趙繼夢(mèng)，吳煥淦,，陸 嫄，顧沐恩，馬 喆，劉雅楠，鄭寒丹，劉慧榮,，馬曉芃,＊＊，黃 艷,＊＊

（1.上海中醫(yī)藥大學(xué)上海市針灸經(jīng)絡(luò)研究所 200030上海；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽(yáng)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 200437 上海）

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種慢性和復(fù)發(fā)性的炎癥性腸病，發(fā)病率逐年升高[1，2]，UC的持續(xù)治療至關(guān)重要，未經(jīng)治療的UC患者復(fù)發(fā)率高，長(zhǎng)期反復(fù)發(fā)作的結(jié)腸炎癥還有可能引起結(jié)腸炎相關(guān)性癌變[3，4]。盡管UC的發(fā)病機(jī)制尚未明確，但研究表明UC累及結(jié)腸上皮組織，激活黏膜及黏膜下層組織免疫細(xì)胞，產(chǎn)生過(guò)多的炎癥相關(guān)的細(xì)胞因子[5]。UC免疫的失調(diào)與COX-2、iNOS、NF-κB、STAT家族和AP-1等炎癥相關(guān)蛋白的上調(diào)密切相關(guān)[6，7]。核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB在UC免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[8]。在正常情況下，NF-κB作為一種核轉(zhuǎn)錄因子，在真核生物結(jié)腸上皮細(xì)胞中正常是RelA(p65)/p50二聚體形式，靜息狀態(tài)下NF-κB抑制因子α（IκB-α）和NF-κB形成復(fù)合體，存在細(xì)胞質(zhì)[9]。炎癥刺激致IκB蛋白被磷酸化、泛素化而水解，NF-κB轉(zhuǎn)入細(xì)胞核中與DNA特異性位點(diǎn)結(jié)合，調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄，如促炎癥反應(yīng)的酶和細(xì)胞因子COX2、IL-1β、IL-6及TNF-α[10]。據(jù)報(bào)道，STAT3與結(jié)腸的免疫炎癥密切相關(guān)，能激活大量的細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子[11，12]。活化的轉(zhuǎn)錄因子STAT3被磷酸化，轉(zhuǎn)入細(xì)胞核中能調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄，參與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期進(jìn)展與增殖和血管生成等生物學(xué)過(guò)程。NF-κB和STAT3之間還存在多種作用形式，未磷酸化的STAT3可直接取代NF-κB和IκB-α蛋白復(fù)合物中IκB-α的位置與RelA形成復(fù)合物，共同誘導(dǎo)基因的轉(zhuǎn)錄，STAT3增強(qiáng)NF-κB的活性并促使其向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移；另外，NF-κB和STAT3也有可能未形成復(fù)合物，共同作用于基因的相同的啟動(dòng)子區(qū)域，共同調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄[13，14]。研究發(fā)現(xiàn)，在DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎模型、活動(dòng)性、非活動(dòng)性UC患者結(jié)腸上皮組織固有層中，STAT3磷酸化水平均增加[15，16]。前期研究結(jié)果表明艾灸對(duì)UC患者有效[17-19]，其潛在的機(jī)制與抑制NF-κBp65有關(guān)，繼而抑制炎性細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)的合成和分泌，發(fā)揮免疫抗炎效應(yīng)[20-21]。因此，本研究從雙轉(zhuǎn)錄因子NF-κB、STAT的角度，探討艾灸對(duì)DSS誘導(dǎo)的UC大鼠結(jié)腸組織NF-κB信號(hào)通路、STAT3磷酸化的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組及UC模型制備[22]

健康成年雄性SD清潔型大鼠26只，體質(zhì)量200±20 g，由上海中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供[使用許可SYXK（滬）2012-0002]，動(dòng)物飼養(yǎng)溫度在20±2℃，濕度保持在50%-70%左右，12 h/12 h光照和黑暗交替，自由進(jìn)食和飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分成2組，正常大鼠8只和造模大鼠18只，每天稱量大鼠體重。18只造模大鼠連續(xù)自由飲用4%DSS（分子量：3.6-5萬(wàn)，MP Bio公司）水溶液7天，取2只大鼠進(jìn)行HE染色，通過(guò)組織病理學(xué)進(jìn)行模型鑒定。正常組（NC）8只，將造模成功的16只大鼠隨機(jī)分成UC組（UC）8只和隔藥灸組（HM）8只，自由飲用1%DSS水溶液7天維持。

1.2 艾灸干預(yù)措施

隔藥灸于造模結(jié)束后開(kāi)始，提前1天剔除腹部鼠毛。將藥粉（附子、肉桂、木香等）按比例用黃酒調(diào)制呈厚糊狀，用模具做成直徑1 cm、厚0.5 cm的藥餅。抓取大鼠并固定在自制大鼠固定器上，暴露雙側(cè)天樞穴，將配制好的藥餅置于穴位上，上置艾炷施灸，每壯艾炷大小約90 mg，每次每穴灸2壯，每日1次，連續(xù)灸7天。穴位定位參照余曙光主編《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》（人民衛(wèi)生出版社，2016年第二版）。正常組和模型組給予相同的抓取和固定。

