李琪琳，胡元會(huì)，吳華芹，王 歡，孫 偉，王輝奇

（1.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院望京醫(yī)院 北京 100102；2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門(mén)醫(yī)院 北京 100053）

心力衰竭是一組常見(jiàn)的臨床綜合征，是大多數(shù)心血管疾病發(fā)展的最終歸宿。隨著現(xiàn)代人口老齡化進(jìn)程的加快和高血壓、冠心病等發(fā)病人數(shù)增多，心力衰竭發(fā)病率和病死率逐年上升，已成為人類(lèi)健康的重大挑戰(zhàn)之一[1]。心復(fù)康口服液是我們臨床治療心力衰竭的經(jīng)驗(yàn)方，該方由黃芪、人參、丹參、靈芝、紅花、淫羊藿、附子等中藥組成，具有益氣溫陽(yáng)、活血化瘀之功效。多年的臨床和實(shí)驗(yàn)研究表明，心復(fù)康口服液可保護(hù)心肌缺血性損害，改善臨床癥狀和心功能，提高患者的生活質(zhì)量[2，3]。線(xiàn)粒體蛋白質(zhì)組學(xué)是研究線(xiàn)粒體在生理、病理過(guò)程中的功能變化及其與疾病發(fā)生發(fā)展關(guān)系和機(jī)制的重要方法，目前已越來(lái)越受到醫(yī)學(xué)界的重視和廣泛關(guān)注。本實(shí)驗(yàn)采用雙向凝膠電泳和基質(zhì)輔助激光解吸離子質(zhì)譜技術(shù)，以心肌線(xiàn)粒體為切入點(diǎn)，研究心復(fù)康口服液對(duì)心力衰竭大鼠心肌線(xiàn)粒體蛋白質(zhì)組學(xué)的影響，探討其可能的作用機(jī)制，從而為心力衰竭的早期診斷、尋找新的治療靶點(diǎn)提供思路。

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

正常雄性SD大鼠30只（體質(zhì)量200±20 g），購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司（許可證號(hào)：SCXK(京)2012-0001），分籠飼養(yǎng)于中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門(mén)醫(yī)院SPF級(jí)動(dòng)物房。

表1 等點(diǎn)聚焦程序設(shè)置

1.2 主要儀器

彩色多普勒超聲顯像儀（型號(hào)：HP5500，美國(guó)PHILIPS公司）；動(dòng)物呼吸機(jī)（型號(hào)：HX-300S，成都泰盟科技有限公司）；多功能電泳系統(tǒng)（型號(hào)：MultiphorⅡ，美國(guó)Amersham公司）；垂直電泳槽（型號(hào)：ProteanⅡXi cell，美國(guó)Bio-Rad公司）；膠圖掃描儀（型號(hào)：Power Look 2100XL，美國(guó)UMAX公司）；質(zhì)譜儀（型號(hào)：4700 MALDITOF/TOF，美國(guó)AB SCIEX公司）；凝膠分析軟件（型號(hào)：Imagemaster2D，美國(guó)Amersham Biosciense公司）；凝膠成像分析系統(tǒng)（型號(hào)：Gel Doc XR+，美國(guó)Bio-Rad公司）。

1.3 主要試劑

固相PH梯度干膠條（pH=3-10，L=18 cm）、IPG緩沖液（pH=3-10，美國(guó)Bio-Rad公司）；CHAPS、溴酚藍(lán)、乙二胺四乙酸均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；十二烷基硫酸鈉、三羥甲基氨基甲烷、瓊脂糖均購(gòu)自美國(guó)Promega公司；考馬斯亮藍(lán)、標(biāo)準(zhǔn)蛋白標(biāo)志物均購(gòu)自美國(guó)Amersham pharmacia公司；乙腈、胰蛋白酶、甘氨酸均購(gòu)自美國(guó)Fisher公司；轉(zhuǎn)印膜（美國(guó)Millipore公司）；無(wú)水醋酸鈉、無(wú)水碳酸鈉、戊二醛、乙醇、冰醋酸等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.4 藥物

