實(shí)驗(yàn)組。收集對數(shù)生長期細(xì)胞，PBS沖洗2次，加入RIPA裂解液抽提細(xì)胞總蛋白并定量。將蛋白提取液置于12% SDS- PAGE電泳分離，半干法轉(zhuǎn)膜，加入5%脫脂牛奶孵育封閉1 h。分別加入相應(yīng)一抗：LC3B(1∶1 000)、Beclin- 1(1∶1 000),于4 ℃條件下孵育過夜，以PBST洗膜，室溫條件下以1∶5 000的抗體滴度孵育二抗2 h，用PBST洗膜。用ECL化學(xué)發(fā)光顯影試劑盒顯影，以β- Actin作為內(nèi)參照，掃描目的條帶和內(nèi)參條帶,采用Image Lab 5.0分析數(shù)據(jù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 H2O2對ARPE- 19細(xì)胞自噬表達(dá)的影響

不同濃度H2O2誘導(dǎo)ARPE- 19細(xì)胞12 h后，H2O2200 μmol·L-1組自噬表達(dá)不明顯，H2O2600 μmol·L-1組自噬體數(shù)量明顯增加，顯示自噬表達(dá)顯著增加。見圖1。

A.對照組；B.H2O2200 μmol·L-1組；C.H2O2400 μmol·L-1組；D.H2O2600 μmol·L-1組

圖1不同濃度H2O2對ARPE-19細(xì)胞自噬表達(dá)的影響

2.2 LBP對H2O2誘導(dǎo)后的ARPE- 19細(xì)胞Beclin- 1、LC3BⅠ和LC3BⅡ表達(dá)的影響

不同濃度H2O2誘導(dǎo)后，ARPE- 19細(xì)胞的Beclin- 1、LC3BⅠ和LC3BⅡ表達(dá)升高，與對照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。H2O2濃度越高，ARPE- 19細(xì)胞的Beclin、LC3BⅠ和LC3BⅡ表達(dá)越高，LC3BⅡ/LC3BⅠ值也越高，呈現(xiàn)濃度依賴。加入LBP后，隨著濃度增加，ARPE- 19細(xì)胞的Beclin- 1、LC3BⅠ和LC3B Ⅱ 表達(dá)降低，LC3B Ⅱ /LC3B Ⅰ值也降低。與H2O2400 μmol·L-1組比較，1 000 μg·mL-1LBP+400 μmol·L-1H2O2組ARPE- 19細(xì)胞的Beclin- 1、LC3BⅠ和LC3BⅡ表達(dá)顯著降低(P<0.01)。見表1及圖2。

組 別Beclin-1LC3BⅠLC3BⅡLC3BⅡ/LC3BⅠ值空白對照組0.32±0.06a0.37±0.07a0.20±0.05a0.51±0.11aH2O2組 200 μmol·L-10.46±0.09b0.63±0.10ab0.51±0.06ab0.79±0.13b 400 μmol·L-10.62±0.11b0.83±0.11b0.69±0.10b0.83±0.14b 600 μmol·L-10.86±0.10b1.29±0.13ab1.02±0.13ab0.89±0.17b 800 μmol·L-10.90±0.14ab1.31±0.14ab1.15±0.17ab0.93±0.14bLBP+H2O2組 10 μg·ml-1LBP+400 μmol·L-1 H2O20.64±0.07b0.85±0.08b0.80±0.07b0.91±0.15b 100 μg·ml-1LBP+400 μmol·L-1 H2O20.56±0.08b0.74±0.07b0.62±0.06b0.78±0.12b 1 000 μg·ml-1LBP+400 μmol·L-1 H2O20.49±0.06ab0.54±0.07ab0.39±0.04ab0.61±0.10a

與H2O2400 μmol·L-1組比較，aP<0.01；與空白對照組比較，bP<0.01

與對照組比較，aP<0.01；與400 μmol·L-1H2O2組比較，bP<0.01

A.LBP對H2O2誘導(dǎo)ARPE- 19細(xì)胞Beclin- 1蛋白表達(dá)影響；B.LBP對H2O2誘導(dǎo)ARPE- 19細(xì)胞LC3BⅠ和LC3BⅡ蛋白表達(dá)影響

圖2LBP對H2O2誘導(dǎo)ARPE-19細(xì)胞Beclin-1、LC3BⅠ和LC3BⅡ表達(dá)的影響

3 討 論

AMD是一組發(fā)生于50歲以上中老年人的病變累及黃斑區(qū)視網(wǎng)膜色素上皮、感光細(xì)胞層和脈絡(luò)膜多層組織從而造成視力進(jìn)行性損害的眼科疾病[11]。在西方國家AMD是導(dǎo)致老年人視力殘疾的首要病因[12]，是目前亟待解決的臨床問題。

本研究發(fā)現(xiàn)，H2O2誘導(dǎo)ARPE- 19細(xì)胞12 h后，H2O2200 μmol·L-1組自噬體表達(dá)不明顯，H2O2600 μmol·L-1組自噬體表達(dá)顯著增加，證實(shí)H2O2能夠誘導(dǎo)ARPE- 19細(xì)胞自噬水平的升高。Beclin 1是參與自噬調(diào)控的重要基因，主要通過與磷酸肌醇三磷酸激酶Ⅲ型PIK形成復(fù)合體，來調(diào)控其他自噬蛋白的表達(dá)強(qiáng)度，與自噬活性密切相關(guān)[13- 14]。本研究發(fā)現(xiàn)，H2O2誘導(dǎo)后，ARPE- 19細(xì)胞Beclin- 1表達(dá)比對照組明顯升高(P<0.01)，而且呈現(xiàn)H2O2濃度依賴。加入LBP后，隨著濃度增加Beclin- 1表達(dá)降低?？梢姡琇BP對H2O2誘導(dǎo)所致自噬水平升高有干預(yù)作用。

LC3B有兩種存在形式，LC3BⅠ存在于胞漿中，LC3BⅡ與磷脂結(jié)合存在于細(xì)胞膜上[15]。自噬體的形成需要LC3B的修飾調(diào)節(jié)，LC3BⅡ是自噬體的標(biāo)記物。當(dāng)自噬增強(qiáng)時(shí)有更多的LC3BⅠ向LC3BⅡ轉(zhuǎn)變。因此，通過監(jiān)測LC3BⅡ/LC3BⅠ值可以了解自噬的變化[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，在單純H2O2誘導(dǎo)組中,隨著H2O2濃度增加LC3B Ⅱ/LC3B Ⅰ 值升高，呈現(xiàn)濃度依賴。H2O2誘導(dǎo)基礎(chǔ)上加入不同濃度LBP干預(yù)，隨著LBP濃度增加LC3B Ⅱ/LC3B Ⅰ值降低，并呈現(xiàn)濃度依賴。與H2O2400 μmol·L-1組比較，1 000 μmol·L-1LBP+400 μmol·L-1H2O2組的LC3BⅡ/LC3BⅠ值顯著降低(P<0.01)。綜上所述，LBP能夠干預(yù)H2O2誘導(dǎo)所致ARPE- 19細(xì)胞的自噬水平升高，1 000 μmol·L-1濃度時(shí)效應(yīng)最為顯著。