1.3 HE染色

切片常規(guī)脫蠟至水：二甲苯Ⅰ、Ⅱ各20 min，梯度酒精無(wú)水-95%-90%-80%-70%乙醇各5 min，雙蒸水5 min×2次；蘇木素浸染5 min，自來(lái)水流水沖洗10 min，1%鹽酸酒精分化1-2 s，流水沖洗5 min，伊紅浸染5 min；脫水透明：依次浸入上行梯度酒精：70%-80%-90%-100%乙醇各2 s；二甲苯Ⅰ、Ⅱ透明各15 min；封片吹干后光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠結(jié)腸黏膜組織病理學(xué)變化。

1.4 ELISA檢測(cè)

取出-80℃保存的血清，融化后混勻離心，按照IL-1β、IL-6的ELISA試劑盒（上海源葉生物科技有限公司）的步驟操作，標(biāo)準(zhǔn)孔中依次加入標(biāo)準(zhǔn)品，每孔50 μL，除了空白孔外，樣本孔依次加入待測(cè)樣本各10 μL，再加入樣本稀釋液各40 μL并混勻。將HRP標(biāo)記的檢測(cè)抗體各100 μL加入標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中，空白孔不添加，置于37℃恒溫箱中溫育60 min；洗板5次，并在濾紙上充分印干。每孔依次加入底物A和B各50 μL，置于37℃恒溫箱中避光孵育15 min；每孔加入終止液50 μL。用全波段酶標(biāo)儀檢測(cè)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品換算出樣本的濃度。

1.5 Western Blot檢測(cè)

取出-80℃保存的結(jié)腸組織，勻漿后加RIPA裂解液冰上放置10 min，15000 rpm 10 min離心取上清；采用BCA蛋白定量法測(cè)定濃度，調(diào)整各樣本濃度一致變性后，經(jīng)電泳-轉(zhuǎn)膜-封閉后，分別加入一抗p-STAT3Tyr705（1:2000，CST美國(guó)）、STAT3、IκB-α、NF-κBp65、α-tubulin和GAPDH（1:1000，CST 美國(guó)）、pIκB-α（1:1000，Santa Cruz Biotechnology，美國(guó)）4℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜后，分別加入對(duì)應(yīng)的二抗（兔抗或鼠抗）室溫孵育1 h，凝膠成像系統(tǒng)拍攝條帶圖，使用Image Pro Plus軟件分析灰度值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件，所有計(jì)量資料均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（xˉ±s）表示，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用單因素方差分析比較組間差異，不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用非參數(shù)檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 各組大鼠結(jié)腸組織病理學(xué)變化

圖2 各組大鼠血清IL-1β和IL-6的蛋白濃度的比較

2 結(jié)果

2.1 隔藥灸對(duì)DSS誘導(dǎo)的UC大鼠的組織病理學(xué)觀察

正常組的結(jié)腸黏膜上皮完整，無(wú)潰瘍發(fā)生，各層組織結(jié)構(gòu)清晰，腺體排列整齊，黏膜層僅見(jiàn)少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，間質(zhì)無(wú)充血水腫；UC組的大鼠結(jié)腸黏膜上皮不完整，有潰瘍面，黏膜層腺體減少，杯狀細(xì)胞明顯減少，間質(zhì)中及黏膜下層見(jiàn)大量淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)；與UC組比較，隔藥灸組的大鼠結(jié)腸黏膜可見(jiàn)愈合性潰瘍，黏膜層腺體增加，杯狀細(xì)胞明顯增多，黏膜及黏膜下層可見(jiàn)少量淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)（圖1）。

2.2 隔藥灸對(duì)DSS誘導(dǎo)的UC大鼠血清IL-1β、IL-6蛋白濃度的影響

與正常組比較，UC組的大鼠血清IL-1β、IL-6蛋白濃度均顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）；與UC組比較，隔藥灸組大鼠血清IL-1β、IL-6蛋白濃度均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖2）。

2.3 隔藥灸對(duì)DSS誘導(dǎo)的UC結(jié)腸組織STAT3磷酸化和NF-κB通路蛋白表達(dá)的影響

與正常組比較，UC組結(jié)腸組織STAT3被磷酸化而激活；與UC組比較，隔藥灸組結(jié)腸組織p-STAT3磷酸化水平顯著降低（圖3）。

與正常組比較，UC組結(jié)腸組織NF-κB通路中磷酸化pIκB-α和NF-κB p65蛋白表達(dá)均顯著增加，IκB-α蛋白表達(dá)顯著降低；與UC組比較，隔藥灸組NF-κB p65和磷酸化pIκB-α蛋白表達(dá)均顯著降低，IκB-α蛋白表達(dá)顯著增加（圖3）。