心復(fù)康口服液（主要成分為黃芪、人參、丹參、靈芝、紅花、淫羊藿、附子等，批號(hào)：20120312）。

1.5 抗體

一抗：Anti-GRP75 antibody、Anti-ATP5A antibody、Anti-Nucleophosmin antibody均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；二抗：羊抗小鼠、羊抗兔購(gòu)自北京中杉金橋公司。

2 方法

2.1 動(dòng)物模型

參照Pfeffer[2]報(bào)導(dǎo)的方法，結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支，制備心肌死后心衰大鼠模型，術(shù)后連續(xù)3天注射20萬(wàn)單位青霉素以抗感染。假手術(shù)組制備：僅在冠狀動(dòng)脈前降支起始點(diǎn)下約2-3 mm穿線(xiàn)而末結(jié)扎前降支，余步驟與動(dòng)物模型制備方法相同。

2.2 實(shí)驗(yàn)分組及給藥

分組：動(dòng)物購(gòu)回后喂養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)合成飼料，適應(yīng)性喂養(yǎng)5天，禁食12 h后，以體重均衡，隨機(jī)分為假手術(shù)組與造模組，假手術(shù)組8只，造模組22只。造模組大鼠按動(dòng)物模型復(fù)制方法所述方法造模，術(shù)后第2周對(duì)模型大鼠行超聲心動(dòng)檢測(cè)，以EF減損＞15%為入選模型組標(biāo)準(zhǔn)。將入選模型大鼠隨機(jī)分為模型組、心復(fù)康口服液組，每組大鼠不少于6只。給藥；①假手術(shù)組：生理鹽水4.0 mL·kg-1灌胃；②模型組：生理鹽水4.0 mL·kg-1灌胃；③Xinfukang口服液組：5.4 g·kg-1溶于生理鹽水灌胃。大鼠于分組后開(kāi)始灌胃給藥，連續(xù)給藥8周，每天1次。

2.3 心肌線(xiàn)粒體分離

采用差數(shù)離心法提取心肌線(xiàn)粒體。造模后第8周末，將大鼠麻醉后，開(kāi)胸迅速取出心臟。PBS緩沖液反復(fù)洗凈心臟，稱(chēng)取100 mg心肌，加入1.5 mL勻漿介質(zhì)，冰浴勻漿。4℃1 300 r·min-1離心15 min，保留上清，重復(fù)該步驟2次；取上清液于另一干凈離心管中，4℃17 000 r·min-1離心15 min，棄上清，沉淀用0.2 mL勻漿介質(zhì)懸浮，重復(fù)該步驟2次，棄上清，所得沉淀即為線(xiàn)粒體。

2.4 線(xiàn)粒體蛋白提取

于上述心肌線(xiàn)粒體樣品中加入1 mL裂解液，渦旋振蕩破碎，冰浴中靜置4 min以上，使蛋白樣品盡量溶解；4℃ 40 000 r·min-1離心1 h，棄沉淀，上清液即為提取的線(xiàn)粒體蛋白。采用Bradford法測(cè)蛋白含量，-80℃保存。

2.5 雙向凝膠電泳

取蛋白樣品0.8 mg，加泡脹緩沖液稀釋至350 μL，充分混勻；在泡脹盤(pán)泡脹槽一側(cè)加入上述樣品混合液，將膠條放入泡脹盤(pán)，水化12 h。水化完畢后，將膠條取出，于等點(diǎn)聚焦儀內(nèi)聚焦電泳，溫度設(shè)置為20℃（表1）。聚焦結(jié)束，將膠條取出，在平衡液I中平衡15 min，然后換平衡液II中平衡15 min。將平衡后的膠條放到SDS-PAGE凝膠上端，用0.5%的瓊脂糖封嚴(yán)，并將膠板固定于電泳槽內(nèi)。加入電泳緩沖液，接通電源，直至溴酚藍(lán)前沿距離凝膠底0.5 cm時(shí)停止電泳。每次同時(shí)運(yùn)行3個(gè)蛋白樣品，每個(gè)蛋白樣品重復(fù)雙向電泳3次，以確保結(jié)果的可重復(fù)性。電泳結(jié)束后，行考馬斯亮藍(lán)染色。

