戶紅通, 徐達, 徐慶陽1,2,*,陳寧1,2,

1 (代謝控制發(fā)酵技術國家地方聯(lián)合工程實驗室，天津,300457) 2 (天津市氨基酸高效綠色制造工程實驗室，天津,300457) 3 (天津科技大學 生物工程學院，天津,300457)

在氨基酸、有機酸以及抗生素等的發(fā)酵法生產中，菌體細胞膜的通透性大小對其產量有一定的影響，這其中尤以谷氨酸的生產最為重要[1]。谷氨酸產量的高低與否，在很大程度上取決于菌體細胞膜通透性的大小[2]。本研究以“生物素亞適量”型菌株為研究對象，生物素亞適量型谷氨酸生產菌具有生長速度快、不易染菌等優(yōu)勢，但同時存在著菌體轉型周期長、產酸低的缺陷[3]。主要原因是細胞膜通透性低和相關酶活力過早下降。另外，從代謝途徑來看，由于生物素的限制作用，使得磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的活力下降，CO2固定反應減弱，菌體生長和產酸受到抑制；而如果生物素供應適量則菌體細胞膜的通透性將會極大降低，產酸將會嚴重下降。

超聲技術主要是利用超聲波能加速和控制化學反應，提高化學產率，改變反應歷程和改善反應條件[4-5]。超聲波作為一種聲波，它具有特殊的能量作用形式，當強度超過一定值時，會使媒質的狀態(tài)、組分、結構或功能發(fā)生變化，超聲波所引起的空化泡崩潰時，在極短時間和極小空間產生瞬時高溫和高壓[6-7]，并伴有強烈的沖擊波和微射流，使細胞的膜脂質雙分子層結構發(fā)生改變，細胞膜短時間內局部破裂，從而改變細胞膜通透性[8-11]。當超聲波應用于谷氨酸發(fā)酵時，它不僅能夠加快菌體的物質交換速率，提高酶促反應速率以及增強菌體代謝強度，從而縮短發(fā)酵時間，改善生物反應條件，更重要的是能夠較大提高細胞膜的通透性和選擇性，即使在生物素亞適量的條件下，也能進一步提高細胞膜通透性，菌體內的谷氨酸能得以及時分泌，并由此解除高濃度谷氨酸引起的反饋調節(jié)作用[12-14]。

因此，本研究將采用超聲輔助細胞轉型的谷氨酸發(fā)酵工藝，提高菌體細胞膜通透性，強化代謝途徑，實現(xiàn)谷氨酸高效生產[15]。本研究做到人為地改變細胞膜的通透性，這有利于代謝產物在細胞外的積累，使代謝按照人們希望的方向進行，是實現(xiàn)代謝人工調控的重要方法之一，具有實際的意義[16]。

1 材料與方法

1.1 菌種

生物素亞適量型高產菌株(谷氨酸棒狀桿菌GDK-168)，由天津科技大學代謝工程研究室保藏。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 活化斜面培養(yǎng)基

牛肉膏10.0 g/L，蛋白胨5.0 g/L，酵母粉5.0 g/L，KH2PO41.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，玉米漿20.0 mL/L，瓊脂25.0 g/L，pH 7.0。

1.2.2 種子培養(yǎng)基

口服葡萄糖25.0 g/L，玉米漿33.0 mL/L，豆餅水解液22.0 mL/L，K2HPO4·3H2O 2.2 g/L，MgSO4·7H2O 1.0 g/L，蛋氨酸2.0 g/L。

1.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基

口服葡萄糖80.0 g/L，Na2HPO4·12H2O 3.0 g/L，MgSO4·7H2O 1.8 g/L，KCl 1.7 g/L，蛋氨酸2.0 g/L，MnSO4·H2O 2.5 mg/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 2.5 mg/L，VB10.5 mg/L，糖蜜1.0 g/L，玉米漿4.0 mL/L，豆餅水解液20.0 mL/L。

1.3 主要儀器

LDZH-100KBS立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療機械廠；MCGS 5 L不銹鋼機械攪拌發(fā)酵罐、MCGS 30 L不銹鋼機械攪拌發(fā)酵罐：上海保興生物設備工程有限公司；超聲波發(fā)生器：邯鄲市海拓機械科技有限公司；SBA-40E生物傳感分析儀：山東省科學院生物研究所；LC-20A高效液相色譜儀：日本島津公司；A300氨基酸分析儀：德國安米諾西斯公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 超聲波輔助細胞轉型的谷氨酸發(fā)酵工藝

在發(fā)酵罐中插入耐高溫超聲波探頭，在發(fā)酵開始之前可以隨罐滅菌，在發(fā)酵開始后，打開超聲波控制器，在一定的條件下(本儀器固定功率500 W，頻率20 kHZ，可調節(jié)不同振幅)進行不同時間和間隔時間的超聲波處理，至發(fā)酵8 h停止超聲。具體超聲發(fā)酵裝置如圖1所示。

