任云曉，肖茹丹，婁曉敏,4，方向東,4

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基因編輯技術(shù)及其在基因治療中的應(yīng)用

任云曉1,2,3，肖茹丹1,4，婁曉敏1,2,3,4，方向東1,2,3,4

1. 中國科學(xué)院北京基因組研究所，中國科學(xué)院基因組科學(xué)與信息重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100101 2. 中國科學(xué)院大學(xué)中丹學(xué)院，北京 101408 3. 中國-丹麥科研教育中心，北京 101408 4. 中國科學(xué)院大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京 100049

基因編輯技術(shù)是以特異性改變遺傳物質(zhì)靶向序列為目標(biāo)的技術(shù)。近年來，鋅指核酸酶(zinc finger nuclease, ZFN)、類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)核酸酶(transcription activator-like effector nuclease, TALEN)、規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù)(regular clustering of short palindrome repeats, CRISPR)和單堿基編輯(base editing, BE)技術(shù)的相繼出現(xiàn)，不僅為基因功能研究提供了有力的工具，還為生命醫(yī)學(xué)提供了新的治療方案?；蚓庉嫾夹g(shù)已經(jīng)大范圍應(yīng)用于動物細(xì)胞模型的構(gòu)建、藥物靶點(diǎn)的篩查和基因功能研究等，在基因治療領(lǐng)域也展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。本文就基因編輯技術(shù)的研究進(jìn)展及其在基因治療中的應(yīng)用進(jìn)行了概述，并對基因編輯技術(shù)的的原理、發(fā)展史、優(yōu)缺點(diǎn)以及在基因治療中的應(yīng)用前景和機(jī)遇挑戰(zhàn)進(jìn)行了討論，以期為基因編輯技術(shù)的臨床轉(zhuǎn)化提供參考。

基因編輯技術(shù)；CRISPR/Cas9；單堿基編輯；基因治療

基因編輯技術(shù)是以改變目的基因序列為目的，實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)突變、插入或敲除的技術(shù)。從20世紀(jì)末人們就開始對基因編輯技術(shù)進(jìn)行探索，但直到2013年CRISPR/Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9)技術(shù)成功用于哺乳動物細(xì)胞，才極大地推動了基因編輯技術(shù)的發(fā)展熱潮[1]。

真核生物的基因組包含數(shù)十億個堿基，對其基因組的操作一直面臨挑戰(zhàn)。同源重組技術(shù)(homologous recombination, HR)是最早的基因編輯技術(shù)，也是真核生物基因編輯的一個重大突破。其原理是將外源性目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞，通過同源序列交換，使外源性DNA片段取代原位點(diǎn)上的基因，從而達(dá)到使特定基因失活或修復(fù)缺陷基因的目的。但是對高等真核生物來說，外源DNA與目的DNA自然重組率非常低，只有10-7~10-6[2,3]；若要得到穩(wěn)定遺傳的純合體基因敲除模型，至少需要兩代遺傳，因此HR的大規(guī)模應(yīng)用受到了一定的限制。

為應(yīng)對這一挑戰(zhàn)，一系列基于核酸酶的基因編輯技術(shù)相繼出現(xiàn)，實(shí)現(xiàn)了在真核生物尤其是哺乳動物中精準(zhǔn)有效的基因編輯。與傳統(tǒng)的基因編輯技術(shù)相比，基于核酸酶的基因編輯技術(shù)減少了外源基因隨機(jī)插入，提高了對基因組特定片段進(jìn)行精確修飾的幾率。目前基因編輯技術(shù)主要包括以下幾種：人工介導(dǎo)的鋅指核酸酶技術(shù)(zinc finger nucleases, ZFNs)、類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)核酸酶技術(shù)(transcription activator- like effectors nucleases, TALENs)、規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù)相關(guān)蛋白技術(shù)(CRISPR/Cas9)和單堿基編輯(base editor, BE)技術(shù)等[4]。

基因編輯技術(shù)掀起的研究熱潮，一方面是因?yàn)榛蚓庉嫾夹g(shù)本身的發(fā)展，更為精準(zhǔn)、高效、低成本的基因編輯技術(shù)不斷地被開發(fā)出來；另一方面基因編輯技術(shù)作為一項(xiàng)重要的工具，在基因篩查、動物、細(xì)胞模型構(gòu)建等基礎(chǔ)研究中發(fā)揮著重要的作用，也為許多疾病的基因治療提供了新的思路[2~4]。因此，本文從基因編輯技術(shù)的發(fā)展歷程及其在基因治療中的探索和應(yīng)用進(jìn)行概述，并對基因編輯技術(shù)面臨的挑戰(zhàn)和機(jī)遇進(jìn)行討論。

