于浩瀅，徐志超，閔偉紅，宋經元,3＊＊

（1.中國醫(yī)學科學院&北京協(xié)和醫(yī)學院藥用植物研究所，中藥資源教育部工程研究中心 北京 100193；2.吉林農業(yè)大學食品科學與工程學院 長春 130118；3.中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所云南分所 景洪 666100）

目前，全球干旱及半干旱地區(qū)占陸地總面積的3/1以上，干旱持續(xù)時間長，影響范圍廣，對農業(yè)及經濟產生不利影響[1，2]。對于藥用植物來說，干旱是所有自然災害中危害最大的一種，它對藥用植物的影響大于其它非生物脅迫的總和，影響中藥材的品質與資源[3，4]。藥用植物的品質由藥效活性成分的含量和外觀性狀決定[5]，受多方面因素的影響，如真菌、細菌、病毒等生物因素[6]，以及水分、溫度、鹽度、光照等非生物因素[7]，其中水分是最重要的影響因素之一。從生理生化方面已有研究證實不同程度的干旱脅迫能夠有效提高或抑制藥用植物活性成分的積累，但具體的分子機制研究薄弱。

本草基因組學將前沿組學技術引入中藥研究，加速了中藥現代化進程[8，9]。本草基因組學為發(fā)現藥用植物中與特定生理功能相關的新基因、預測未知基因以及理解基因表達調控機制提供重要信息，有助于從分子層面更系統(tǒng)地研究藥用植物品質與干旱脅迫之間的關系及其分子機制[10，11]。本文綜述了干旱脅迫對藥用植物藥效活性成分和生物量的影響，以及基于本草基因組學指導的干旱脅迫影響藥用植物品質的分子機制研究，為解決藥用植物品質資源問題提供參考。

1 干旱脅迫對藥用植物品質的影響

1.1 干旱脅迫影響藥用植物活性成分積累

中藥活性成分主要表現為藥用植物次生代謝產物（secondary metabolites）的積累[12]。次生代謝產物是植物為響應環(huán)境變化而產生的一類細胞生命活動或植物生長發(fā)育正常運行非必需的小分子有機化合物，主要包括生物堿、黃酮、萜類、酚類和皂苷等小分子有機化合物[13]。中藥活性成分具有多種功效，如抗氧化、消炎、抗癌等，其含量對中藥材的品質起決定作用[14]。植物對逆境的響應可以有效促進中藥活性成分的產生，更加有利于道地藥材的形成[15]。

近年來，研究證明干旱脅迫能夠提高多種藥用植物中活性成分的積累。有報道指出甘草（Glycyrrhiza uralensis）藥效活性成分與干旱脅迫顯著相關[16-20]，適當的干旱脅迫刺激甘草植物體內的糖代謝，促使甘草酸形成并積累[18]。梁[19]發(fā)現適當的干旱脅迫能夠引起甘草黃酮類化合物生物合成途徑的關鍵酶基因表達上調，促進甘草黃酮類化合物的積累。劉等[21]在研究土壤水分含量對于丹參（Salvia miltiorrhiza）幼苗生長及有效成分的影響時發(fā)現，輕度干旱（土壤含水量55%-60%）可提高丹參地上地下的生物量，對于丹參酮類物質如二氫丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA，以及丹酚酸B的合成與積累均有明顯上升，而土壤嚴重干旱和水分過多時，都會導致丹參藥材中丹參酮類化合物和丹酚酸B含量顯著下降，對活性成分的積累產生負作用。劉等[22]通過研究水分脅迫下黃芩（Scutellaria baicalensis）的部分生理生化特性發(fā)現中度干旱有利于其活性成分的合成，水分脅迫早期黃芩苷在莖葉中不斷上升，隨著脅迫程度增加急劇下降，而根系中的黃芩苷則隨脅迫加重持續(xù)增加。在干旱脅迫早期（0-21 d）有利于長春花(Catharanthus roseus)中文多靈、長春質堿、長春堿、長春新堿的積累，而干旱脅迫后期（28-35 d），4種生物堿含量降低[23]。梁等[24]對七葉一枝花（Paris polyphylla）研究時發(fā)現，根莖內總皂苷含量隨土壤水分含量的降低先增加后減少，當土壤含水量為12.44%時皂苷含量最高，達到11.95%。羅勒（Ocimum basilicum）中甲基樟腦、甲基丁香酚、β-月桂烯和α-香柏烯的含量也隨著干旱脅迫的加重而呈上升趨勢，且在土壤含水量為50%時活性成分積累最多[25]。水飛薊（Silybum marianum）活性成分水飛薊素隨著干旱脅迫程度的加重逐漸增多[26]。綜上所述，對于大多數藥用植物來說，輕度或是中度干旱脅迫可以增加活性成分的積累，而重度干旱脅迫一方面會對活性成分產生負面影響，另一方面還會對植物生長產生抑制作用[27]。因此，調節(jié)好藥用植物的干旱脅迫程度，能夠有效地增加其活性成分的含量，提升藥用植物的品質。

