顧潔，王玉霞，高娟，袁勝男，初雅婧，李妍涵，袁衛(wèi)平，汪曉敏

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 血液學(xué)研究所 血液病醫(yī)院 實驗血液學(xué)國家重點實驗室，天津 300020

DNA的甲基化修飾是基因表達調(diào)控的重要環(huán)節(jié)，腫瘤細(xì)胞往往表現(xiàn)為典型的DNA高甲基化，尤其是胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤 (CpG) 啟動子區(qū)域腫瘤抑制基因的高甲基化[1-2]。腫瘤抑制基因的高甲基化通過改變?nèi)旧|(zhì)狀態(tài)，招募輔助活化因子或抑制因子，使基因轉(zhuǎn)錄活化受到抑制，導(dǎo)致腫瘤抑制基因表達沉默。TET蛋白屬于依賴酮戊二酸和亞鐵離子的雙加氧酶，其催化5-甲基胞嘧啶(5-mC) 轉(zhuǎn)化為5-羥甲基胞嘧啶 (5-hmC)，并進一步轉(zhuǎn)化為5-甲酰胞嘧啶 (5-fC) 和5-羧基胞嘧啶(5-caC)，在胚胎發(fā)育和基因重新編碼等過程中都起著重要作用[3-5]。對染色體4q24最小區(qū)域雜合性缺失和微缺失的篩查顯示，骨髓增殖性腫瘤(Myeloproliferative neoplasms，MPN)和 MDS(Myelodysplastic syndrome，MDS) 患者中往往存在TET2缺失和失活性突變[6-7]。TET2突變在MPN和MDS中的發(fā)生率為10%-20%，在急性髓細(xì)胞白血病 (Acute myeloid leukemia，AML) 中為7%-23%[8]。5-hmC可阻止甲基化DNA與相關(guān)蛋白的結(jié)合，進而抑制其轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生沉默作用。對胚胎干細(xì)胞的研究表明，5-hmC富集在靠近轉(zhuǎn)錄起始點和基因內(nèi)的CpG二核苷酸區(qū)，且5-hmC在這些調(diào)控區(qū)域的富集均與基因表達增強有關(guān)[9]。研究發(fā)現(xiàn)，在MDS和慢性粒單核細(xì)胞白血病(Chronic myelomonocytic leukaemia，CMML) 中，TET2突變可發(fā)生在包括造血干細(xì)胞的CD34+細(xì)胞，且有些患者同時存在多個TET2突變點，提示TET2突變可導(dǎo)致早期干細(xì)胞獲得克隆性生長優(yōu)勢[10-11]。

既往研究大多局限于造血細(xì)胞TET2異常導(dǎo)致的造血改變及其臨床意義，而TET2是否具有調(diào)控MSC生物學(xué)特性及其造血支持能力的作用，目前仍不清楚。在本研究中，我們獲取Tet2敲除小鼠 (Tet2-/-) 和正常小鼠 (WT) 骨髓MSC，通過比較研究，闡述Tet2基因調(diào)控MSC的生物學(xué)能力的作用及其可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料

胎牛血清 (Gibco公司)，CCK-8 (DojinDo Laboratories公司)，Spectra Max M5 Microplate Reader(Molecular Devices公司)，細(xì)胞培養(yǎng)箱 (Thermo公司)。

Tet2基因全身敲除小鼠購于The Jackson Laboratory (https://www.jax.org/strain/023359)，貨號為023359。

1.2 方法

1.2.1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離和培養(yǎng)

取Tet2-/-小鼠雙下肢股骨和脛骨，沖出骨髓細(xì)胞，將骨髓細(xì)胞用2 mL HBSS緩沖液洗滌2遍(槍尖吹勻)，1500 r/min離心6 min，將骨髓細(xì)胞均勻平鋪于10 cm培養(yǎng)皿中，10%胎牛血清IMDM培養(yǎng)1周。1周后可見間充質(zhì)干細(xì)胞呈現(xiàn)克隆樣生長。去除培養(yǎng)基，換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。每隔3–4 d待細(xì)胞長滿后分瓶傳代。

