鮑 賽，操麗麗，龐 敏，潘麗軍，侯志剛，水龍龍，李進(jìn)紅，姜紹通

（合肥工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，安徽省農(nóng)產(chǎn)品精深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230009）

磷脂酶A1（phospholipase A1，PLA1）（Lecitase?Ultra）是一類能特異性水解磷脂Sn-1位?；扇苎字椭舅岬拿?，在油脂化學(xué)工業(yè)中發(fā)揮重要作用[1-2]。然而，游離PLA1存在價(jià)格昂貴、穩(wěn)定性差和難以從反應(yīng)體系分離與回收等缺點(diǎn)，限制了它的工業(yè)化應(yīng)用[3]。對(duì)PLA1固定化能很好地解決上述問(wèn)題。酶的固定化技術(shù)是指利用物理或化學(xué)手段將酶限制或束縛在載體上，但酶的催化特性得以保留和穩(wěn)定性得以提高的一門技術(shù)[4]。

Fe3O4磁性微球由于具備超順磁性、高比表面積、低毒性以及優(yōu)良的生物相容性等優(yōu)勢(shì)而成為酶固定化的重要載體[5-6]。然而，F(xiàn)e3O4磁性微球表面除少量羥基外沒(méi)有活潑的官能團(tuán)與酶分子發(fā)生共價(jià)反應(yīng)，且裸露的Fe3O4磁性微球在空氣中易被氧化，在Fe3O4磁性微球表面進(jìn)行化學(xué)修飾引入合適的活潑基團(tuán)能改進(jìn)這些不足，更好地用于酶的固定化[7]。

環(huán)氧基團(tuán)在中性條件下非常穩(wěn)定，即使是在潮濕的環(huán)境中也可以長(zhǎng)期貯存[8]。據(jù)報(bào)道，它們?cè)趬A性或酸性條件下，能通過(guò)多點(diǎn)共價(jià)固定化酶[9]。因此，環(huán)氧基修飾的Fe3O4磁性微球是一種非常理想的固定化酶載體，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于各種酶的固定化，如脂肪酶[10]、馬肝醇脫氫酶[11]和青霉素G酰化酶[12]，但固定化PLA1還鮮有探討。本研究利用自制的環(huán)氧基修飾的Fe3O4磁性微球?yàn)檩d體固定PLA1，采用響應(yīng)面法優(yōu)化PLA1的固定化條件，并考察其酶學(xué)性質(zhì)和載體的結(jié)構(gòu)組成特性，以期為后續(xù)研究酶法脫膠和工業(yè)化應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

PLA1（Lecitase?Ultra） 丹麥諾維信公司；γ-（2,3-環(huán)氧丙氧）丙基三甲氧基硅烷（γ-glycidoxypropyltrimethoxysilane，GPTMS） 上海阿拉丁有限公司；大豆卵磷脂（粉末狀） 上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司；FeCl2·4H2O、無(wú)水FeCl3、乙醇、磷酸氫二鈉、檸檬酸、聚乙烯醇、氫氧化鈉、氟化鈉、丙酮、考馬斯亮藍(lán)（均為分析純）國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Nicolet67傅里葉紅外光譜儀 美國(guó)Thermo Nicolet公司；D/MAX2500V X射線衍射儀 日本理學(xué)株式會(huì)社；SU8020冷場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡（scanning electron microscopy，SEM） 日本日立公司；JEM-1011透射電子顯微鏡（transmission electron microscopy，TEM）日本電子公司；T6新世紀(jì)型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；DZJ-4B自動(dòng)電位滴定儀上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；DZF-6053真空干燥箱上海一恒科學(xué)儀器有限公司；FA25高剪切分散乳化機(jī)上海弗魯克流體機(jī)械制造有限公司；HH-S數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇金壇金城國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠；NSKY-110WX型水浴搖床 上海蘇坤實(shí)業(yè)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 Fe3O4磁性微球的制備

采用傳統(tǒng)的共沉淀法制備Fe3O4磁性微球[13]，整個(gè)制備過(guò)程在氮?dú)猸h(huán)境中進(jìn)行。首先，將FeCl2·4H2O和無(wú)水FeCl3按物質(zhì)的量比1∶2加入100 mL的去離子水中。然后，在室溫下逐滴加入7 mL 30% NaOH溶液同時(shí)劇烈攪拌，直至產(chǎn)生黑色沉淀。最后，磁分離，用去離子水洗至pH 7.0，室溫下真空干燥12 h。