1.2 干旱脅迫影響藥用植物生物量

干旱脅迫通過改變藥用植物光合速率、滲透調節(jié)等影響其生長發(fā)育及外觀性狀，進而影響藥用植物的品質[28]。蒙古黃芪（Astragalus mongholicus）在適度干旱條件下根際細菌及放線菌增多，根際微生物群落結構組成發(fā)生改變，從而促進黃芪地上生物量的積累[29]。決明子（Cassia obtusifolia）和菘藍（Isatis indigotica）在干旱脅迫下植株的苗高降低，根冠比增加，生物量積累減少[30]。杠柳（Periploca sepium）在干旱脅迫下表現出生長速度緩慢、生物量累積明顯減少、根冠比顯著增大、產量降低等特點[31]。

干旱脅迫降低藥用植物光和效率，致使植物難以進行正常光合作用，造成生物量變化。在輕度干旱脅迫下，氣孔因素是光合速率下降的主要原因，而嚴重干旱脅迫下，葉綠體結構發(fā)生變化，使得光合色素含量下降，碳同化酶活性降低、膜脂過氧化加劇而產生超氧自由基等變化，從而導致光合速率下降[32-34]。王等[35]在探究干旱脅迫對藥用植物玉竹（Polygonatum odoratum）光合特性的影響時發(fā)現，干旱脅迫15天后玉竹氣孔關閉，蒸騰速率和凈光合速率急劇下降，在干旱脅迫35天后達到最低，超過35天可能致死。

藥用植物發(fā)生干旱脅迫時會產生滲透調節(jié)，以應對缺水的環(huán)境。滲透調節(jié)是植物應對干旱脅迫的重要生理機制，植物葉片可通過細胞溶質的凈積累來減小細胞的滲透勢，使植物在干旱脅迫時維持膨壓穩(wěn)定，保證與膨壓相關生理過程（如氣孔調節(jié)等）的進行，從而提高抗旱能力[36-38]。米槁（Cinnamomum migao）[39]葉片滲透物質會隨脅迫程度的加重而升高，說明米槁可以通過滲透調節(jié)維持細胞穩(wěn)定性應對干旱脅迫。隨著干旱脅迫程度加深，不同種源的文冠果（Xanthoceras sorbifolium）[40]幼苗葉片含水量降低，滲透調節(jié)物質含量增加；刺槐（Robinia pseudoacacia）、皂莢（Gleditsia sinensis）葉片的脯氨酸（proline）含量、可溶性糖含量均呈升高趨勢[41]。藥用植物響應干旱脅迫的機制之一是滲透調節(jié)，通過降低細胞內的滲透勢從外界吸收水分，維持膨壓穩(wěn)定，減少干旱對自身的傷害。

