荊玉棟，周駿翔

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人類高賴氨酸血癥源于線粒體穩(wěn)態(tài)破壞

荊玉棟，周駿翔

中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所，北京 100101

周駿翔 博士

氨基酸代謝紊亂是一類遺傳性代謝病，絕大多數(shù)屬于常染色體隱性遺傳病。高賴氨酸血癥即是其中一種比較罕見(jiàn)的氨基酸代謝病，分I型和II型。I型患者血液中賴氨酸濃度偏高，但是癥狀不明顯。II型患者血液中除賴氨酸濃度升高外，酵母氨酸濃度也會(huì)增高，患者會(huì)表現(xiàn)出嚴(yán)重的神經(jīng)損傷和發(fā)育遲緩，多數(shù)患者在成年之前死亡。目前的研究對(duì)人體內(nèi)的賴氨酸主要降解途徑——酵母氨酸途徑已經(jīng)比較清楚：雙功能酶α-氨基半醛合酶(α-aminoadipic semialdehyde synthase, AASS)是該途徑主要的催化酶，N端是賴氨酸-酮戊二酸還原酶(lysine ketalu-tarate reductase, LKR)結(jié)構(gòu)域，C端是酵母氨酸脫氫酶(saccharopine dehydrogenase, SDH)結(jié)構(gòu)域，線粒體內(nèi)的賴氨酸在LKR活性催化下與酮戊二酸結(jié)合，形成酵母氨酸，然后在SDH活性催化下分解成谷氨酸和氨基己二酸半醛，最后經(jīng)過(guò)一系列生化反應(yīng)變成乙酰輔酶A進(jìn)入三羧酸循環(huán)。高賴氨酸血癥的致病基因也已經(jīng)明確，即賴氨酸降解途徑的關(guān)鍵酶AASS。I型主要是LKR部分發(fā)生了突變，II型主要是SDH部分發(fā)生了突變。但是，關(guān)于賴氨酸和酵母氨酸濃度升高與患者癥狀的關(guān)聯(lián)機(jī)制并不明確。截至目前II型高賴氨酸血癥在臨床上尚無(wú)有效的治療方法，只能給病人食用不含賴氨酸的食物。

細(xì)胞是生命活動(dòng)的基本結(jié)構(gòu)和功能單位，細(xì)胞的生理活動(dòng)需要能量維持，而生命體的能量主要以三磷酸腺苷(ATP)為載體，而線粒體就是動(dòng)物細(xì)胞合成ATP的主要場(chǎng)所。另外線粒體還是代謝的重要場(chǎng)所，三羧酸循環(huán)、脂肪酸的β-氧化、血紅素的合成以及某些氨基酸的代謝等都在線粒體內(nèi)進(jìn)行。所以線粒體是一類非常重要的細(xì)胞器，也是細(xì)胞內(nèi)最豐富的細(xì)胞器之一，通常占細(xì)胞質(zhì)容積的20%~25%，其數(shù)目和形態(tài)處于動(dòng)態(tài)變化中。線粒體的形狀變化很大，有球狀、棒狀、分枝狀等，低倍鏡下呈網(wǎng)狀或線狀。線粒體的分裂和融合對(duì)線粒體的形狀以及維持線粒體穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要，該過(guò)程涉及還會(huì)許多調(diào)控蛋白的參與。目前研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)動(dòng)蛋白(dynamin)家族控制著線粒體分裂和融合的動(dòng)態(tài)變化過(guò)程。第一個(gè)線粒體發(fā)動(dòng)蛋白Mgm1在酵母中被發(fā)現(xiàn)，定位于線粒體內(nèi)膜，介導(dǎo)線粒體內(nèi)膜的融合。其在人類中的同源蛋白為OPA1，在線蟲的同源蛋白是EAT-3。介導(dǎo)線粒體外膜融合的蛋白首先在果蠅中被發(fā)現(xiàn)，被命名為fuzzy onions，后來(lái)在果蠅中又發(fā)現(xiàn)了一個(gè)控制外膜融合的蛋白Marf，而人類中的同源蛋白分別是MFN1和MFN2。但是酵母或線蟲中只發(fā)現(xiàn)了一個(gè)同源蛋白Fzo1p或FZO-1。Dnm1是最先在酵母中被發(fā)現(xiàn)的控制線粒體分裂的動(dòng)力蛋白，其在線蟲和哺乳動(dòng)物的同源蛋白分別是DRP-1和DRP1。