1.3.2 GPTMS修飾Fe3O4磁性微球[14]

稱0.5 g制備的Fe3O4磁性微球于20 mL超純水中，超聲分散5 min，稱為A液；稱2.5 g GPTMS于20 mL的超純水中，超聲分散5 min，并用4%的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至中性，稱為B液。將A液和B液全部加入100 mL的三口燒瓶中，超聲10 min，再加入5 mL 1%氟化鈉溶液，室溫抽真空減壓3 h，磁分離，用丙酮洗滌若干次后，室溫真空干燥12 h得環(huán)氧基修飾的Fe3O4磁性微球（Fe3O4@GPTMS）。

1.3.3 Fe3O4@GPTMS固定化PLA1

為獲得高酶活力和高固定化率的固定化酶制劑，在不同固定化條件如緩沖液pH值、酶液添加量和固定化時(shí)間下進(jìn)行單因素試驗(yàn)。分別取1～6 mL PLA1和1 g Fe3O4@GPTMS于50 mL緩沖液（0.1 mol/L檸檬酸溶液、0.2 mol/L磷酸氫二鈉溶液按不同比例配成pH值分別為3.0～6.0的緩沖液）中，在室溫（20 ℃）條件下用搖床振蕩固定1～6 h，傾出上清液，用緩沖液沖洗若干次至洗液中無(wú)蛋白被檢測(cè)出。將固定化酶、上清液和洗液保存于4 ℃冰箱中。

1.3.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

基于單因素試驗(yàn)結(jié)果，以固定化酶活力為指標(biāo)，通過(guò)Box-Behnken設(shè)計(jì)優(yōu)化固定化PLA1的條件參數(shù)。試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 固定化條件Box-Behnken試驗(yàn)因素與水平Table1 Factors and their levels used for Box-Behnken design for optimization of immobilization conditions

1.3.5 固定化PLA1的固定化率及酶活力測(cè)定

依據(jù)Bradford[15]的方法測(cè)定蛋白含量，通過(guò)測(cè)定蛋白含量得到固定化率，見(jiàn)下式。參照文獻(xiàn)[16-17]測(cè)定游離PLA1和固定化PLA1活力，相對(duì)酶活力是指在同組實(shí)驗(yàn)中，最大值為100%時(shí)其他值與最大值的百分比。

式中：X1為固定化前加入酶液的蛋白含量/mg；X2為洗液和上清液中蛋白含量/mg。

1.3.6 酶學(xué)性質(zhì)分析

1.3.6.1 最適作用pH值和最適作用溫度

分別在不同pH值（4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0）和不同溫度（40、45、50、55、60、65 ℃）條件下，以1.3.5節(jié)的方法測(cè)定游離PLA1和固定化PLA1的相對(duì)酶活力。

1.3.6.2 貯藏穩(wěn)定性

游離PLA1和固定化PLA1分別在25 ℃孵育20 d，每隔2 d定時(shí)測(cè)剩余酶活力。

1.3.6.3 操作穩(wěn)定性

參考Yu Dianyu等[18]的研究，將固定化PLA1置于裝有菜籽毛油的三角燒瓶中，在50 ℃的水浴鍋中進(jìn)行機(jī)械攪拌3 h，回收固定化PLA1，重復(fù)操作8 個(gè)批次。每次循環(huán)后，用pH 4.0的緩沖液沖洗固定化PLA1。計(jì)算每個(gè)循環(huán)后的殘余酶活力與初始酶活力（100%）百分比。

1.3.7 Fe3O4和Fe3O4@GPTMS磁性微球的表征

采用X射線衍射（X-ray diffraction，XRD）、衰減全反射傅里葉變換紅外光譜（attenuated total reflection Fourier-transform infrared spectroscopy，ATR-FTIR）、SEM和TEM對(duì)Fe3O4和Fe3O4@GPTMS磁性微球進(jìn)行檢測(cè)和分析。樣品進(jìn)行XRD測(cè)定，CuKα輻射；樣品進(jìn)行ATR-FTIR測(cè)定，掃描范圍為500～4 000 cm－1；樣品進(jìn)行SEM分析，加速電壓為15.0 kV，放大倍數(shù)為100 000 倍，噴金后在電鏡下觀察其表觀形貌；樣品進(jìn)行TEM分析，加速電壓100 kV，放大倍數(shù)150 000 倍，噴金后在電鏡下觀察其形貌和粒徑分布。