1 基因編輯技術(shù)研究進(jìn)展

基于DNA核酸酶的基因編輯技術(shù)發(fā)展迅速，從第一代DNA核酸酶編輯系統(tǒng)ZFNs、第二代TALENs到第三代CRISPR/Cas9系統(tǒng)，基因編輯效率不斷提高、成本逐漸降低，應(yīng)用范圍不斷擴(kuò)大。ZFNs、TALENs和CRISPR/Cas9等3種基因編輯技術(shù)都是在基因組靶標(biāo)位點(diǎn)引起DNA雙鏈斷裂(double-strand breaks, DSBs)，進(jìn)而激活細(xì)胞內(nèi)部修復(fù)機(jī)制的基礎(chǔ)上建立的。細(xì)胞內(nèi)DNA雙鏈斷裂的修復(fù)機(jī)制包括易引起隨機(jī)插入、缺失的異源末端連接(non-homologous end joining, NHEJ)和需要同源模板存在才可以激活的同源重組修復(fù)(homology directed repair, HDR)[5,6]。2016年，BE技術(shù)的開發(fā)實(shí)現(xiàn)了在不引起DNA雙鏈斷裂和無需同源模板的情況下的單個堿基轉(zhuǎn)換，有效地規(guī)避了基于雙鏈DNA斷裂后NHEJ和HDR修復(fù)的基因編輯技術(shù)的不足。

1.1 ZFNs

20世紀(jì)90年代，I酶的發(fā)現(xiàn)促進(jìn)了ZFNs的出現(xiàn)[7,8]。1996年，美國約翰霍普金斯大學(xué)環(huán)境衛(wèi)生科學(xué)系Chandrasegaran團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了基于Ⅰ酶和鋅指蛋白融合的ZFNs技術(shù)[9]。ZFNs包含兩個結(jié)構(gòu)域：DNA結(jié)合的鋅指蛋白區(qū)域和限制性核酸內(nèi)切酶Ⅰ的核酸酶切活性區(qū)域(圖1)。鋅指蛋白區(qū)域決定了ZFNs的序列特異性。鋅指基序一般由30個氨基酸組成，其結(jié)合鋅離子的保守區(qū)域通常為4個半胱氨酸或2個半胱氨酸和2個組氨酸，其空間結(jié)構(gòu)由1個?螺旋和2個反向的b平行結(jié)構(gòu)組成。?螺旋的1、3、6位的氨基酸分別特異性地識別并結(jié)合DNA序列中的3個連續(xù)的堿基。由于不同的鋅指基序中a螺旋的1、3、6位氨基酸不同，因此由3~6個不同鋅指基序組成的鋅指蛋白區(qū)域與Ⅰ核酸酶區(qū)域連接就構(gòu)成了可以特異識別DNA序列并進(jìn)行切割的人工核酸酶。Ⅰ必須二聚化才具有活性。由于Ⅰ自身二聚化也能對DNA進(jìn)行切割，但是切割效率低且易產(chǎn)生非特異切割，所以在設(shè)計(jì)ZFNs時可以對Ⅰ進(jìn)行突變，使之不能形成同源二聚體。當(dāng)兩個結(jié)合不同靶序列的突變的Ⅰ被5~7 bp的spacers隔開就可以形成具有核酸酶的活性的異源二聚體[10,11]。這樣設(shè)計(jì)的ZFNs可以增加其DNA序列識別的特異性。

圖1 ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9的結(jié)構(gòu)和DNA斷裂修復(fù)類型

基于Chandrasegaran的工作，美國猶他大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)系的Dana Carrol團(tuán)隊(duì)使用ZFNs注入果蠅胚胎，第一次實(shí)現(xiàn)了在動物中的基因編輯[12,13]。隨后，科學(xué)家用ZFNs技術(shù)在動物、植物和人類細(xì)胞中都實(shí)現(xiàn)了靶基因的編輯[10,14]。盡管ZFNs技術(shù)在多個物種中成功進(jìn)行了基因編輯，但是鋅指蛋白的設(shè)計(jì)費(fèi)時費(fèi)力，成本較高，限制了該方法的大規(guī)模應(yīng)用[14,15]。