1.2.2 細(xì)胞增殖實驗

收集對數(shù)生長期細(xì)胞，計數(shù)，用完全培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至合適濃度，接種96孔板，每孔加100 μL細(xì)胞懸液。細(xì)胞在37 ℃、100%相對濕度，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1-7 d。每天取一個培養(yǎng)板，加入含10% CCK-8的完全培養(yǎng)基置于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育3 h。輕輕振蕩后在Spectra Max M5 Microplate Reader上測定450 nm波長處的吸光度。繪制生長曲線。

1.2.3 長周期培養(yǎng)-起始細(xì)胞實驗

于96孔板接種MSC，每組3個重復(fù)孔，每孔加100 μL培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)。待MSC融合率達到80%，照射20 Gray，在33 ℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)1 d。加入造血干細(xì)胞，每孔細(xì)胞數(shù)為500，培養(yǎng)基體積為每孔150 μL。加入Stem cell公司的5300長周期培養(yǎng)基150 μL。在33 ℃、5% CO2的孵箱中培養(yǎng)5周，每周半量換液。4周或5周后計數(shù)鵝卵石狀克隆，細(xì)胞數(shù)大于5為一個克隆。

1.2.4 點雜交方法檢測基因組甲基化水平

提取細(xì)胞基因組DNA，超聲破碎至合適大小。硝酸纖維素膜先用蒸餾水稍微浸濕，并用20×SSC使其飽和。將膜放在經(jīng)20×SSC預(yù)飽和過的濾紙上。以5 μL的DNA分裝樣品在濾膜上點樣。將濾膜放在一張干燥的濾紙晾干，以5×SSC漂洗5 min。將硝酸纖維素膜置80 ℃真空烤爐2 h。將DNA面用紫外線 (280 mn) 照射3-5 min，這時的濾膜已可用于雜交。預(yù)雜交液過夜封閉醋酸纖維素膜。加入anti-5-hmC或者anti-5-mC探針4 ℃過夜孵育。加入HRP結(jié)合的二抗1-2 h?；瘜W(xué)顯色。

1.2.5 全基因組DNA甲基化測序和數(shù)據(jù)分析

利用hME-Seal方法從細(xì)胞中獲得100-500 bp大小的DNA片段[12-13]。利用Illumina公司的甲基化芯片進行測序，并建立細(xì)胞甲基化數(shù)據(jù)庫(NEBNext?ChIP-Seq Library Prep Reagent Set for Illumina)。數(shù)據(jù)解讀參考2011年Szulwach和Yao等的研究方法[14-17]。

1.2.6 統(tǒng)計學(xué)分析

按下式計算藥物對腫瘤細(xì)胞生長的抑制率，并采用分析軟件 Graph Pad Prism 5.0擬合IC50曲線和計算IC50值。細(xì)胞生長抑制率(%)=[(Ac–As)/(Ac–Ab)]×100%。As: 樣品的OA (細(xì)胞+CCK-8+待測化合物)，Ac: 陰性對照的 OA (細(xì)胞+CCK-8+DMSO)，Ab: 陽性對照的OA (培養(yǎng)基+CCK-8+DMSO)。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.005，****P<0.001。

2 結(jié)果與分析

2.1 Tet2敲除的骨髓MSC生長狀態(tài)良好

取Tet2-/-小鼠四肢骨，獲得骨髓細(xì)胞，培養(yǎng)骨髓細(xì)胞1周后，消化傳代1次，繼續(xù)培養(yǎng)1周，貼壁的細(xì)胞為骨髓來源的Tet2-/-MSC。我們檢測了Tet2在Tet2-/-MSC和WT-MSC中的表達，發(fā)現(xiàn)在Tet2-/-MSC細(xì)胞中Tet2幾乎不表達 (圖1)。鏡下觀察Tet2-/-MSC形態(tài)，細(xì)胞形態(tài)均一，呈長梭形，擴增速度快，克隆形成能力強，體外培養(yǎng)1至2周可傳代。傳代后細(xì)胞生長速度明顯加快，12 h內(nèi)完全貼壁、伸展，重新變?yōu)殚L梭形，培養(yǎng)4-7 d即達到完全融合。在倒置顯微鏡下，細(xì)胞為梭形，胞漿豐富，核染色質(zhì)細(xì)，核仁明顯，呈平行排列或旋渦樣生長 (圖2)。