2 結(jié)果與分析

2.1 固定化條件的優(yōu)化

2.1.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1.1 最適緩沖液pH值的確定

圖1 pH值對(duì)酶固定化效果的影響Fig.1 Effect of pH on phospholipase immobilization

由圖1可知，相對(duì)酶活力及固定化率受緩沖液pH值的影響較大。在一定的固定化條件下，固定化率隨著pH值的升高而減小，而相對(duì)酶活力隨著pH值的升高先逐漸增大后逐漸減小。選擇pH 4.0，酶活力達(dá)到最大，固定化率為67.4%。這可能是由于pH值越遠(yuǎn)離7.0，環(huán)氧基團(tuán)與酶結(jié)合能力越強(qiáng)，固定化率越大[19]。但酶作為一種蛋白質(zhì)，在過(guò)酸或者過(guò)堿的環(huán)境中，酶容易變性失活[20]。

2.1.1.2 最適酶液添加量的確定

圖2 酶液添加量對(duì)酶固定化效果的影響Fig.2 Effect of enzyme dosage on phospholipase immobilization

由圖2可知，固定化率隨著酶液的增加而逐漸減小，而相對(duì)酶活力隨著酶液的增加而逐漸增加，當(dāng)酶液添加量達(dá)到載體所能固定的最大酶量時(shí)，相對(duì)酶活力趨于穩(wěn)定，不再發(fā)生變化。這主要是由于隨著酶液的增加，載體上游離基團(tuán)越來(lái)越少導(dǎo)致固定化率降低，而載體上結(jié)合的酶分子越來(lái)越多，酶活力增加，當(dāng)酶在載體上的負(fù)載量達(dá)到最大值，相對(duì)酶活力也達(dá)到最大值，不再發(fā)生變化[21]。酶液添加量選3.0 mL，此時(shí)，酶活力最大，固定化率為67.4%。

2.1.1.3 最適固定化時(shí)間的確定

圖3 固定化時(shí)間對(duì)酶固定化效果的影響Fig.3 Effect of reaction time on phospholipase immobilization

如圖3所示，隨著固定化時(shí)間的延長(zhǎng)，固定化率逐漸增大，在2 h趨于穩(wěn)定，而相對(duì)酶活力先增加，在2 h后略微有所下降。這是由于載體的量是固定的，隨著固定化時(shí)間的延長(zhǎng)，載體上的活性基團(tuán)逐漸被酶結(jié)合，在2 h時(shí)載體結(jié)合酶量達(dá)到飽和，固定化率達(dá)到最大值，不再發(fā)生變化，而當(dāng)固定化時(shí)間超過(guò)2 h后，酶蛋白失活導(dǎo)致相對(duì)酶活力略微降低[20]。因此，最適固定化時(shí)間為2 h，酶活力最大，固定化率為61.1%。

2.1.2 響應(yīng)面優(yōu)化固定化條件

2.1.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table2 Experimental design and results for response surface analysis

利用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)表2中數(shù)據(jù)進(jìn)行多項(xiàng)式回歸擬合，結(jié)果如表3所示。

表3 回歸模型的方差分析Table3 Analysis of variance of the regression equation

由表3可以看出，回歸模型高度顯著（P＜0.000 1），校正系數(shù)R2為0.918 2，失擬項(xiàng)P值為0.637 8，回歸方程具有很高的擬合度和可信度，可用此模型對(duì)固定化條件進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。校正決定系數(shù)為0.969 6，即此回歸方程可以解釋96.96%的酶活力數(shù)據(jù)的可變性。C、A2、B2、C2影響極顯著（P＜0.01），A和BC對(duì)響應(yīng)面的影響比較顯著（P＜0.1），AB、AC對(duì)響應(yīng)值無(wú)影響。各個(gè)試驗(yàn)因素對(duì)酶活力的影響依次為：C（酶液添加量）＞A（緩沖液pH值）＞B（反應(yīng)時(shí)間）。