為尋找新的調(diào)控線粒體穩(wěn)態(tài)的因子，來(lái)自云南大學(xué)楊崇林教授和中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所郭偉翔研究員領(lǐng)導(dǎo)的研究團(tuán)隊(duì)聯(lián)合以秀麗線蟲為模式材料，構(gòu)建了一個(gè)株系，用綠色熒光蛋白標(biāo)記線蟲表皮細(xì)胞內(nèi)的線粒體，從而在熒光顯微鏡下觀察線粒體的形態(tài)。

研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)EMS誘變進(jìn)行了正向遺傳學(xué)篩選，獲得了一些線粒體形態(tài)發(fā)生改變的突變體株系。其中一類是具有球狀增大線粒體的突變體，被命名為和(圖1)。

進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，兩個(gè)突變體影響的是同一個(gè)基因，該基因編碼的蛋白質(zhì)與人類α-氨基半醛合酶同源，所以將該基因命名為。和兩個(gè)突變體中基因發(fā)生了功能缺失突變，而且突變位點(diǎn)都在C端的酵母氨酸脫氫酶(SDH)結(jié)構(gòu)域(圖2)。以從國(guó)際線蟲遺傳中心(Genetics Center, CGC)獲得的LKR功能受到影響的線蟲株系()作為對(duì)照，該突變體由于基因缺失突變導(dǎo)致AASS-1蛋白中的LKR和SDH功能缺失。用熒光蛋白標(biāo)記其線粒體發(fā)現(xiàn)，()表皮細(xì)胞中的線粒體并不增大。說(shuō)明只有在SDH功能受損而LKR功能正常的情況下才會(huì)造成線粒體球狀增大的表型。

圖1 aass-1基因的兩個(gè)功能缺失突變體yq170中表皮細(xì)胞內(nèi)的線粒體異常增大

右側(cè)為透射電鏡圖。

圖2 線蟲AASS-1蛋白與人類AASS蛋白之間的比對(duì)

波浪線表示線粒體定位信號(hào)(MTS)。線蟲AASS-1蛋白中的缺失突變和點(diǎn)突變的位置分別由紅線和星號(hào)(*)指示。

通過(guò)液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(LC-MS)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，()和()突變體的酵母氨酸濃度大概是野生型N2的100倍，賴氨酸濃度是N2的3~4倍。()突變體賴氨酸濃度是N2的5倍，但酵母氨酸濃度比野生型還低。熒光素發(fā)光實(shí)驗(yàn)顯示，相對(duì)于野生型線蟲N2，()和()突變體表皮細(xì)胞中的ATP含量顯著降低，表明線粒體合成ATP的功能受到影響。而()突變體表皮細(xì)胞中的ATP含量基本不變。

為驗(yàn)證突變體表皮細(xì)胞中線粒體增大是由于SDH突變導(dǎo)致的，以及人類AASS蛋白和線蟲AASS-1蛋白功能類似，將人類AASS蛋白的LKR 結(jié)構(gòu)域和SDH結(jié)構(gòu)域分別在線蟲中表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LKR不能回復(fù)突變體線粒體增大的表型，而SDH結(jié)構(gòu)域卻可以將增大的線粒體回復(fù)到野生型的絲狀或棒狀。