1.2 TALENs

2009年，美國愛荷華州立大學(xué)植物病理學(xué)與生物信息學(xué)系的Adam J. Bogdanove團(tuán)隊(duì)和德國馬丁盧瑟大學(xué)生物研究所的Ulla Bonas團(tuán)隊(duì)分別發(fā)現(xiàn)了來自植物致病黃單胞菌屬的轉(zhuǎn)錄激活效應(yīng)蛋白(transcription-activator-like effector，TALE)和DNA的相互作用[16,17]。將TALE蛋白與Ⅰ酶區(qū)域結(jié)合構(gòu)建了新一代的核酸酶編輯技術(shù)——TALENs[14,18]。TALENs的組成和ZFNs的相似之處是在其羧酸末端也含有Ⅰ核酸酶結(jié)構(gòu)域，不同之處是TALENs的DNA結(jié)合域?yàn)門ALE蛋白(圖1)[19]。TALE蛋白中每個識別模塊由34個氨基酸組成，除了第12和13位氨基酸外其余氨基酸序列都是保守的，第12和13位氨基酸稱為可變的雙氨基酸殘基(repeat variable di-residue, RVD)。RVD決定了TALE識別并結(jié)合的DNA堿基。4種不同的堿基都有與之對應(yīng)的TALE識別模塊。因此構(gòu)建TALEN人工核酸酶時，只需要按照目標(biāo)序列的順序?qū)⒉煌腡ALE識別模塊的序列連接起來，再與Ⅰ的編碼序列融合即可。相對于ZFNs來說，TALENs的設(shè)計(jì)變得容易，對任意的DNA序列理論上都可以設(shè)計(jì)和構(gòu)建一個特異的TALEN核酸酶。但是目標(biāo)序列的每個堿基都需要一個TALE識別模塊，因此TALENs的構(gòu)建過程工作量較大。此外，TALENs在人類細(xì)胞中的細(xì)胞毒性較低[14,20]。2011年，Miller等[18]第一次使用TALENs在人類細(xì)胞中對和基因進(jìn)行編輯，證明了TALEN核酸酶對內(nèi)源靶向基因的調(diào)節(jié)和修飾作用。

1.3 CRISPR/Cas9

2012年CRISPR/Cas9的體外重構(gòu)和2013年在人類細(xì)胞中證明了其基因編輯功能，標(biāo)志著新一代基因編輯時代的開始[21,22]。CRISPR/Cas9系統(tǒng)來源于細(xì)菌和古細(xì)菌的天然獲得性免疫系統(tǒng)，通過CRISPR RNA (crRNA)和trans-activating crRNA (tracrRNA)以及Cas9蛋白組成的復(fù)合體抵御外源性DNA的入侵。CRISPR/Cas9系統(tǒng)發(fā)揮作用的基本過程可以分為3個階段：第一個階段為間隔序列獲得期，質(zhì)粒或噬菌體攜帶的DNA片段被宿主的核酸酶切割成短的DNA片段，符合條件的DNA片段整合進(jìn)宿主CRISPR位點(diǎn)成為crRNA重復(fù)序列間的間隔序列；第二個階段為CRISPR/Cas9表達(dá)期，Cas9蛋白表達(dá)，CRISPR序列由pre-crRNA 加工為成熟的crRNA，成熟的crRNA包含間隔序列，靶向結(jié)合于外來入侵的DNA；第三階段為DNA干擾期，Cas9蛋白在向?qū)rRNA的引導(dǎo)下識別靶向位點(diǎn)，并調(diào)節(jié)基因組的剪切[22]。根據(jù)Cas蛋白的不同，CRISPR/Cas系統(tǒng)可以分為5類：類型Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ的CRISPR位點(diǎn)包含crRNA與多個Cas蛋白形成的復(fù)合物；類型Ⅱ(Cas9)和類型V(Cpf1)只需要RNA介導(dǎo)的核酸酶[23]。許多CRISPR系統(tǒng)都依賴于臨近c(diǎn)rRNA靶向位點(diǎn)的PAM (proto-spacer adjacent motif)序列，PAM序列的缺失將會導(dǎo)致Ⅰ型和Ⅱ型CRISPR系統(tǒng)的自我剪切[24]。

廣泛用于基因編輯的CRISPR/Cas9是Ⅱ型CRISPR系統(tǒng)，由Cas9蛋白和sgRNA(single guide RNA)組成。sgRNA是根據(jù)crRNA和tracrRNA形成的高級結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)的，與Cas9核酸酶蛋白結(jié)合，指導(dǎo)其識別并剪輯靶向序列，靶向序列附近必需存在含有NGG或者NAG的PAM基序[25~27](圖1)。