2.2 Tet2敲除的骨髓MSC細(xì)胞周期加快，細(xì)胞擴增時間縮短

骨髓MSC在體外的增殖能力較強，但隨著傳代次數(shù)增加，其增殖速率及總體擴增倍數(shù)基本保持一致。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，Tet2敲除可加速MSC生長。我們檢測了Tet2-/-MSC細(xì)胞的生長周期，發(fā)現(xiàn)在血清刺激24 h和48 h后，Tet2-/-MSC處于S期的細(xì)胞比例明顯高于WT-MSC (圖2A)。此外，根據(jù)細(xì)胞生長曲線 (圖2B)，Tet2-/-MSC細(xì)胞倍增時間 (32.8 h±4.8 h) 明顯低于WT-MSC (49.4 h±5.3 h)，且隨著傳代次數(shù)增加，細(xì)胞倍增時間并不發(fā)生改變 (圖2C)。上述結(jié)果提示Tet2-/-MSC增殖能力明顯強于WT-MSC。

2.3 Tet2敲除的骨髓MSC在多次傳代后仍然有很強的造血支持作用

圖1 Tet2缺失的骨髓MSCFig.1 Tet2-/- MSC from BM.(A) Relative expression of Tet2 in Tet2-/- MSC.(B) Tet2-/- MSCs are spindle shaped, with rich cytoplasm, fine chromatin and obvious nucleolus.

圖2 Tet2缺失導(dǎo)致MSC增殖能力的加快Fig.2 Tet2-/- deletion increased MSCs proliferation.(A) Cell cycle study with PI staining.(B) Cell growth curve.(C)The amplification time of MSCs with different passages.*P<0.05.

為了評估Tet2基因是否影響MSC支持造血的能力，骨髓造血祖細(xì)胞細(xì)胞被接種于照射過的Tet2-/-MSC和WT-MSC中，在長期骨髓培養(yǎng)基中培養(yǎng)4周后檢測鵝卵石區(qū)形成細(xì)胞 (Cobblestone area forming cell，CAFC) 的生成情況。如圖3所示，Tet2-/-MSC和WT-MSC具有支持造血干細(xì)胞克隆形成能力(CAFC)，但是Tet2-/-MSC支持CAFC的能力明顯優(yōu)于WT-MSC (P≤0.01) (圖3A,C,D)。將CAFC進行集落培養(yǎng)，培養(yǎng)一周后發(fā)現(xiàn)粒系集落生成單位 (CFU-GM) 在Tet2-/-MSC組的數(shù)量要明顯高于WT MSC (P≤0.01) (圖3B)。MSC支持造血能力隨著細(xì)胞傳代并不發(fā)生改變。上述結(jié)果提示Tet2-/-MSC支持造血能力增強。

圖3 Tet2敲除導(dǎo)致MSC支持造血能力的增強Fig.3 Tet2-/- deletion enhances the ability of MSC to support LK cells proliferation.(A) CAFC assay was used to test the ability of Tet2-/- MSC to support LK cells proliferation.(B) CFC assay was used to test the differentiation of LK cells after treatment of Tet2-/- MSC.(C, D) Representative graphs of CAFC.* P<0.05.

2.4 Tet2敲除導(dǎo)致骨髓MSC甲基化水平增加

圖4 Tet2敲除導(dǎo)致骨髓細(xì)胞甲基化水平升高Fig.4 Tet2-/- deletion increases the methylation level of bone marrow (BM).(A) Genomic DNA was extracted from BM cells of WT or Tet2-/- mice and blotted onto nitrocellulose membrane after 2-fold serial dilution.5hmC and 5mC levels were detected with an anti-5hmC (ActiveMotif, #39791) or 5mC (Calbiochem; NA#81) antibody.(B) Methylation-chip demonstrated that the methylation level was incresed in Tet2-/- BM cells.(C) Methylation level was incresed in the transcriptional starting area (TSS), exons (EXONS) and 3? untranslated region (3? UTR) of Tet2-/- BM cells.*P<0.05.