2 本草基因組學指導的干旱脅迫影響藥用植物品質的分子機制研究

基于高通量測序的藥用植物干旱脅迫組學研究有助于揭示藥用植物響應逆境信號保守及特異的分子機制，挖掘關聯(lián)藥材品質的分子標記序列，為抗旱品種選育奠定基礎。卷柏（Selaginella tamariscina），又稱“萬歲草”，為石松綱卷柏科卷柏屬植物，能夠在脫水95%以上的生理情況下生存且遇水復蘇。Xu等[42]通過比較基因組與轉錄組學分析揭示卷柏耐旱分子機制，采用單分子實時（SMRT）測序技術組裝卷柏基因組，注釋到27，761個蛋白質編碼基因，其中11%的蛋白編碼基因在脫水狀態(tài)下（50%RWC）顯著高表達?；蚪M進化分析發(fā)現卷柏PPR基因家族成員顯著擴張，且許多PPR基因在脫水狀態(tài)時顯著降低，表明其在葉綠體發(fā)育中的重要角色。研究發(fā)現卷柏獨特的葉綠體基因組結構，含有同向重復區(qū)、序列重排及NAD(P)H脫氫酶編碼基因（cp-ndh）缺失。徐等[43]基于卷柏全基因組分析卷柏耐旱相關AP2/ERF（APETALA2/ethylene responsive factor）轉錄因子基因家族，發(fā)現了包括7個DREB（dehydration responsive element binding protein）亞家族和6個ERF亞家族成員在內的17個基因與卷柏干旱及復水表型顯著正相關?；诘⒒蚪M解析丹參蛋白磷酸酶2C（2C protein phosphatase，PP2C）亞家族成員、基因結構以及差異表達圖譜，研究丹參PP2C基因的結構在不同組織部位的表達及逆境脅迫下的響應，為藥用植物生物或非生物脅迫研究提供依據[44]。

由于大多數藥用植物基因組研究仍為空白，近來的研究主要利用轉錄組學揭示其干旱響應的分子機制。張等[20]基于轉錄組測序對甘草干旱脅迫的研究發(fā)現，適度干旱脅迫抑制細胞壁中β-木糖苷酶、天冬酰胺酰內肽酶、GDP-L-巖藻糖合酶等酶的基因表達以及赤霉素、油菜素內酯等激素的生物合成和信號轉導，進而抑制地上莖的伸長；同時干旱脅迫促進萜類、黃酮類化合物生物合成關鍵酶基因的表達，進而促進甘草有效成分的積累；促進生長素、乙烯、細胞分裂素的生物合成和信號轉導，進而促進根的發(fā)生和細胞增殖；促進脫落酸、茉莉酸的生物合成和信號轉導，進而提高甘草對干旱脅迫的適應能力。Gechev等[45]通過轉錄組分析揭示了巴爾干苣苔（Haberlea rhodopensis）的干旱分子機制，在轉錄因子（NAC、NF-YA、MAD box、HSF、GRAS和WRKY）的誘導下，抑制光合作用和生長的相關基因可能作為遺傳重編程的主要開關，并且發(fā)現與糖代謝、信號傳導和編碼早期光誘導蛋白（early lightinduced proteins，ELIP）、晚期胚胎發(fā)育豐富蛋白（late embryogenesis abundant proteins，LEA）和熱休克蛋白（heat shock protein，HSP）的相關基因均上調表達。Vashisth等[46]研究干旱脅迫處理下黃花蒿的轉錄組信息，得到89，362個對照轉錄本和90，470個干旱脅迫的轉錄本，發(fā)現在干旱脅迫下青蒿素含量下降29.56%。應用轉錄組學相關技術研究的還有藥用植物廣寄生（Taxillusi chinensis），其中的熱休克蛋白（HSP）和核糖體蛋白可能在干旱脅迫的早期反應中起作用[47]。Zhou等[48]完成木棉（Bombax ceiba）的轉錄組測序，鑒定了干旱處理下59個上調1，000倍的差異表達基因，發(fā)現了AUX1、JAZ和psbS基因可以調節(jié)植物的生長、抵抗非生物脅迫以及參與光合作用過程。Mehta等[49]使用Illumina技術分別提取來自兩個不同發(fā)育階段的狹葉番瀉（Cassia angustifolia）RNA并測序，鑒定潛在的干旱脅迫相關轉錄本，為進一步研究狹葉番瀉的干旱適應性提供分子基礎。Qian等[50]對水芹（Oenanthe javanica）進行轉錄組測序和miRNA測序，注釋功能基因、開發(fā)SSR標記并分析其miRNA的潛在靶基因，驗證10種miRNA及其相應的靶基因在干旱脅迫下的表達，揭示miRNA響應干旱脅迫的調控作用。Janiak等[51]研究大麥（Hordeum vulgare）干旱脅迫下的轉錄組，揭示大麥干旱應激響應基因高表達，以及通過ABA、生長素、乙烯和油菜素類固醇之間的相互作用保持動態(tài)平衡，增加其耐旱性。