相比較ZFNs和TALENs，CRISPR/Cas9通過一段與目標(biāo)DNA片段匹配的向?qū)NA引導(dǎo)核酸酶識別靶向位點(diǎn)，提高了Cas9核酸酶的特異性；同時，Cas9在sgRNA的引導(dǎo)下以單體蛋白的形式發(fā)揮功能，不像ZFNs和TALENs的Ⅰ酶只有二聚化才具有切割靶向DNA的活性，因此CRISPR/Cas9也避免了精細(xì)復(fù)雜的蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)或組裝的需要。但是，由于CRISPR/Cas9來自于原核生物天然獲得性免疫系統(tǒng)抵御外來遺傳物質(zhì)的防御系統(tǒng)，Cas9核酸酶可能繼承了序列特異性低的特點(diǎn)，使其非特異性切割的幾率增加，造成脫靶效應(yīng)增多。不同的科研團(tuán)隊(duì)提出了不同的方法修飾或編輯Cas9和sgRNA以降低脫靶效應(yīng)[28,29]。如將Cas9蛋白與Ⅰ核酸酶、鋅指蛋白或者TALE蛋白結(jié)合提高Cas9的特異性[30~32]；用失活的Cas9蛋白和Ⅰ區(qū)域融合形成新的核酸酶，使其只有在核酸酶二聚化時才具有活性；Fatih等[32]將鋅指蛋白或者TALE蛋白與Cas9蛋白變異體融合增強(qiáng)核酸酶的特異性。另一種降低脫靶效應(yīng)的方法是使用切口酶代替核酸酶，產(chǎn)生單鏈斷裂而不是雙鏈斷裂，單鏈斷裂不能誘導(dǎo)NHEJ的修復(fù)，仍然可以激活HR的精確修復(fù)[14]。單鏈斷裂可以使脫靶效應(yīng)降低，但修復(fù)效率也降低，因此有人提出了使用雙切口酶的方法，既提高了基因編輯的特異性也提高了編輯的效率[33]。

1.4 BE

ZFNs、TALENs和CRISPR/Cas9技術(shù)都依賴于在靶位點(diǎn)誘導(dǎo)雙鏈斷裂進(jìn)而激活DNA的NHEJ和HDR。NHEJ容易引起隨機(jī)插入和缺失，造成移碼突變，進(jìn)而影響靶基因的功能；HDR盡管精確性高于NHEJ，但是其在細(xì)胞中的同源重組修復(fù)效率低，約為0.1%~5%。BE技術(shù)的出現(xiàn)有效地改善了以上問題[34,35]。

2016年4月，美國哈佛大學(xué)David Liu實(shí)驗(yàn)室第一次發(fā)表了不需要DNA雙鏈斷裂也不需要同源模板即可進(jìn)行單堿基轉(zhuǎn)換的基因編輯技術(shù)——BE技術(shù)。該技術(shù)基于無核酸酶活性的dCas9 (Inactive, or dead Cas9)或有單鏈DNA切口酶活性的Cas9n (Cas9 nickase)、胞嘧啶脫氨酶、尿嘧啶糖基化酶抑制子(uracil DNA glycosylase inhibitor, UGI)以及sgRNA形成的復(fù)合體，在不引起雙鏈DNA斷裂的情況下，直接使靶向位點(diǎn)的胞嘧啶(Cytosine, C)脫氨基變成尿嘧啶(Uracil, U)；由于尿嘧啶糖基化酶抑制子的存在，抑制了U的切除；隨著DNA復(fù)制，U被胸腺嘧啶(Thymine, T)取代；同時，互補(bǔ)鏈上原來與C互補(bǔ)的鳥嘌呤(Guanine, G)將會替換為腺嘌呤(Adenine, A)，最終實(shí)現(xiàn)了在一定的活性窗口內(nèi)C到T和G到A的單堿基精準(zhǔn)編輯。BE技術(shù)的出現(xiàn)促進(jìn)了點(diǎn)突變基因編輯的有效性和使用范圍[36]。

David Liu團(tuán)隊(duì)對4種胞嘧啶脫氨酶——hAID (human activation induced deaminase)、hAPOBEC3G (human apoliprotein B mRNA-editing enzyme-catalytic polypeptide-like-3G)、rAPOBEC1 (rat apolipoprotein B mRNA-editing enzyme 1)和七鰓鰻()來源的AID類似物PmCDA1進(jìn)行評估，發(fā)現(xiàn)rAPOBEC1具有最高的脫氨酶活性[36]。他們通過將rAPOBEC1與dCas9的N末端以及16個殘基的XTEN連接體融合，組成了第一代堿基編輯器BE1 (rAPOBEC1-XTEN- dCas9)，具有5 nt的活性窗口[36]。第二代堿基編輯器BE2 (APOBEC-XTEN- dCas9-UGI)融入了UGI抑制了U糖基化引起堿基切除修復(fù)，編輯效率在人類細(xì)胞比BE1高3倍[36]。第三代堿基編輯器BE3 (APOBEC-XTEN-dCas9(A840H)- UGI)恢復(fù)了Cas9 HNH區(qū)域840位置組氨酸的催化作用，可以剪切非編輯鏈上與編輯鏈上U互補(bǔ)的G堿基，對非編輯鏈的剪切使BE3的編輯效率比BE2高2~6倍[36]。

隨著單堿基編輯技術(shù)的出現(xiàn)，日本科學(xué)家基于PmCDA1和dCas9或Cas9n以及鳥嘌呤糖苷化酶抑制子UGI的融合，也開發(fā)了PMCDATA-dCas9/Cas9n- UGI的單堿基編輯器[37]。中國科學(xué)院上海營養(yǎng)與健康研究院常興研究組開發(fā)了基于hAID的dCas9- AIDx單堿基編輯系統(tǒng)，用于耐藥突變的篩選[38]。