圖1 超聲輔助細胞轉型的谷氨酸發(fā)酵裝置圖

Fig.1 Ultrasonic assisted cell transformation of glutamic acid fermentation device

1.4.2 單因素試驗

(1)超聲時間對谷氨酸發(fā)酵的影響。在超聲振幅為70%，間隔時間為10 min的條件下，對不同超聲時間(30、40、50、60、70 s)進行研究，獲取最佳超聲時間。

(2)振幅對谷氨酸發(fā)酵的影響。在最佳超聲時間，間隔時間為10 min的條件下，對不同超聲振幅(55%、60%、65%、70%、75%)進行研究，獲得最佳超聲振幅。

(3)間隔時間對谷氨酸發(fā)酵的影響。在最佳超聲振幅，最佳超聲時間的條件下，對不同間隔時間(4、6、8、10、12 min)進行研究，確定最佳間隔時間。

1.4.3 正交試驗

在單因素試驗的基礎上確定實驗因素，超聲時間、超聲振幅和間隔時間的最佳值分別為50 s、65%和6 min。以OD值、谷氨酸產量和糖酸轉化率為考察指標，選用L9(34)正交試驗表設計3因素3水平正交試驗，對超聲輔谷氨酸發(fā)酵的關鍵影響因素進行研究。正交試驗因素水平見表1。

表1 超聲波輔助谷氨酸發(fā)酵正交試驗因素水平表

1.5 檢測分析方法

1.5.1 谷氨酸產量及發(fā)酵參數(shù)的測定

見參考文獻[17]和[18]。

1.5.2 有機酸及氨基酸的測定

使用高效液相色譜分析儀進行發(fā)酵液中有機酸的檢測，應用氨基酸分析儀測定發(fā)酵液中氨基酸的含量。

1.5.3 正交試驗數(shù)據(jù)分析

應用正交試驗設計助手對實驗結果進行極差和方差分析。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果分析

2.1.1 超聲時間對谷氨酸發(fā)酵的影響

在超聲振幅為70%，間隔時間為10 min的條件下，不同超聲時間對谷氨酸發(fā)酵的影響如圖2所示。

圖2 超聲時間對谷氨酸發(fā)酵的影響

Fig.2 Effect of ultrasound time on glutamic acid fermentation

可以看出隨著超聲時間的增加，OD值、谷氨酸產量和糖酸轉化率也呈現(xiàn)上升趨勢。當連續(xù)超聲時間超過50 s后，三者開始下降，尤其是谷氨酸產量快速降低。分析可知，適當時長的超聲處理可以加快菌體的酶活力，提高菌體生長速度和細胞膜的通透性，進而提高了谷氨酸的分泌和糖酸轉化率[19]。但是當連續(xù)超聲時間太長，勢必會對菌體造成一定程度的損傷，不但會降低菌體的生長和產酸速率，而且也會出現(xiàn)抑制作用。選擇最佳的超聲時間才能達到良好的效果，因此選取50 s作為連續(xù)超聲時間。

2.1.2 超聲振幅對谷氨酸發(fā)酵的影響

在超聲時間為50 s，間隔時間為10 min的條件下，不同超聲振幅對谷氨酸發(fā)酵的影響如圖3所示?？梢悦黠@的看出，在超聲振幅低于65%時，OD值、谷氨酸產量和糖酸轉化率不斷增加，超聲振幅高于65%后，三者明顯下降。分析可知，超聲振幅太低并不能提高菌體生長速度和產酸速率，而過高的超聲振幅會對菌體產生較大的損害，降低菌體活力，不利于菌體生長和谷氨酸合成。也因此選擇65%作為最佳超聲振幅。

圖3 超聲振幅對谷氨酸發(fā)酵的影響

Fig.3 Effect of ultrasonic amplitude on glutamic acid fermentation

2.1.3 間隔時間對谷氨酸發(fā)酵的影響

在超聲時間為50 s，超聲振幅為65%的條件下，不同超聲間隔時間對谷氨酸發(fā)酵的影響如圖4所示。從圖中可以看出，超聲時間間隔對OD值、谷氨酸產量和糖酸轉化率的影響是很明顯的。間隔時間(4 min)太短，也就是超聲強度較大，對菌體的損害比較嚴重，不但沒能促進菌體生長和谷氨酸分泌，反而有一定程度的抑制作用。隨著間隔時間(6 min)的增加，超聲強度適宜，OD值、谷氨酸產量和糖酸轉化率都得到了提升。而間隔時間過長時，雖然OD值的增長少許降低，但是對細胞膜的損傷效果太低，又由于菌體自身的細胞膜修復功能，因此細胞膜的通透性并未得到提高，因此谷氨酸產量和糖酸轉化率不斷下降。故選擇6 min作為最佳超聲間隔時間。