圖1 雙向凝膠電泳圖

2.6 圖像掃描與分析

染色后的凝膠通過(guò)UMAX PowerLook 2100XL掃描儀透射掃描獲取圖像。掃描完后，采用Imagemaster2D Platinum 5.0軟件對(duì)膠圖依次進(jìn)行蛋白點(diǎn)的檢測(cè)、背景扣除、匹配、標(biāo)準(zhǔn)化及人工校對(duì)處理，尋找差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)。

2.7 差異蛋白質(zhì)點(diǎn)的膠內(nèi)酶解

沿斑點(diǎn)染色邊緣將差異蛋白點(diǎn)切下，用NH4HCO3溶液脫色30 min，重復(fù)2-3次。脫色后的膠塊離心干燥20 min。干燥后加入6 mL胰蛋白酶液，4℃放置30 min，再加入20 mL胰酶覆蓋液，置于37℃水浴箱酶解20 h。在膠塊內(nèi)加入15 μL 5%TFA，37℃溫育30 min，吸取上清，然后加入15 μL 5%TFA/50%ACN，37℃溫育30 min，吸取上清與上一次吸取液合并，再加入15 μL 100%ACN，室溫靜置5 min，吸取上清與上兩次吸取液合并，離心干燥。用3 μL含0.5%TFA溶液溶解干燥好的肽段，即可用于質(zhì)譜分析。

2.8 質(zhì)譜分析及數(shù)據(jù)庫(kù)檢索

采用AB 4700型MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)。設(shè)定胰蛋白酶自切峰（MH+:2163.05Da）作為內(nèi)標(biāo)進(jìn)行校正，用l mL標(biāo)準(zhǔn)品與基質(zhì)混合肽作為外標(biāo)進(jìn)行校正，獲得相應(yīng)的肽質(zhì)量指紋圖（PMF）。根據(jù)質(zhì)荷比（M/Z）通過(guò)Mascot軟件在線(xiàn)檢索SwissProt蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.matrixscience.com）以確定鑒定結(jié)果。

2.9 Western blot驗(yàn)證

采用差數(shù)離心法提取大鼠心肌線(xiàn)粒體蛋白。取蛋白樣品50 μg，加入等體積樣品緩沖液，混勻，100℃變性5 min；12%SDS-PAGE電泳，結(jié)束后半干轉(zhuǎn)至PVDF膜。搖床上封閉2 h；雜交一抗，4℃過(guò)夜，洗膜，雜交二抗，室溫?fù)u床上2 h，洗膜。用ECL發(fā)光劑浸膜5 min，取出后置曝光匣中曝光。掃描曝光片后，應(yīng)用Gel Doc凝膠成像系統(tǒng)分析底片的目的條帶。

2.10 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)獲得的各計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（xˉ±s）表示。模型組與假手術(shù)組、給藥組與模型組灰度值相比大于2或小于0.5的蛋白點(diǎn)定義為差異蛋白點(diǎn)，其中大于2為表達(dá)上調(diào)，小于0.5為表達(dá)下調(diào)。PMF圖譜分析以Mascot Score得分＞55為鑒定成功蛋白。