2017年，David Liu 實(shí)驗(yàn)室對BE技術(shù)做了多方面改進(jìn)。首先針對常用的化膿性鏈球菌()的Cas9(SpCas9)蛋白靶向范圍較窄，只識別含有NGG或NGA的PAM序列的靶位點(diǎn)的限制，他們使用金黃色葡萄球菌()的Cas9 (SaCas9)、SaCas9突變體(Sacas9-KKH)、SpCas9突變體(SpCas9-VQR、SpCas9-EQR、SpCas9-VRER)替代SpCas9，可以識別含有NGG、NGA、NGAN、NGAG、NGGG、NNGRRT和NNNRRT的PAM序列，從而顯著提高了單堿基基因編輯的靶向范圍。其次，他們通過突變胞嘧啶脫氨酶，降低酶的活性、改變底物的結(jié)合和構(gòu)象，或者直接降低底物進(jìn)入胞嘧啶脫氨酶活性區(qū)域的能力，縮小了單堿基編輯系統(tǒng)的活性窗口，從5個核苷酸窗口縮小至1~2個核苷酸活性窗口[39]。再次，David Liu實(shí)驗(yàn)室通過對BE3引入突變來減少脫靶效應(yīng)，產(chǎn)生了高保真的堿基編輯器(high-fidelity base editor, HF-BE3)[40]。隨后，他們又報(bào)道了基于TadA (ecTadA)的新型單堿基編輯器——腺嘌呤堿基編輯器(adenine base editors, ABEs)，實(shí)現(xiàn)了A×T堿基對向G×C堿基對的轉(zhuǎn)換。經(jīng)過不斷的改進(jìn)，第7代的腺嘌呤堿基編輯器將靶向的A.T堿基轉(zhuǎn)化為G×C堿基對可以達(dá)到約50%的效率(人類細(xì)胞)，并且引入插入或缺失的頻率低于0.1%[34]。

2 基因編輯技術(shù)在基因治療中的應(yīng)用

從1996年對ZFNs第一次進(jìn)行體外驗(yàn)證到2012年CRISPR/Cas9技術(shù)的出現(xiàn)和之后的蓬勃發(fā)展(圖2)，基因編輯技術(shù)發(fā)展迅速，編輯效率和精確性不斷提高，應(yīng)用領(lǐng)域也不斷拓寬。不僅可用于表達(dá)調(diào)控和基因功能的研究、細(xì)胞動物模型的構(gòu)建、癌基因和藥物靶點(diǎn)的篩選，在基因治療中更是具有巨大的發(fā)展前景，為單基因遺傳病、癌癥等疾病提供了新的治療方法[41,42]。

基因治療通過導(dǎo)入正常基因或者編輯修復(fù)缺陷基因，實(shí)現(xiàn)治療疾病的目的。目前，利用基因編輯技術(shù)在多種疾病，如單基因遺傳病、眼科疾病、艾滋病及腫瘤等的基因治療中得到了應(yīng)用[43]。

鐮狀細(xì)胞病(sickle cell disease, SCD)是由于β-珠蛋白基因的第7個密碼子的單基因點(diǎn)突變造成的。Hoban等[44]利用ZFNs特異性靶向于β-珠蛋白基因，并誘導(dǎo)CD34+造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞中的DNA被切割。當(dāng)ZFNs與整合酶缺陷型慢病毒載體或寡核苷酸供體一起傳送進(jìn)細(xì)胞時，有效地實(shí)現(xiàn)了β-珠蛋白基因座的基因矯正。Hoban的研究為鐮狀型細(xì)胞性貧血的基因治療提供了重要的方法路徑[44]。

基因編輯技術(shù)不僅應(yīng)用于遺傳性疾病的治療，在非遺傳性疾病中也有重大的突破。與年齡相關(guān)的黃斑衰退(age-related macular degeneration, AMD)是導(dǎo)致成人失明的主要原因，脈絡(luò)膜新血管形成(choroidal neovascularization, CNV)是其主要病理學(xué)特征，血管生成因子如VEGFA (vascular endothelial growth factor A, VEGFA)基因的高表達(dá)是造成病變的主要原因[45,46]。Kim等[47]將預(yù)先設(shè)計(jì)好的Cas9核糖核蛋白(ribonucleoprotein, RNP)導(dǎo)入成年小鼠眼中，使視網(wǎng)膜色素上皮中VEGFA基因失活；并且在AMD的小鼠模型中發(fā)現(xiàn) cas9 RNPs有效地減少了脈絡(luò)膜新血管生成的面積。該研究表明CRISPR/Cas9技術(shù)有可能用于非遺傳性退行性眼部疾病的局部治療。