獲得的回歸方程模型為：Y=3 528－58.75A－35B+301.25C－82.5BC－686.5A2－284B2－271.5C2。

根據(jù)回歸方程，確定PLA1固定化的最佳條件為緩沖液pH 3.98、反應(yīng)時(shí)間1.85 h、酶液添加量3.58 mL/g，預(yù)測(cè)酶活力為3 618.14 U/g。

2.1.2.2 最優(yōu)值的確定

為驗(yàn)證所獲得結(jié)果的可靠性，進(jìn)行3 次重復(fù)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，對(duì)響應(yīng)面的結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，確定緩沖液pH 4.0、反應(yīng)時(shí)間1.9 h、酶液添加量3.6 mL/g，此條件下進(jìn)行固定化得到的酶活力為3 675 U/g，該值落在響應(yīng)值Y的預(yù)測(cè)區(qū)內(nèi)[3 437.23，3 799.00]內(nèi)，說(shuō)明該模型具有很好的擬合度。

2.2 酶學(xué)性質(zhì)分析

2.2.1 最適作用pH值和最適作用溫度

圖4 pH值（A）和溫度（B）對(duì)游離酶和固定化酶活力影響Fig.4 Effects of pH (A) and temperature (B) on the activities of free and immobilized enzyme

分別考察在pH 4.5～7.0、溫度40～65℃范圍內(nèi)，pH值和溫度對(duì)游離PLA1和固定化PLA1活力的影響。如圖4A所示，游離PLA1的最適作用pH值為5.0，固定化PLA1的最適作用pH值為6.0，固定化后，最適作用pH值向堿性方向偏移了1.0。此外，固定化PLA1比游離PLA1具有更寬的作用范圍?？赡苁怯捎诿阜肿优c載體材料的性質(zhì)不同，固定化酶復(fù)合物通過(guò)增強(qiáng)pH值耐受性避免構(gòu)象變化[21]。

如圖4B所示，游離PLA1和固定化PLA1的最適作用溫度分別為50、55 ℃，固定化后，最適作用溫度提高了5 ℃。在較高的溫度范圍內(nèi)，固定化PLA1比游離PLA1具有更高的相對(duì)活性。這可能是由于酶被固定在載體上限制了酶分子在高溫下的構(gòu)象遷移，從而有效地阻止了酶的失活[22-23]。

2.2.2 貯藏穩(wěn)定性

圖5 游離酶和固定化酶的貯藏穩(wěn)定性Fig.5 Storage stability of free and immobilized enzyme

如圖5所示，在室溫下放置8 d，游離PLA1剩余酶活力為58.9%，而固定化PLA1剩余酶活力仍為80%以上；在室溫放置20 d后，游離PLA1活力損失90%左右，而固定化PLA1為初始酶活力的50%以上。這可能是由于固定化后酶的空間三維結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，分子間的氫鍵和靜電相互作用增強(qiáng)，酶分子的催化活性中心構(gòu)象得以完整保存[24-25]。因此，固定化后，酶具備更長(zhǎng)的貯藏周期，這將延長(zhǎng)酶的使用壽命，拓寬酶的應(yīng)用前景。

2.2.3 操作穩(wěn)定性

固定化酶能多次重復(fù)使用，提高酶的可重復(fù)使用性是降低酶單次使用成本的重要途徑之一[10]。如圖6所示，相同的酶活力測(cè)定條件下，在重復(fù)菜籽油脫膠8 個(gè)批次后，仍保留81.1%的酶活力，固定化PLA1具有優(yōu)良的操作穩(wěn)定性。這主要是由于酶與載體上的環(huán)氧基共價(jià)連接，穩(wěn)定性較強(qiáng)，使每次循環(huán)過(guò)程中較少的酶脫落[26]。