3 結(jié)果

3.1 雙向凝膠電泳結(jié)果分析

各組雙向凝膠電泳圖譜如圖1所示。圖像經(jīng)Imagemaster軟件分析，假手術(shù)組可分辨蛋白點(diǎn)為698±35，模型組為712±42，心復(fù)康口服液組為677±52，雙向電泳各組重復(fù)3次，每組分別將其中的一塊分辨率高、質(zhì)量好的凝膠定為參考膠，進(jìn)行組內(nèi)3塊膠間的蛋白質(zhì)點(diǎn)匹配，發(fā)現(xiàn)樣品重復(fù)性好，制備穩(wěn)定，可用于差異蛋白質(zhì)點(diǎn)的分析。

3.2 差異蛋白點(diǎn)質(zhì)譜鑒定結(jié)果

圖2 459號(hào)點(diǎn)PMF圖

表2 13個(gè)鑒定成功蛋白

模型組與假手術(shù)組相比有差異而心復(fù)康口服液可使差異趨勢(shì)逆轉(zhuǎn)的蛋白點(diǎn)為20個(gè)，對(duì)這20個(gè)蛋白點(diǎn)進(jìn)行了MALDI-TOF-MS分析，獲得20張PMF圖譜（圖2為459號(hào)點(diǎn)PMF圖），PMF圖譜數(shù)據(jù)經(jīng)SwissProt數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，成功鑒定出13個(gè)蛋白（表2）。其中心復(fù)康口服液上調(diào)的蛋白為鳥(niǎo)氨酸轉(zhuǎn)氨酶（Ornithine aminotransferase）、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶P（Glutathione S-transferase P）、谷氨酸脫氫酶（Glutamate dehydrogenase）、3-磷酸甘油脫氫酶（Glycerol-3-phosphate dehydrogenase）、ATP合成酶α亞基(ATP synthase subunit alpha)、磷酸丙糖異構(gòu)酶（Triosephosphate isomerase）、α-烯醇酶（Alpha-enolase）、丙酮酸激酶同工酶M1/M2(Pyruvate kinase isozymes M1/M2)，下調(diào)的蛋白為線(xiàn)粒體應(yīng)激蛋白70（Stress-70 protein）、微管蛋白β-5(Tubulin beta-5)、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（78 kDa glucose-regulated protein）、核仁磷酸蛋白（Nucleophosmin）、核內(nèi)不均一核糖核蛋白 A2/B1（Heterogeneous nuclear ribonucleoproteins A2/B1）。根據(jù)功能分類(lèi)和生物學(xué)分析，這13個(gè)蛋白主要與能量代謝、應(yīng)激反應(yīng)、氧化損傷、細(xì)胞骨架、細(xì)胞分化增殖等功能相關(guān)。

3.3 部分差異蛋白回復(fù)性驗(yàn)證結(jié)果

與假手術(shù)組相比，模型組Stress-70、Nucleophosmin表達(dá)明顯升高，ATP-α表達(dá)明顯降低；與模型組相比，心復(fù)康口服液組Stress-70、Nucleophosmin表達(dá)明顯降低，ATP-α表達(dá)明顯升高（圖3）。

4 討論

心力衰竭是各種心臟病的終末階段，其高患病率和高死亡率已儼然成為人類(lèi)共同面對(duì)的一個(gè)公共健康問(wèn)題。研究發(fā)現(xiàn)，無(wú)論心衰的基礎(chǔ)原因是血流動(dòng)力學(xué)異常、神經(jīng)體液激素過(guò)度激活、功能性心肌喪失還是瓣膜異常等，均伴有線(xiàn)粒體結(jié)構(gòu)和功能的改變[5-7]。因此，深入線(xiàn)粒體蛋白質(zhì)組學(xué)研究對(duì)闡明心衰病理生理機(jī)制、發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)具有舉足輕重的意義。