為了檢測Tet2基因是否影響MSC的甲基化狀態(tài)，我們應(yīng)用點雜交和甲基化測序檢測Tet2-/-MSC和WT-MSC的甲基化狀態(tài)。點雜交結(jié)果顯示，同WT-MSC相比，Tet2-/-MSC全基因組中5mc明顯增加，而5hmc明顯減低 (圖4A)。甲基化測序的結(jié)果進一步證實，Tet2-/-MSC全基因組中的5hmc數(shù)量明顯低于WT-MSC (圖4B)。隨后的分析發(fā)現(xiàn)異常改變的5hmc主要分布于轉(zhuǎn)錄起始區(qū)(TSS)、外顯子區(qū) (EXONS) 和3?非翻譯區(qū) (3? UTR)(圖4C)。上述結(jié)果說明Tet2基因可以顯著影響MSC全基因組的甲基化狀態(tài)。

2.5 Tet2異常的骨髓MSC分泌造血調(diào)控因子功能的改變

為了進一步明確Tet2-/-MSC支持造血能力改變的原因，我們通過細(xì)胞因子芯片方法發(fā)現(xiàn)，許多常見的由MSC分泌的細(xì)胞因子(包括黏附分子和造血調(diào)控因子)在Tet2-/-MSC的培養(yǎng)上清液中表達異常。其中，IL-16、IL-6、TREM1、TNF-α、sICAM1、CXCL2、G-CSF明顯減低，而CCL5、GM-CSF、SDF1和CCL3明顯增加 (圖5)。上述結(jié)果提示Tet2基因影響MSC的關(guān)鍵細(xì)胞因子表達，進而改變其造血支持功能。

3 討論

正常造血依賴于復(fù)雜而完整的骨髓造血微環(huán)境，骨髓微環(huán)境主要通過骨髓內(nèi)細(xì)胞與細(xì)胞間的相互作用、基質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的生長或抑制因子以及細(xì)胞基質(zhì)與造血細(xì)胞間的相互作用來調(diào)節(jié)造血功能[18-19]。MSC是一類具有自我更新和多向分化能力的多能干細(xì)胞。存在于骨髓中的MSC是骨髓基質(zhì)細(xì)胞的前體細(xì)胞，可形成骨髓和外膜間質(zhì)細(xì)胞，構(gòu)成造血的微環(huán)境，MSC分化形成的結(jié)締組織骨架及該骨架產(chǎn)生的細(xì)胞因子、化學(xué)因子和ECM可調(diào)節(jié)造血細(xì)胞的歸巢和增殖；MSC還能夠分泌多種造血因子，表達多種表面粘附因子，在造血調(diào)控的過程中發(fā)揮著重要作用[19]。

圖5 Tet2敲除骨髓MSC分泌細(xì)胞因子能力改變Fig.5 The cytokine secreted by Tet2-/- MSC is changed.*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.005, ****P<0.001.