基于蛋白質組學揭示藥用植物響應干旱脅迫的分子機制也有一定的研究進展。付等[52]研究蒙古沙冬青（Ammopiptanthus mongolicus）葉片組織干旱脅迫下蛋白質組變化，發(fā)現蒙古沙冬青主要依靠葉綠體結構和光合作用的維持響應干旱脅迫。Kumar等[53]發(fā)現在過表達的轉基因煙草（Nicotiana tabacum）中谷胱甘肽（GSH）通過誘導脅迫相關基因和蛋白質如HSP70、查爾酮合酶、谷胱甘肽過氧化物酶、硫氧還蛋白過氧化物酶、ACC氧化酶和血紅素加氧酶I在抵御植物干旱脅迫中起重要作用。李等[54]研究抗旱性蠶豆（Vicia faba）幼苗的蛋白質組，證實下降表達的蛋白主要與脅迫防御、代謝和能量、細胞骨架以及氧化平衡有關，而上升表達的蛋白主要參與了蛋白折疊和光合系統(tǒng)。藥用植物響應干旱脅迫是一系列復雜的過程，本草基因組學的發(fā)展將促進干旱脅迫影響藥用植物品質的分子機制研究，推動耐旱優(yōu)良品種選育，指導中藥農業(yè)的生產。

3 藥用植物響應干旱脅迫的分子機制

3.1 活性氧的產生和清除分子機制

活性氧（reactive oxygen species，ROS）是植物體代謝產生含氧自由基和極易形成自由基的過氧化物的總稱，包括超氧自由基（O2·-）、過氧化氫（H2O2）和羥基自由基（·OH）等。干旱條件下，質膜上的NAD(P)H氧化酶（NOX）呼吸反應產生O2·-[55]，O2·-隨后形成H2O2，促進ROS產生及積累[56]，打破活性氧在體內含量的動態(tài)平衡，損傷細胞膜，對植物造成不可逆的傷害[57，58]。為減輕這種傷害，植物在長期進化過程中形成兩大保護系統(tǒng)來清除活性氧，即酶促和非酶促保護系統(tǒng)。酶促保護系統(tǒng)包括超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化物酶（peroxidase，POD）、抗壞血酸過氧化物酶(ascorbate peroxidase，APX)、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GPX）、過氧化氫酶（catalase，CAT）等；非酶保護系統(tǒng)包括ASA-抗壞血酸、GSH-谷胱甘肽、Cytf-細胞色素f、維生素E和類胡蘿卜素等[59]。SOD的主要功能是將O2·-歧化為H2O2，POD和CAT的作用是進一步清除H2O2生成水和氧氣，多種酶共同作用維持細胞內自由基的正常水平，減輕活性氧對植物造成的傷害[60]（圖1）。