圖2 基因編輯技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用

表1 ZFNs、TALENs、CRISPR/Cas9和BE技術(shù)的比較

基因編輯技術(shù)在艾滋病、腫瘤治療等領(lǐng)域也取得了初步進(jìn)展。第一次在人類中應(yīng)用靶向核酸酶是利用ZFNs技術(shù)編輯基因抵抗HIV。研究者從HIV病人中提取T細(xì)胞，用ZFNs技術(shù)干擾T細(xì)胞中基因，由于基因是大部分HIV菌株尤其是早期感染菌株的輔助受體，干擾基因的表達(dá)可以抗HIV感染，表明基因編輯技術(shù)可能成為艾滋病治療的新方向[48~51]。

基因編輯應(yīng)用于腫瘤治療，主要是與免疫治療相結(jié)合，尤其是與CAR (chimeric antigen receptor) T 細(xì)胞，該方法在白血病、淋巴瘤和部分實(shí)體瘤中有巨大的發(fā)展前景[52,53]。CARs包括腫瘤細(xì)胞特異抗原的胞外單鏈可變片段和細(xì)胞內(nèi)嵌合信號域，可以激活T細(xì)胞和殺傷腫瘤細(xì)胞[53]。Ren等[54]使用CRISPR/ Cas9系統(tǒng)同時破壞多個基因位點(diǎn)，產(chǎn)生的TCR (T cell receptor)和HLA-I (HLA class I)缺陷的CAR T細(xì)胞可作為通用的CAR T細(xì)胞，用于免疫治療；除了產(chǎn)生通用的CAR T細(xì)胞，基因編輯技術(shù)也可通過敲除編碼T細(xì)胞抑制受體或信號分子的基因如PD1 (programmed cell death protein 1)和CTLA4 (cytotoxic T lymphocyte-associated protein 4)，用于產(chǎn)生增強(qiáng)型CAR T細(xì)胞[53,55,56]。

2016年，四川大學(xué)華西醫(yī)院盧鈾團(tuán)隊(duì)開展了CRISPR基因編輯技術(shù)的臨床實(shí)驗(yàn)，從轉(zhuǎn)移性非小細(xì)胞肺癌患者中分離出T細(xì)胞，并使用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除細(xì)胞中的PD-1基因，在體外擴(kuò)增到一定量后再重新輸回患者體內(nèi)，達(dá)到殺死腫瘤細(xì)胞的目的[57,58]。但是簡單的敲除T細(xì)胞的抑制因子是一把雙刃劍，真正投入臨床使用還需要進(jìn)一步研究敲除這些抑制因子是否會引起細(xì)胞的不可控制的增殖或者產(chǎn)生嚴(yán)重的自身免疫[53]。

由于BE技術(shù)是在不造成雙鏈DNA斷裂的情況下進(jìn)行的精確堿基轉(zhuǎn)換，這對于基因治療而言無疑是一個非常有效的工具。b-地中海貧血是由于珠蛋白基因(hemoglobin-beta,)突變所致，中國和東南亞地區(qū)的發(fā)病原因主要是HBB基因A到G的突變。 2017年，中山大學(xué)黃軍就團(tuán)隊(duì)利用單堿基編輯技術(shù)在不能發(fā)育成熟的人類三元核胚胎中戰(zhàn)對HBB的點(diǎn)突變進(jìn)行編輯，即將堿基G改為A從而修正錯誤。該研究是第一個利用BE技術(shù)對遺傳疾病突變位點(diǎn)進(jìn)行精準(zhǔn)修復(fù)的研究，為治療新生兒b-型地中海貧血癥，甚至為其他遺傳性疾病的治療打開了新窗口[59]。Chadwick團(tuán)隊(duì)也通過BE技術(shù)實(shí)現(xiàn)基因的敲除，從而降低血漿膽固醇的水平[60]。

3 基因編輯技術(shù)面臨的挑戰(zhàn)

盡管基因編輯技術(shù)在基因治療領(lǐng)域展現(xiàn)了廣闊的應(yīng)用前景，但是目前仍然面臨著諸多挑戰(zhàn)，如脫靶效應(yīng)、傳遞系統(tǒng)的有效性和安全性、免疫排斥反應(yīng)、倫理爭論等。

3.1 脫靶效應(yīng)

脫靶效應(yīng)會導(dǎo)致假表型，造成錯誤的理解和解讀，是限制基因編輯技術(shù)應(yīng)用的重要原因。脫靶效應(yīng)面臨兩個問題：一是如何從技術(shù)本身上降低脫靶效應(yīng)；二是如何提高檢測方法的靈敏性。降低脫靶效應(yīng)的可行性策略有減少NHEJ修復(fù)引入的插入和缺失，如使用單切口酶活性突變體和不需要雙鏈斷裂激活修復(fù)的BE技術(shù)等[33,58]；改進(jìn)sgRNA的設(shè)計(jì)，如在保證一定的sgRNA結(jié)合靶點(diǎn)效率的基礎(chǔ)上，截短sgRNA的長度[59,61]；提高核酸酶蛋白的特異性，如David Liu研究組通過在Cas9蛋白特定位點(diǎn)插入羥基他莫昔芬應(yīng)激性內(nèi)含肽(hydroxytamoxifen (4-HT)- responsive intein)產(chǎn)生小分子激活Cas9核酸酶，使Cas9靶向編輯的特異性提高了25倍[62]。