圖4 間隔時間對谷氨酸發(fā)酵的影響

Fig.4 Effect of interval time on glutamic acid fermentation

2.2 正交試驗結果分析

據(jù)表1所設計的正交試驗，其實驗結果見表2，方差分析見表3。

表2 超聲波輔助谷氨酸發(fā)酵正交試驗設計及結果

由正交試驗結果和極差(R)分析可知，對于OD值的影響次序為A>B>C，即超聲時間>振幅>間隔時間，最佳條件為A2B2C3，即超聲時間50 s、振幅65%、間隔時間7 min；對谷氨酸產量的影響次序為B>A>C，即振幅>超聲時間>間隔時間，最佳條件為A2B2C1，即超聲時間50 s、振幅65%、間隔時間5 min；對糖酸轉化率的影響次序為B>A>C，即振幅>超聲時間>間隔時間，最佳條件為A2B2C1，即超聲時間50 s、振幅65%、間隔時間5 min。另一方面，由方差分析可知，超聲時間和振幅不僅對OD值有顯著影響，而且對谷氨酸產量和糖酸轉化率也有顯著影響；而間隔時間只對OD值有影響顯著。綜合考慮以上實驗結果，在既滿足一定量OD值的同時，又能提高谷氨酸產量和糖酸轉化率，因此最佳超聲條件選擇A2B2C1，即超聲時間50 s、振幅65%、間隔時間5 min。

表3 方差分析

2.3 驗證實驗結果分析

依據(jù)正交試驗所得最佳超聲條件，進行3批次平行發(fā)酵驗證，所得試驗結果如圖5所示。

A-對照發(fā)酵的OD值；C-谷氨酸產量；E-糖酸轉化率;B-最佳超聲條件發(fā)酵的OD值;D-谷氨酸產量;F-糖酸轉化率

圖5 最佳超聲條件發(fā)酵與對照發(fā)酵的對比

Fig.5 Comparison between optimal ultrasonic condition fermentation and control fermentation

由圖5分析可知，無論是OD值，還是谷氨酸產量和糖酸轉化率，超聲發(fā)酵都比對照發(fā)酵有一定程度的提升。對照發(fā)酵的開始產酸時間(即谷氨酸菌體開始完成由谷氨酸非積累型菌體向谷氨酸積累型菌體的轉變)一般為4 h，而超聲發(fā)酵開始能夠檢測到谷氨酸的時間為2 h，并且產酸速率迅速上升。同時結合鏡檢發(fā)現(xiàn)，2 h時超聲發(fā)酵的部分谷氨酸菌體已經(jīng)拉長、膨大成為了產酸型菌體。因此，超聲發(fā)酵開始產酸的時間提前了2 h(如圖6所示)。

圖6 最佳超聲條件下發(fā)酵對菌體轉型時間和副產物的影響

Fig.6 Effect of optimal ultrasound conditions on bacterial transformation time and byproducts

超聲結束時間之所以選在發(fā)酵8 h，一方面是因為谷氨酸棒狀桿菌的細胞壁較厚，對細胞膜有一定的保護作用，超聲時間太短，并不能起到損傷細胞膜以提高通透性的作用；另一方面，菌體自身有一定的細胞膜修復功能，因此要有足夠的超聲時長。8 h鏡檢發(fā)現(xiàn)，幾乎所有菌體已完成谷氨酸分泌的轉型，不需要對細胞膜進行更多的損傷，同時OD值也即將達到最大值，菌體的活力即將達到最高，如果繼續(xù)進行超聲處理，勢必會對菌體造成嚴重損害，進而菌體活力也會下降，因此選擇8 h停止超聲處理。總的來看，超聲發(fā)酵的OD值為82.5，較對照發(fā)酵的72.5，提高了13.8%；谷氨酸產量為168 g/L，較對照發(fā)酵的151 g/L，提高了11.3%；糖酸轉化率為68.2%，較對照發(fā)酵的65.4%，提高了4.3%。

另一方面，由于菌體活力、谷氨酸產量的提高，溶解氧量的提高[20]，可知TCA循環(huán)的速率和通量也得到了提升，而由糖酵解所得的丙酮酸也會更多的進入三羧酸循環(huán)而不會過多積累[21-22]，因此由丙酮酸所產生的副產物乳酸和丙氨酸也分別由對照發(fā)酵的3.6、2.54 g/L降低至超聲發(fā)酵的2.3、1.75 g/L，如圖6所示。

3 結論

超聲輔助細胞轉型的谷氨酸發(fā)酵工藝，不但能夠加快菌體生長速率，提高菌體活力，提前完成菌體轉型，而且能進一步提高菌體細胞膜通透性，谷氨酸產量和糖酸轉化率。本研究通過單因素試驗和正交試驗確定了超聲輔助谷氨酸發(fā)酵的最佳條件為超聲時間50 s、振幅65%、間隔時間5 min，發(fā)酵開始進行超聲處理，至8 h結束。最終OD值提高13.8%，谷氨酸產量提高11.3%，糖酸轉化率提高4.3%。因此，可以說超聲波技術在谷氨酸發(fā)酵中的作用是明顯且有效的，它能夠進一步提高菌體細胞膜的通透性，加快谷氨酸分泌，實現(xiàn)了高效率發(fā)酵。