圖1 推測的藥用植物響應干旱脅迫的分子機理

表1 基于本草基因組學的藥用植物干旱脅迫分子機制研究進展

干旱脅迫下藥用植物體內SOD、POD等保護酶活性與其抗脅迫能力呈正相關。金銀花（Lonicera japonica）[61]、黃芩[62]、鐵皮石斛（Dendrobium officinale）[63]等，在土壤干旱加重過程中，POD活性表現出先上升后下降的趨勢?？购敌詮姷钠贩N，其保護酶活性會保持在一定較高的程度且比較穩(wěn)定，而抗旱性較弱的品種其保護酶活性會表現出降低或先升高后降低的趨勢。當干旱脅迫進一步加重時，活性氧自由基會造成細胞膜膜脂過氧化，生成丙二醛（malondialdehyde，MDA）[64]，MDA濃度是判斷脅迫下藥用植物細胞膜脂過氧化程度的一個指標，它會隨著干旱作用時間延長而升高[65]。黃連（Coptis chinensis）[66]葉的MDA含量隨干旱時間的延長和強度的增加而上升，SOD、POD酶活性下降，CAT酶活性呈現先下降后上升的趨勢。甘草[67]在輕度干旱脅迫下，自身通過抗氧化酶類（SOD、CAT、POD等）活性的提高急時清除活性氧自由基，減輕傷害；在重度干旱脅迫下，活性氧代謝平衡被打破，造成活性氧不斷積累，致使膜脂過氧化加劇，對甘草造成不可逆的傷害[68]。隨著干旱脅迫的加重，蒲公英（Taraxacum mongolicum）[69]葉片中的超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）的活性顯著提高。藥用植物響應干旱脅迫，主要依靠酶促保護系統(tǒng)來清除大量積累的自由基，保持體內活性氧的平衡，以減輕干旱造成的傷害。

3.2 ABA信號轉導與調控機制

3.2.1 依賴ABA的傳導途徑

當植物遭受干旱脅迫時，感受器OSCA1（reduced hyperosmolality-induced calcium increase 1）接收到刺激信號[70]，由此產生的Ca2+信號可能激活蛋白激酶CPKs和CBLs-CIPKs，最終可能導致蔗糖非酵解型蛋白激酶（sucrose non-fermenting 1-related protein kinases 2，SnRK2）被激活，使ABA積累[71]。ABA可與脫落酸受體 PYR/PYL/RCAR（pyrabactinresistant/PYR-like/regulatory component of ABA，PYLs）蛋白家族結合[72]。而A型蛋白磷酸酶2C（PP2Cs）作為ABA的共受體，能夠使PYL與ABA的結合親和力增加近100倍[73]。ABA與PYLs結合后抑制PP2Cs，導致SnRK2.2/3/6/7/8被激活并磷酸化 SLAC1（slow anion channel-associated 1）、Rbohs（respiratoyrburst oxidasehomologs）等下游效應蛋白[74-77]。Rbohs磷酸化產生H2O2[78]。同時，ABA還可引發(fā)NO（一氧化氮）和PA（磷脂酸）的合成，NO導致SnRK2s失活[79]，繼而激發(fā)Ca2+信號和絲裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPK）等第二信使[80，81]，為中心的胞內信號轉換以及蛋白質磷酸化作信號轉導，通過調節(jié)蛋白與轉錄因子等特異結合，誘導下游基因的表達，從而使植物對干旱脅迫做出響應[82-84]（圖1）。外源ABA在適當濃度下的應用能夠促進甘草主要成分的積累。Qiao等[17]采用高效液相色譜法（HPLC）和酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）分別測定了栽培的烏拉爾甘草（2年生）中5種有效成分和7種內源激素的含量，證明ABA、玉米素核苷（ZR）和二氫玉米素核苷（DHZR）與活性成分的積累相關性高，外源ABA處理導致5種活性成分甘草甜素（I）、甘草素（II）、異甘草素（III）、甘草素（IV）和異甘草素（V）的含量顯著增加。

3.2.2 非依賴ABA傳導途徑

非依賴ABA傳導是指植物細胞膜上的感受器感受干旱脅迫刺激后，無需ABA傳導，直接影響第二信號系統(tǒng) Ca2+、三磷酸肌醇（inositol 1，4，5-triphosphate，IP3）進行磷酸化或去磷酸化反應傳遞信號，順式作用元 件 DRE/CRT（dehydration responsive element/CRepeat）與DREB、AP2、ERF、NAC等轉錄因子結合，誘導特定基因表達[85]，見圖1。CIP蛋白酶是干旱脅迫早期響應基因編碼的一種蛋白，在沒有ABA積累的情況下，干旱和高鹽脅迫可產生該蛋白的一個調節(jié)亞基，這說明干旱脅迫下存在不依賴ABA的途徑[86]。研究表明在無ABA信號轉導情況下，在擬南芥（Arabidopsis thaliana）中過表達ANAC019，ANAC055和ANAC072使其耐旱性顯著增加[87]。