3 討論

圖3 各組大鼠結(jié)腸組織STAT3磷酸化和NF-κB通路蛋白表達(dá)的比較

潰瘍性結(jié)腸炎臨床表現(xiàn)為腹瀉、腹痛及粘液膿血便等癥狀，病情持久難愈，且易反復(fù)發(fā)作，與克羅恩病共稱為炎癥性腸病。根據(jù)主癥，當(dāng)屬中醫(yī)學(xué)“腹瀉”、“便血”、“久瀉”、“久痢”、“腸癖”等病癥范疇。課題組前期采用灸補(bǔ)脾胃調(diào)和陰陽(yáng)法治療潰瘍性結(jié)腸炎，灸法常取隔藥灸，藥餅主要成分為附子、肉桂、丹參、紅花、木香等，有溫陽(yáng)散寒和行氣止痛的作用，主穴天樞穴是大腸之募穴，屬足陽(yáng)明胃經(jīng)，可疏調(diào)腸腑、理氣行滯、消食[22-24]，艾灸天樞穴可改善腸腑功能，緩解腸道功能失常而導(dǎo)致的各種證候，是腹部要穴[16，25，26]。前期研究表明，艾灸在臨床治療潰瘍性結(jié)腸炎患者中取得了顯著的療效，其作用機(jī)制與艾灸的抗炎免疫調(diào)節(jié)機(jī)制有關(guān)[21，27，28]。本研究采用 DSS誘導(dǎo)的UC，能很好復(fù)制潰瘍性結(jié)腸炎的癥狀，是UC機(jī)制研究中最常用的動(dòng)物模型，其血清中IL-6及IL-1β等促炎癥因子的蛋白濃度顯著上調(diào)，結(jié)腸組織HE染色觀察組織病理學(xué)，發(fā)現(xiàn)結(jié)腸上皮不完整，有潰瘍形成，黏膜和黏膜下層有明顯的炎癥反應(yīng)；采用隔藥灸干預(yù)UC大鼠，其結(jié)腸組織病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，隔藥灸能減輕UC大鼠的結(jié)腸炎癥，促進(jìn)腸黏膜上皮修復(fù)，杯狀細(xì)胞明顯增多，可降低UC大鼠血清異常增高的IL-6、IL-1β蛋白濃度，從而減輕腸道炎癥反應(yīng)，提示隔藥灸能緩解DSS誘導(dǎo)的UC大鼠結(jié)腸炎癥反應(yīng)，抑制結(jié)腸促炎癥性因子IL-6、IL-1β的釋放。

IBD患者結(jié)腸黏膜組織中明顯增加的促炎癥性因子（IL-6、IL-1β）受活化的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)（如STAT3和NF-κB）。在這項(xiàng)研究中，隔藥灸能抑制DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠中NF-κB和STAT3 Tyr705的活化和核轉(zhuǎn)位。大量研究表明，活化的STAT3和NF-κB能促進(jìn)細(xì)胞增殖和血管生成，并上調(diào)靶基因（如IL-6、IL-1β）的表達(dá)[9，10，29]。IL-6 的刺激可活化 STAT3 的組分，STAT3和NF-κB作用于基因的相同的啟動(dòng)子區(qū)域，共同調(diào)節(jié)相關(guān)細(xì)胞因子和趨化因子的 mRNA 轉(zhuǎn)錄[9，14，30，31]。UC大鼠結(jié)腸在炎癥刺激下，IκB-α發(fā)生磷酸化而水解，促NF-κB和轉(zhuǎn)入細(xì)胞核內(nèi)，與靶基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，上調(diào)相關(guān)靶基因，激活T輔助細(xì)胞免疫應(yīng)答，進(jìn)而參與炎癥反應(yīng)。據(jù)報(bào)道，STAT3可直接與p65和p50相互作用，促進(jìn)NF-κB募集至STAT3啟動(dòng)子，反之亦然。NF-κB的RelA的下游基因編碼的因子能激活STAT3通路；STAT3可通過(guò)募集p300組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶與RelA結(jié)合，干擾NF-κB和IκB-α復(fù)合物的形成，持續(xù)激活炎癥相關(guān)的基因[32]。STAT3和NF-κB之間的激活和串?dāng)_，通常是慢性炎癥作用的結(jié)果，特別是T輔助細(xì)胞。且NF-κB和STAT3通路已作為潰瘍性結(jié)腸炎的潛在治療靶點(diǎn)。本研究結(jié)果提示，STAT3 Tyr705的磷酸化與DSS誘導(dǎo)的小鼠的潰瘍性結(jié)腸炎有關(guān)，說(shuō)明STAT3活性依賴于酪氨酸磷酸化，而隔藥灸可降低UC結(jié)腸組織STAT3酪氨酸磷酸化水平。近期研究表明DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎癥與STAT3Tyr705密切相關(guān)，STAT3的絲氨酸磷酸化與JAK活性和STAT3酪氨酸磷酸化無(wú)關(guān)[7，33]。綜上所述，本研究結(jié)果提示，隔藥灸可能通過(guò)調(diào)節(jié)NF-κB信號(hào)通路和STAT3的激活，減少血清促炎癥因子IL-6、IL-1β的釋放，達(dá)到減輕DSS誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎癥反應(yīng)。該結(jié)果為臨床進(jìn)一步應(yīng)用隔藥灸治療潰瘍性結(jié)腸炎提供了客觀的科學(xué)依據(jù)。