DNA甲基化是最常見的一種表觀遺傳學(xué)修飾，廣泛參與干細(xì)胞增殖、分化和轉(zhuǎn)化相關(guān)的關(guān)鍵基因群的表達調(diào)控。既往研究證實DNA甲基化在造血干細(xì)胞(Hematopoietic stem cell，HSC)增殖和分化中發(fā)揮重要調(diào)控作用[20-21]。但是，DNA甲基化是否具有調(diào)控MSC生物學(xué)性狀的能力，目前尚不清楚。TET2是目前發(fā)現(xiàn)最關(guān)鍵的DNA甲基化調(diào)控基因之一，不僅具有調(diào)控HSC的功能，還是關(guān)鍵的抑癌基因，在血液系統(tǒng)腫瘤的發(fā)生中發(fā)揮作用[22-23]。TET2是調(diào)控DNA羥甲基化最重要的胞嘧啶甲基化雙氧酶，TET2能夠?qū)?mc轉(zhuǎn)化成5hmc。Li等證實Tet2敲除的造血干祖細(xì)胞中5mc明顯增加，而5hmc相應(yīng)降低[21]。我們的研究發(fā)現(xiàn)：同WT-MSC比較，Tet2-/-MSC全基因組中5mc明顯增加，而5hmc明顯減低，提示Tet2基因可以顯著影響MSC全基因組的甲基化狀態(tài)。骨髓MSC具有很強的增殖能力，可以有效在體外擴增獲得細(xì)胞治療需求的細(xì)胞量。既往研究發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵基因的變化可以影響MSC的自我更新和增殖能力。Zhang等的研究發(fā)現(xiàn)Asxl1敲除MSC的自我更新和體外增殖能力都明顯下降[24]。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)，同WT-MSC比較，Tet2-/-MSC增殖能力明顯增加，這種改變的增殖能力隨著細(xì)胞傳代并不發(fā)生改變。上述結(jié)果提示Tet2基因的異?？梢燥@著改變MSC的生物學(xué)性狀。

作為骨髓微環(huán)境中最重要的細(xì)胞群，MSC通過和HSC的直接接觸，激活和關(guān)閉調(diào)控HSC的諸多信號通路，發(fā)揮調(diào)控HSC的作用。此外，MSC還能合成多種造血調(diào)節(jié)因子，發(fā)揮維持長期培養(yǎng)起始細(xì)胞的增殖、支持造血和促進造血恢復(fù)的作用，由此可見骨髓MSC可以通過模擬骨髓微環(huán)境發(fā)揮調(diào)控造血的功能。諸多外在因素(包括HSC和藥物)可以影響骨髓MSC造血支持作用，重塑骨髓造血微環(huán)境，實現(xiàn)生理或者病理性造血調(diào)控。但是，表觀遺傳學(xué)相關(guān)基因是否具有調(diào)控MSC造血支持能力，目前尚不清楚。我們的研究通過骨髓長期培養(yǎng)和克隆生成實驗，闡明Tet2-/-MSC維持HSC能力明顯強于WT-MSC。進一步分析上述培養(yǎng)體系中CFU-GM的生成情況，結(jié)果表明Tet2-/-MSC對定向祖細(xì)胞的增殖能力明顯優(yōu)于WT-MSC。我們的結(jié)果說明，TET2可以影響MSC對不同階段造血干祖細(xì)胞增殖和分化能力的調(diào)節(jié)作用。

越來越多的研究證實MSC通過分泌多種細(xì)胞因子調(diào)控造血，促進骨髓來源的CFU-GM、CFU-E和CFU-GEMM的增殖。Zhang等發(fā)現(xiàn)Tet2可以結(jié)合在IL-6啟動子區(qū)，Tet2缺失可以促進炎癥反應(yīng)中樹突細(xì)胞和巨噬細(xì)胞IL-6的分泌[25]。Greenbaum等發(fā)現(xiàn)在MSC中敲除CXCL12可以導(dǎo)致骨髓HSC數(shù)量明顯減低，并影響其造血重建和分化功能，提示MSC分泌的CXCL12在維持正常HSC造血功能方面發(fā)揮重要作用[26]。本研究通過細(xì)胞因子芯片方法證實多種細(xì)胞因子(包括黏附分子和造血調(diào)控因子)在Tet2-/-MSC中異常表達。其中，IL16、IL6、TREM1、TNF-α、sICAM1、CXCL2、G-CSF明顯減低；而CCL5、GM-CSF、SDF1和CCL3明顯增加。提示Tet2通過影響MSC分泌異常的細(xì)胞因子，進而發(fā)揮調(diào)控造血的功能。

綜上所述，我們的研究顯示Tet2可以影響骨髓MSC基因組的甲基化狀態(tài)，增加MSC體外增殖能力。此外，Tet2影響MSC對不同階段造血干祖細(xì)胞增殖和分化能力的調(diào)節(jié)作用，這種造血調(diào)控能力可能與細(xì)胞因子途徑相關(guān)。