秀麗線蟲在進(jìn)化上和結(jié)構(gòu)上畢竟距離人類比較遠(yuǎn)，研究團(tuán)隊(duì)又通過(guò)構(gòu)建高賴氨酸血癥的小鼠模型做進(jìn)一步驗(yàn)證。()純合突變體小鼠的突變位點(diǎn)在LKR結(jié)構(gòu)域，該突變位點(diǎn)就是人I型高賴氨酸血癥的突變位點(diǎn)，()純合突變體小鼠的突變位點(diǎn)在SDH結(jié)構(gòu)域，模擬II型高賴氨酸血癥，該突變位點(diǎn)是()線蟲突變體的突變位點(diǎn)。

LC-MS檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，()突變體小鼠血漿中的酵母氨酸濃度比野生型小鼠更低，而()突變體小鼠的酵母氨酸濃度是野生型小鼠的100倍以上，這一結(jié)果與人類II型高賴氨酸血癥一致。線粒體的氧消耗量是其功能的重要指標(biāo)，利用seahorse細(xì)胞能量代謝分析儀，對(duì)小鼠肝臟細(xì)胞的氧消耗量進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)()突變體小鼠的氧消耗量低于野生型小鼠。

II型高賴氨酸血癥會(huì)使得病人發(fā)育遲緩和過(guò)早死亡，而I型高賴氨酸血癥大部分病人的癥狀并不明顯。而在()突變體小鼠模型中，線粒體內(nèi)酵母氨酸氧化缺陷會(huì)造成肝臟內(nèi)線粒體的損傷，并使肝臟重量增加，從而導(dǎo)致小鼠生長(zhǎng)遲緩和過(guò)早死亡。

為探索II型高賴氨酸血癥的治療策略，利用線蟲()突變體進(jìn)行了抑制篩選，獲得突變體并克隆了相應(yīng)基因。研究發(fā)現(xiàn)抑制LRK、抑制向線粒體的賴氨酸或谷氨酸運(yùn)輸、抑制線粒體谷氨酸脫氫酶或異檸檬酸脫氫酶均可以抑制()突變體中酵母氨酸的產(chǎn)生，從而使線粒體恢復(fù)正常。這就為II型高賴氨酸血癥的治療提供了重要的理論依據(jù)和治療思路(圖3)。

我們通過(guò)秀麗線蟲和小鼠模型的研究，發(fā)現(xiàn)由于賴氨酸代謝產(chǎn)物酵母氨酸累積，使線粒體增大，破壞了線粒體穩(wěn)態(tài)，影響了線粒體的功能，從而影響了個(gè)體的發(fā)育。這就在細(xì)胞水平闡明了人類高賴氨酸血癥發(fā)病機(jī)理，并為下一步的治療指明了方向。高賴氨酸血癥發(fā)病機(jī)理的揭示，很好的體現(xiàn)了利用經(jīng)典模式生物秀麗線蟲進(jìn)行基礎(chǔ)研究的重要性。通過(guò)研究維持線粒體穩(wěn)態(tài)的機(jī)制，最終闡明了一種氨基酸代謝缺陷病的發(fā)病機(jī)制。

圖3 賴氨酸代謝相關(guān)通路以及酵母氨酸累積造成線粒體損傷的機(jī)制示意圖

該項(xiàng)研究于2018年12月20日以Article形式在線發(fā)表在細(xì)胞生物學(xué)著名期刊上(//doi.org/10.1083/jcb.201807204)。云南大學(xué)楊崇林教授和中科院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所郭偉翔研究員為該論文的共同通訊作者。楊崇林實(shí)驗(yàn)室周駿翔博士為文章第一作者。楊崇林實(shí)驗(yàn)室的王鑫老師提供了電鏡分析，郭偉翔實(shí)驗(yàn)室的王敏老師和博士后郭野參與了小鼠部分的工作。中科院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所王國(guó)棟研究組在代謝組學(xué)分析方面、錢文鋒研究組在生物信息方面給予極大幫助。該研究由科技部、國(guó)家自然科學(xué)基金委以及中科院項(xiàng)目資助。