3.3 藥用植物干旱脅迫響應基因

脯氨酸合成酶（pyrroline-5-carboxylate synthetase，P5CS）是一種合成脯氨酸的關鍵酶，Roxas等[88]將P5CS轉入煙草，使煙草內脯氨酸含量相對提高10-18倍，增強煙草的耐旱性。肌醇半乳糖苷合成酶（Gols1）是棉子糖代謝中的關鍵酶，Wang等[89]從牛耳草（Boea hygrometrica）中克隆Gols1基因，轉化到煙草中發(fā)現棉子糖含量增加，提高植物對干旱脅迫的適應能力。海藻糖作為耐旱應激標志性代謝產物，能夠有效提高植物的耐旱性狀。海藻糖合成相關基因TPS1、OtsAB、TPSP等通過遺傳轉化技術提高煙草（Nicotiana tabacum）、甘蔗（Saccharum officinarum）等植物的耐旱能力[90]。油脂蛋白（Oleosin）在高等植物種子中特異表達，具有貯藏能量的功能。Xu等[42]發(fā)現非種子維管植物卷柏的Oleosin蛋白家族顯著擴張，且5個Oleosin基因在脫水過程中顯著上調，復水后表達降低，證明其在卷柏耐旱及復蘇過程中發(fā)揮關鍵作用。胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白（LEA），是植物遭遇非生物脅迫時合成的一系列功能蛋白，與種子抗脫水有關，在種子發(fā)育后期的脫水階段大量積累，保護植物細胞減少干旱脅迫的損傷[91]。Ling等[92]對鐵皮石斛的研究中發(fā)現干旱脅迫下，DofLEAs基因在種子、原球莖、根、莖、葉、五種植物組織中均上調表達。何等[93]通過大豆轉基因實驗發(fā)現大豆LEA5基因可以提高植物抗干旱能力。植物早期光誘導蛋白（ELIP），可與葉綠素結合預防氧化損傷[94]，已經在水稻（Oryza sativa）、大豆（Glycine max）等多種植物中被鑒定[95]，在復活植物Craterostigma plantagineum[96]、牛耳草[97]和復活草Oropetium thomaeum[98]中，ELIP 基因家族均表現出顯著擴張，并且ELIP基因的表達在干旱脅迫下顯著增加。干旱脅迫顯著響應的耐旱功能蛋白的發(fā)現及鑒定，有助于理解藥用植物對干旱脅迫響應的分子機理，提高藥用植物的耐旱性。

4 結語

干旱是自然界中對藥用植物危害最大的非生物脅迫，對藥用植物的品質、生長發(fā)育和各項生理生化指標有重要影響。但適度干旱脅迫可提高藥用植物的品質，增加次生代謝產物的積累。植物響應干旱脅迫的分子機制研究主要集中在擬南芥、水稻等模式植物上，關于藥用植物的研究甚少，仍需進一步深入研究。藥用植物對干旱脅迫的響應不是單一因素作用，而是由植物激素調節(jié)系統(tǒng)、活性氧代謝系統(tǒng)、信號轉導途徑、基因表達調控等多種因素交叉融合，共同作用產生的復雜反應過程。藥用植物耐旱分子機制的研究也存在技術問題，主要限制因素為大多數藥用植物轉基因體系不成熟。我們提出以藥用模式植物為對象的研究思路，如丹參，由于其基因組較小、染色體數目少、世代周期短、組織培養(yǎng)和轉基因技術成熟，被認為是藥用植物功能基因研究理想的模式植物[99]?；诒静莼蚪M學方法篩選藥用模式植物保守或特異的耐旱相關基因，如參與ABA信號轉導途徑的關鍵酶基因等；通過遺傳轉化、代謝組學等技術揭示耐旱基因影響藥用植物品質的分子機制，如耐旱基因的過表達對藥用植物萜類、黃酮類或生物堿類等成分的影響；挖掘與藥用植物耐旱性狀密切關聯(lián)的分子標記。干旱脅迫影響藥用植物分子機制的研究將有助于耐旱優(yōu)良種質的選育，提升藥用植物品質，指導中藥農業(yè)生產。