中醫(yī)認(rèn)為心力衰竭的基本病機(jī)為氣虛陽(yáng)虧、血瘀水停，以益氣溫陽(yáng)、活血利水為其主要治法。心復(fù)康口服液是我們臨床治療氣虛血瘀型心衰經(jīng)驗(yàn)方，該方由黃芪、人參、淫羊藿、靈芝、丹參、當(dāng)歸、川芎等中藥組成，組方以益氣溫陽(yáng)、活血化瘀為主，兼有利水消腫之功。既往實(shí)驗(yàn)研究中，通過(guò)建立不同動(dòng)物模型，證實(shí)了心復(fù)康口服液對(duì)各種心肌損傷及心力衰竭模型具有鈣拮抗、保護(hù)缺血心肌等藥理作用，為其臨床治療心力衰竭提供了切實(shí)依據(jù)[8]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型組與假手術(shù)組相比有差異而心復(fù)康口服液可使差異趨勢(shì)逆轉(zhuǎn)的蛋白點(diǎn)共有20個(gè)，經(jīng)質(zhì)譜分析成功鑒定出13個(gè)蛋白，其中7個(gè)與能量代謝相關(guān)，2個(gè)與應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)，1個(gè)與氧化損傷相關(guān)，1個(gè)與細(xì)胞骨架相關(guān)，2個(gè)與細(xì)胞分裂增殖相關(guān)。具體分述如下：

4.1 與能量代謝相關(guān)蛋白

心力衰竭時(shí)，心肌缺血缺氧，心肌能量代謝模式發(fā)生改變，表現(xiàn)為脂肪酸有氧氧化降低，氧化磷酸化減弱，葡萄糖無(wú)氧酵解增強(qiáng)，ATP生成總量明顯下降[9，10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組參與氧化磷酸化的關(guān)鍵酶ATP-α亞基表達(dá)下調(diào)，經(jīng)過(guò)心復(fù)康口服液治療后ATP-α亞基表達(dá)上調(diào)，說(shuō)明心復(fù)康口服液可使受損心肌氧化磷酸化得到保護(hù)，在一定程度上糾正心肌能量代謝障礙。既往研究也證實(shí)，心復(fù)康口服液可上調(diào)心肌梗死后心衰大鼠心肌細(xì)胞GLUT1mRNA表達(dá)，增加心肌組織中ATP含量[11，12]，這與本研究結(jié)果有類(lèi)似之處。同時(shí)，我們也發(fā)現(xiàn)參與糖酵解的關(guān)鍵酶丙酮酸激酶同工酶M1/M2、3-磷酸甘油脫氫酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶、α-烯醇酶在中藥組表達(dá)上調(diào)，考慮其原因可能是心復(fù)康口服液一定程度上增強(qiáng)了心肌細(xì)胞糖酵解作用，以代償性彌補(bǔ)ATP生成不足。

此外，本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)中藥組鳥(niǎo)氨酸轉(zhuǎn)氨酶和谷氨酸脫氫酶表達(dá)上調(diào)，說(shuō)明心復(fù)康口服液可調(diào)節(jié)模型動(dòng)物氨基酸代謝失衡，并最終改善心肌能量代謝。

圖3 Western blot驗(yàn)證結(jié)果

4.2 與應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)蛋白

結(jié)扎冠狀動(dòng)脈致心梗后心衰，可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)，介導(dǎo)細(xì)胞凋亡，加速心衰的發(fā)生發(fā)展[13，14]。應(yīng)激蛋白70家族又名熱休克蛋白70家族（HSP70），在防止應(yīng)激引起的細(xì)胞損害或修復(fù)受損細(xì)胞方面發(fā)揮著重要作用。有研究示，HSP70血漿濃度越高，心力衰竭越嚴(yán)重[15]。葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（GRP78）屬HSP70家族，目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者一致認(rèn)為GRP78表達(dá)上調(diào)是ERS反應(yīng)的開(kāi)始[16，17]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組應(yīng)激蛋白70、GRP78較假手術(shù)組表達(dá)上調(diào)，中藥干預(yù)后兩者表達(dá)下調(diào)，提示心復(fù)康口服液可減輕模型動(dòng)物出現(xiàn)的應(yīng)激反應(yīng)，使受損心肌得到保護(hù)，但其作用機(jī)理有待明確。