目前脫靶效應(yīng)的檢測方法有基于全基因組范圍內(nèi)檢測DSBs的方法，該方法可以無偏向性地評估Cas9剪切的特異性，如通過NHEJ將雙鏈寡聚脫氧核苷酸整入DSBs，進(jìn)而擴(kuò)增和測序的GUIDE-Seq (genome-wide unbiased identification of DSBs enabled by sequencing)[63]，以及用Cas9體外消化分離基因組DNA，然后進(jìn)行全基因組測序的Digenome-Seq (digested genome sequencing)[29]。雖然兩種方法都無偏向性，且敏感性較好，但是兩者都需要參考基因組，GUIDE-Seq整合雙鏈寡聚脫氧核苷酸進(jìn)入DSBs的效率不高，Digenome-Seq檢驗(yàn)gRNA費(fèi)用昂貴，且檢測多個gRNA時測序深度也受限制[64]。因此，脫靶效應(yīng)仍然是基因編輯技術(shù)未來發(fā)展必需解決的問題之一。

3.2 核酸酶的傳遞效率和安全性

核酸酶的傳送系統(tǒng)包括病毒、質(zhì)粒、RNA和蛋白質(zhì)的系統(tǒng)，其中病毒載體系統(tǒng)具有較高的編輯效率和插入突變，較低的脫靶效應(yīng)和較高的免疫反應(yīng)，如AAV (adeno-associated virus)載體和慢病毒載體廣泛用于靶向基因向細(xì)胞的傳送，但是其對傳輸物質(zhì)大小有限制；質(zhì)粒型載體在編輯效率、插入突變、脫靶效應(yīng)和免疫反應(yīng)均具有中等表現(xiàn)；RNA或蛋白質(zhì)核酸復(fù)合物均不具有插入突變的功能，但普遍認(rèn)為以蛋白核酸復(fù)合物進(jìn)行傳輸具有起效快且無長期表達(dá)的特點(diǎn)，因而具有較低的脫靶效應(yīng)[64]。就BE系統(tǒng)來說，需要Cas9與胞嘧啶脫氨酶、UGI、sgRNA的融合，序列組成較長。如果使用AAV載體，其對包裝物質(zhì)4.7 kb長度的限制，使BE系統(tǒng)無法被包裝進(jìn)去?？梢钥紤]將BE系統(tǒng)拆分包裝成兩個病毒，但是系統(tǒng)拆分后的編輯效率是否會受到影響尚不得知。因此，提高核酸酶傳送系統(tǒng)的有效性和安全性將會進(jìn)一步促進(jìn)基因編輯的應(yīng)用，有研究表明脂質(zhì)體可能在基因編輯傳送系統(tǒng)中展現(xiàn)巨大的發(fā)展?jié)摿2]。

3.3 基因編輯引起的副作用

美國斯坦福大學(xué)兒科血液學(xué)家Matthew Porteus和Kenneth Weinberg的研究小組發(fā)現(xiàn)人體中普遍存在Cas9抗體，如果使用CIRSPR/Cas9進(jìn)行治療，可能引發(fā)人體劇烈的免疫反應(yīng)，最終導(dǎo)致治療失敗，但是目前有關(guān)基因編輯可能引起免疫反應(yīng)的研究還相對較少[65]。

近期，發(fā)表了分別來自瑞典卡洛林斯卡研究所和美國劍橋諾華生物醫(yī)學(xué)研究院的研究[66,67]。他們分別獨(dú)立發(fā)現(xiàn)CRISPR/Cas9基因編輯過程造成的DNA雙鏈斷裂可以激活p53通路。這意味著基因編輯成功的細(xì)胞很可能成為潛在的癌細(xì)胞，利用CRISPR/Cas9進(jìn)行臨床治療可能無意中增加患癌癥的風(fēng)險。

CRISPR/Cas9技術(shù)除了面臨脫靶問題，可能還面臨染色體結(jié)構(gòu)異常的問題。Kosicki等[68]在上報(bào)道了Cas9還可能在作用靶點(diǎn)附近導(dǎo)致大規(guī)模的DNA刪除，在部分情況下，甚至引起復(fù)雜的DNA重排。研究人員通過長讀長測序和大范圍的PCR基因型鑒定發(fā)現(xiàn)在小鼠胚胎干細(xì)胞和人類造血祖系細(xì)胞內(nèi)，可能出現(xiàn)數(shù)千DNA堿基的刪除，導(dǎo)致臨近基因或調(diào)控序列受到影響并改變細(xì)胞功能。因此引起的DNA重排問題也成為了CRISPR/Cas9技術(shù)面臨的另一個安全隱患[68]。