圖6 固定化酶的重復(fù)使用性Fig.6 Reusability of immobilized enzyme

2.3 Fe3O4和Fe3O4@GPTMS磁性微球的表征

2.3.1 XRD分析

圖7 XRD圖Fig.7 XRD pattern

如圖7所示，F(xiàn)e3O4磁性微球的6 個(gè)特征峰（2θ為30.18°、35.48°、43.32°、53.68°、57.26°和62.84°）在Fe3O4@GPTMS磁性微球中也可以觀察到，且各峰的位置和相對(duì)強(qiáng)度與標(biāo)準(zhǔn)Fe3O4的XRD圖譜有很好的對(duì)應(yīng)關(guān)系，表明制備的Fe3O4磁性微球?yàn)榉词郊饩Y(jié)構(gòu)，且經(jīng)過(guò)環(huán)氧基修飾后，結(jié)構(gòu)保持不變[27]。

2.3.2 ATR-FTIR分析

圖8 Fe3O4和Fe3O4@GPTMS磁性微球的衰減全反射傅里葉紅外吸收光譜圖Fig.8 ATR-FTIR spectra of Fe3O4 and Fe3O4@GPTMS magnetic microspheres

如圖8所示，F(xiàn)e3O4磁性微球的ATR-FTIR圖譜在567 cm－1附近出現(xiàn)吸收峰，表明Fe—O發(fā)生伸縮振動(dòng)，在3 360 cm－1附近出現(xiàn)吸收峰表明O—H鍵發(fā)生伸縮振動(dòng)，這說(shuō)明已經(jīng)成功地合成了Fe3O4磁性微球。與Fe3O4磁性微球的ATR-FTIR圖譜對(duì)比發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)e3O4@GPTMS磁性微球的圖譜在1 040 cm－1附近出現(xiàn)Si—O鍵的吸收峰，且分別在2 970 cm－1和2 870 cm－1處多了一個(gè)吸收峰，這分別與—CH3和—CH2鍵的拉伸有關(guān)，表明Fe3O4磁性微球表面成功接合環(huán)氧基團(tuán)[28]。

2.3.3 SEM和TEM分析

由圖9a、b可知，F(xiàn)e3O4磁性微球和Fe3O4@GPTMS磁性微球顆粒大小均勻，近似球形，有團(tuán)聚現(xiàn)象，這可能是由于粒子間的磁偶極相互作用[29]。由圖9c、d可知，F(xiàn)e3O4磁性微球和Fe3O4@GPTMS磁性微球粒徑在10～30 nm之間，成功制備出納米尺寸的磁性微球。與Fe3O4相比，F(xiàn)e3O4@GPTMS的形貌和尺寸分布幾乎沒(méi)有改變，這表明環(huán)氧基修飾沒(méi)有顯著改變Fe3O4磁性微球的形貌和尺寸分布[21]。且可以通過(guò)SEM和XRD圖得出修飾后的Fe3O4磁性微球仍保留Fe3O4磁性微球的結(jié)構(gòu)特征[30]。

圖 9 SEM和TEM圖Fig.9 SEM and TEM images

3 結(jié) 論

以自制的環(huán)氧基修飾的Fe3O4磁性微球?qū)LA1進(jìn)行固定化，XRD、ATR-FTIR、SEM和TEM分析表明成功制備出納米尺寸的載體，且環(huán)氧基被修飾在其表面。通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化得到固定化PLA1的最佳條件為：1 g環(huán)氧基修飾的Fe3O4磁性微球和3.6 mL酶液在pH 4.0的緩沖液中，室溫條件下振蕩固定1.9 h。在此條件下，得到的酶活力為3 675 U/g，固定化率為61.1%。與游離PLA1相比，固定化PLA1的最適作用pH值從5.0移動(dòng)到6.0，向堿性方向偏移1.0；最適作用溫度從50 ℃提高到55 ℃，提高了5 ℃，且pH值和溫度的作用范圍更廣，耐堿性和耐熱性更好。固定化PLA1的貯藏穩(wěn)定性也得到很大程度的提高。將固定化PLA1用于菜籽油脫膠實(shí)驗(yàn)，重復(fù)使用8 個(gè)批次后，仍保留81.1%的酶活力，表現(xiàn)出優(yōu)異的可重復(fù)使用性。

利用磁場(chǎng)，本實(shí)驗(yàn)制備的固定化PLA1極易從反應(yīng)體系分離與回收，且穩(wěn)定性好，操作簡(jiǎn)單，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。研究結(jié)果表明，環(huán)氧基修飾的磁性微球固定化酶是一種有效的生物催化劑，極具應(yīng)用潛力。