4.3 與氧化損傷相關(guān)蛋白

研究發(fā)現(xiàn)，心力衰竭動(dòng)物模型中氧自由基明顯增加，抗氧化系統(tǒng)受損，過(guò)多的活性氧產(chǎn)生導(dǎo)致鈣超載。當(dāng)氧自由基生成過(guò)多或抗氧自由基物質(zhì)活性降低，引起氧自由基堆積，導(dǎo)致氧化損傷[18]。谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST)是谷胱甘肽結(jié)合反應(yīng)的關(guān)鍵酶，具有清除自由基、抗氧化的作用。GSTP是GST家族中的成員之一，本實(shí)驗(yàn)中，模型組GSTP表達(dá)下調(diào)，經(jīng)中藥治療后表達(dá)上調(diào)，表明心復(fù)康口服液可減輕模型動(dòng)物氧化損傷，提高心肌抗氧化能力，推測(cè)其機(jī)理可能與心復(fù)康口服液通過(guò)增加GSTP的表達(dá)，間接性的起到清除自由基作用有關(guān)。

4.4 與細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白

微管蛋白是細(xì)胞骨架的重要組成成分。研究發(fā)現(xiàn)，微管蛋白在缺血缺氧后10 min即可出現(xiàn)明顯改變，2 h內(nèi)幾乎已經(jīng)完全破壞，表現(xiàn)為絲狀結(jié)構(gòu)的破壞及熒光強(qiáng)度的減弱[19，20]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)心復(fù)康口服液治療后，模型組上調(diào)的微管蛋白β-5出現(xiàn)下調(diào)，提示心復(fù)康口服液在一定程度上可保護(hù)細(xì)胞骨架免于受損裂解。此前，有學(xué)者應(yīng)用電鏡硝酸鑭電子示蹤技術(shù)證實(shí)了心復(fù)康口服液能夠保護(hù)心肌細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)，減輕心肌膜通透性改變[21]，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相吻合。

4.5 與細(xì)胞分化增殖相關(guān)蛋白

核內(nèi)不均一核糖核蛋白A2/B1(hnRNPA2/B1)是一種重要的RNA連接蛋白，與細(xì)胞有絲分裂、成熟、分化及凋亡的調(diào)節(jié)相關(guān)。核仁磷酸蛋白（NPM）是一種多功能核仁磷酸化蛋白，參與核糖體前體運(yùn)輸和合成、中心體的復(fù)制、有絲分裂、DNA修補(bǔ)以及應(yīng)激反應(yīng)等生命活動(dòng)，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的增殖發(fā)育等。研究發(fā)現(xiàn)，以上兩種蛋白與腫瘤等增殖性疾病的發(fā)病密切相關(guān)[22，23]，但與心血管疾病關(guān)系鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組hnRNPA2/B1和NPM表達(dá)均上調(diào)，中藥組兩者均下調(diào)，推測(cè)心復(fù)康口服液可能參與了調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞分化增殖、減緩細(xì)胞凋亡、修復(fù)損傷心肌，但其具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

本實(shí)驗(yàn)采用Western blot技術(shù)，從蛋白水平驗(yàn)證線(xiàn)粒體Stress-70、ATP-α、Nucleophosmin在各組的表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型組Stress-70、NPM表達(dá)上調(diào)，ATP-α表達(dá)下調(diào)，心復(fù)康口服液組Stress-70、NPM表達(dá)下調(diào)，ATP-α表達(dá)上調(diào)。此結(jié)果與蛋白質(zhì)組學(xué)變化趨勢(shì)一致，提示采用雙向凝膠電泳和基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)，以心肌線(xiàn)粒體為切入點(diǎn)，研究心復(fù)康口服液對(duì)心衰大鼠心肌線(xiàn)粒體蛋白質(zhì)組學(xué)的影響，結(jié)果真實(shí)可靠。