除了上述挑戰(zhàn)之外，基因編輯技術(shù)在基因治療中的應(yīng)用仍可能有很多意想不到的問題出現(xiàn)。但無論如何，技術(shù)的發(fā)展總會遇到瓶頸，瓶頸的攻克也將必然給技術(shù)的應(yīng)用帶來更廣闊的空間。

3.4 基因編輯中的倫理問題

基因編輯技術(shù)為遺傳性疾病、腫瘤等多種疾病帶來了治療的希望，但是人類胚胎細(xì)胞的基因編輯引起了社會上廣泛的討論和激烈的爭議。一方面，對胚胎細(xì)胞的基因編輯有助于基礎(chǔ)科學(xué)研究，促進(jìn)我們了解人類胚胎發(fā)育的分子機(jī)制，有利于實(shí)現(xiàn)在早期胚胎發(fā)育時期治愈疾病的目標(biāo)；另一方面基因編輯技術(shù)可能產(chǎn)生的脫靶或者其他基因編輯失誤，從而導(dǎo)致慢性疾病或者嚴(yán)重的致殘個體，這些對人類的繁衍和生活方式等都將會產(chǎn)生非常大的危害。然而，目前很多國家的法律對基因編輯技術(shù)應(yīng)用于基因治療的監(jiān)管措施依然存在大量空白。

4 結(jié)語與展望

基因編輯技術(shù)的快速發(fā)展極大地提高了我們對真核細(xì)胞基因組進(jìn)行精準(zhǔn)改變的能力。可編輯的核酸酶，尤其是編輯效率更高、操作簡單、成本低的CRISPR/Cas系統(tǒng)，徹底改變了我們對基因組功能的研究；單堿基編輯技術(shù)的出現(xiàn)和不斷改進(jìn)，實(shí)現(xiàn)了單個堿基的精準(zhǔn)轉(zhuǎn)換，降低了脫靶效率。雖然目前基因編輯技術(shù)仍然面臨著脫靶效率和潛在的免疫反應(yīng)等副作用的問題，相信在未來多學(xué)科的交叉融合和科學(xué)家的共同合作下，新一代基因編輯技術(shù)將更加簡便、高效、精確，目前存在的問題也會逐步得到解決[69]。隨著人們對疾病的新的有效靶點(diǎn)的不斷認(rèn)識和新的基因編輯技術(shù)的不斷發(fā)展，基因編輯治療方案的大規(guī)模臨床應(yīng)用將成為可能，特別是對那些傳統(tǒng)療法難以治愈的疾病，可以通過糾正致病基因或引入有益突變來達(dá)到治愈疾病的目的?；蚓庉嫾夹g(shù)的臨床轉(zhuǎn)化和應(yīng)用研究值得拭目以待，這將成為下一代轉(zhuǎn)化療法和治療范例的關(guān)鍵，也將促進(jìn)個體化醫(yī)療的快速發(fā)展。

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(責(zé)任編委: 吳強(qiáng))

Research advance and application in the gene therapy of gene editing technologies

Yunxiao Ren1,2,3, Rudan Xiao1,4, Xiaomin Lou1,2,3,4, Xiangdong Fang1,2,3,4

Gene editing technologies are used to specifically edit the target sequence. With the development of zinc finger nuclease (ZFN), transcription activator-like effector nuclease (TALEN), regular clustering of short palindrome repeats (CRISPR) and single base editing (BE) techniques, gene editing technologies not only provide powerful tools for gene functional studies, but also offer new therapeutic strategies in biomedical research. Gene editing has demonstrated broad application prospects in the gene therapy field, as well as in the construction of animal and cell models, drug target screening and gene functional research. In this review, we summarize several typical gene editing technologies, their characteristics and applications in gene therapy and discusses their opportunities and challenges in gene therapy, thereby providing critical insights and references on the clinical application of gene editing technologies.

gene editing technologies; CRISPR/Cas9; BE; gene therapy

2018-08-16;

2018-10-27

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號：31471115，81670109，81672698)資助 [Supported by the National Natural Science Foundation of China (Nos. 31471115, 81670109, 81672698)]

任云曉，碩士研究生，專業(yè)方向：疾病組學(xué)與轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究。E-mail: renyunxiao16@big.ac.cn

方向東，博士，研究員，研究方向：干細(xì)胞與復(fù)雜疾病臨床組學(xué)與轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)。E-mail: fangxd@big.ac.cn

10.16288/j.yczz.18-142

2018/12/6 10:42:06

URI: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20181206.1041.002.html